Runx2 является ключевым регулятором и маркером остеогенной дифференцировки. Он влияет на экспрессию других проостеогенных генов и является звеном многих сигнальных каскадов, таких как Wnt, Notch, Sox9, Msx2, и сигнальный путь Hedgehog [1]. Регуляторная активность Runx2 по-разному изменяется в отношении разных генов-мишеней в зависимости от стадии дифференцировки, а на стадии минерализации его уровень снижается. Runx2 является важнейшим регулятором дифференцировки остеобластов. Остеобласты – это клетки взрослой кости, которые синтезируют большое количество различных белков, в том числе Runx2, и обладают способностью к внеклеточной минерализации. Однако роль Runx2 на поздних стадиях остеогенной дифференцировки остается слабо изученной.
Чтобы выяснить, какую роль играет Runx2 в дифференцировке остеобластов, были созданы лентивирусные конструкции, несущие 3 различные изоформы гена RUNX2: ген, кодирующий полноразмерный белок дикого типа, кодирующий укороченный вариант белка дикого типа и мутантный вариант гена RUNX2, содержащий стоп-кодон, а так же лентивирусная конструкция, несущая шпилечную РНК к RUNX2, приводящую к подавлению синтеза белка Runx2 при внесении в клетки. Методом лентивирусной трансдукции мы активировали либо подавляли продукцию Runx2 в первичных клетках остеобластов человека.
Биологический эффект лентивирусных конструкций был подтвержден несколькими методами: методом ПЦР в реальном времени было показано, что внесение лентивирусных конструкций приводило к повышению транскрипции RUNX2 для всех трех изоформ в различных типах клеток. Методом иммуноблоттинга было показано, что при использовании созданных лентивирусных конструкций в клетках синтезируется повышенное количество соответствующих изоформ белка Runx2. С помощью исследования активности промотора RUNX2 методом измерения активности люциферазы было показано, что промотор RUNX2 активируется в ответ на внесение конструкций. При внесении шпильки на RUNX2 активность его промотра снижалась.
Влияние повышенной экспрессии RUNX2 на фенотип остеобластов было исследовано методами ПЦР в реальном времени и иммуноцитохимии. Согласно полученным результатам, RUNX2 стимулирует экспрессию остеокальцина, классической мишени RUNX2 и подавляет экспрессии остеомаркера BMP2 в остеобластах, а внесение шпильки на RUNX2 нивелирует этот эффект.
Таким образом, было показано, что активация Runx2 в остеобластах влияет на их синтетические способности.
