В ходе заключительного этапа НИР велись исследования по следующим направлениям: поиск новых амилоидов и потенциальных амилоидогенных белков у различных видов животных, а также проверка амилоидогенных свойств у белков кандидатов, выявленных в ходе предыдущих исследований; изучение механизмов лежащих в основе образования белками биомолекулярных конденсатов, на модели дрожжевого белка Sup35; поиск с помощью дрожжевой модели мутаций в гене Prnp усиливающих (потенциально наследственные мутации) или блокирующих прионную агрегацию белка PrP; разработка метода диагностики ренальных амилоидозов с помощью циклической амплификации амилоидного белка сLC-IgK.

В ходе заключительного этапа при помощи дрожжевой тест-системы был продолжен скрининг плазмидной библиотеки кДНК человека. Была проанализировано 91 тысяча индивидуальных трансформантов и отобрано 45, демонстрирующих рост на селективной среде. Из полученных трансформантов выделена плазмидная ДНК и проведено секвенирование. Полученные данные показали, что встречаются как последовательности, кодирующие полноразмерные белки, так и отдельные участки белков. Всего выявлено 13 потенциальных амилоидогенных белков человека. Для отдельных белков, выявленных в скрининге амилоидные свойства подтверждены in vivo и in vitro.

В ходе проекта была осуществлена проверка амилоидогенных свойств у белков кандидатов, выявленных в ходе предыдущих исследований.
В том числе ранее мы показали, что некоторые специализированные структуры оболочки яйца плодовой мушки Drosophila melanogaster содержат сеть амилоидных фибрилл, которые окрашиваются амилоид-специфичными красителями Конго красным и тиофлавином S. Однако их природа оставалась невыясненной. В ходе заключительного этапа данной работы мы показали, что эта амилоидная сеть образована хорионическим белком s36. Нами установлено, что белок s36 колокализуется в микропиле, дорсальных придатках и столбах. Фибриллы s36, полученные из яиц, демонстрируют амилоидные свойства. При делеции гена CG33223 белок s36 вырабатывается, но не обнаруживается в яичной оболочке. Отсутствие амилоидных фибрилл s36 в яичной оболочке нарушает морфологию эндохориона и блокирует развитие микропиля, дорсальных придатков и столбов, что приводит к стерильности. Полученные нами данные впервые демонстрируют, что амилоидные фибриллы необходимы для модуляции морфогенеза. Мы предполагаем, что прикрепление клеток фолликула к внеклеточным фибриллам s36 запускает сигналы, позволяющие последующие клеточные деления, необходимые для формирования специализированных структур яичной оболочки.

В соответствии с биоинформатическими предсказаниями алгоритма ArchCandy короткие изоформы 5 и 6 белка человека PHC3 обладают высоким амилоидогенным потенциалом. В ходе предыдущих этапов работы предсказания, сделанные при помощи ArchCandy нашли экспериментальное подтверждение in vitro и in vivo. Полноразмерный белок PHC3 входит в состав комплекса PRC1, участвующих в компактизации хроматина, функции его коротких изоформ не известны. Мы продемонстрировали, что короткие изоформы белка PHC3 в амилоидной изоформе могут взаимодействовать с полноразмерным функциональным белком PHC3 в цитоплазме. Исходя из этого мы предположили, что такое взаимодействие может препятствовать попаданию функционального белка в ядро, и таким образом регулировать экспрессию ряда генов. В ходе данного этапа мы проверили предположение о влиянии коротких изоформ на экспрессию некоторых генов. Для этого мы получили клеточные линии человека HEK293T, в которых продуцируется белок PHC3. Для визуализации агрегации PHC3 использовали конструкцию, в которой ген кодирующий данный белок слит с последовательностью GFP (Green Fluorescent Protein). В качестве контроля использовали линию трансфицированную конструкцией, содержащей только ген GFP. Анализ экспрессии проводили при помощи метода NGS-секвенирования. В результате сравнения экспрессии генов мы подтвердили увеличение экспрессии PHC3 находящегося на плазмиде. Кроме PHC3, было выявлено значительное изменение в экспрессии 2427 генов, среди которых 53 гена показали более чем двукратное изменение уровня экспрессии. Чтобы понять, какие процессы могут быть затронуты в клетках с избытком PHC3(5-1)-EGFP, мы провели анализ обогащения генов по аннотации генов (gene ontology) для дифференциально экспрессируемых генов. Мы установили, что в клетках, испытывающих избыток PHC3(5-1), была активирована протеасомная деградация неправильно свернутых агрегатов. Также интересным результатом стало то, что в анализе появились гены, связанные с регуляцией клеточного цикла, сегрегацией сестринских хроматид и ядерным делением, что указывает на то, что эффект агрегирования укороченных изоформ PHC3 может влиять на регуляцию клеточного цикла и деление клеток.

В ходе заключительного этапа проекта, используя дрожжевую модель, мы осуществили поиск мутаций в мышином гене Prnp, влияющих на процесс его агрегации. Был осуществлён масштабный поиск как мутаций усиливающих агрегация белка PrP (потенциально наследственные мутации), так и мутаций, снижающих или блокирующих этот процесс. В литературе на данный момент отсутствуют сведения о мутациях, полностью элиминирующих агрегацию PrP. Полученные данные могут помочь выявить потенциальные варианты наследственных форм прионных заболеваний, получить дополнительные сведения о структуре белка PrP, а также о мутациях, предотвращающих агрегацию PrP, которые могут быть использованы в дальнейшем для создания генетически-модифицированных сельскохозяйственных животных устойчивых к прионным инфекциям. Нами была получена библиотека плазмидных ДНК, содержащих мутантные варианты мышиного гена Prnp, слитые с репортерной последовательностью SUP35N. Качество библиотеки было проверено при помощи выборочного секвенирования 50 плазмидных ДНК. Более 95% плазмидных ДНК несли ген Prnp, содержащий хотя бы одну мутацию.
При помощи дрожжевой тест-системы для фенотипической оценки амилоидного состояния белка PrP было проанализировано более 20 тысяч независимых последовательностей мышиного гена Prnp, среди которых отобрано 400 трансформантов с изменениями фенотипа. По результатам анализа секвенированных последовательностей Prnp выявлено: 31 одиночная мутация, снижающая или блокирующая агрегацию белка PrP в дрожжевой модели, 11 одиночных мутаций, повышающих эффективность агрегации PrP в дрожжевой модели, 26 двойных мутаций, снижающих или блокирующих агрегацию белка PrP в дрожжевой модели, 15 двойных мутаций, повышающих агрегацию белка PrP в дрожжевой модели. Определен участок с 155 по 176 а.к., мутации в котором снижают или блокируют агрегацию. Выявлены ранее не описанные мутации, усиливающие прионизацию PrP. Данные мутации являются фактором риска развития наследственных форм прионных заболеваний у мыши и потенциально у человека. Впервые выявлены мутации в PrP, которые ослабляют или элиминируют прионную агрегацию белка PrP.

В ходе заключительного этапа также показано, что белок PrP не может служить конформационной матрицей для агрегации обогащённых аспарагином и глутамином прионогенных белков. Кроме того, в работе была проверена гипотеза о том, что белок PrP является универсальным акцептором амилоидов. Полученные нами данные не подтвердили предположение, высказанное в ряде работ о том, что PrP является универсальным акцептором амилоидогенных белков способствуя их агрегации.

В ходе проекта были исследованы механизмы образования биоконденсатов белком Sup35 при гиперосмотическом шоке и снижении цитоплазматического pH. Установлено, что на логарифмической и стационарной стадиях роста дрожжевой культуры снижение цитоплазматического pH не приводит к увеличению доли клеток с биоконденсатами. Сделано предположение, что образование биоконденсатов Sup35NM регулируется не снижением цитоплазматического рН, а наличием глюкозы в среде или увеличением колличества продукции белка. В ходе заключительного этапа работы мы исследовали разницу в количестве белка Sup35NM-yTag-RFP-T на логарифмической стадии роста и после 24 часов культивирования. Мы установили, что количество Sup35NM-yTag-RFP-T после 5 часов культивирования достоверно ниже количества Sup35NM-yTag-RFP-T после 24 часов культивирования. Полученные данные коррелируют и могут являться причиной увеличения доли клеток с конденсатами после 24 часах роста культуры без стрессовых воздействий. Концентрация белка является одним из ключевых факторов фазовой сепарации. В том числе было показано, что концентрация влияет на фазовую сепарация Sup35NM. Белок Sup35NM не конденсируется при гиперосмотическом шоке при уровне продукции, близком к физиологическому, но при этом формировал биоконденсаты при двухсоткратной сверхпродукции без стрессовых воздействий. В данной работе, используя умеренную продукцию Sup35MM, мы показали, что количество биоконденсатов Sup35NM без стрессовых воздействий возрастает с 1,34% на логарифмической стадии до 5,90% на 24 часах роста культуры, а количество целевого белка без стрессовых воздействий возрастает в 4 раза. Таким образом, мы наблюдали корреляцию между количеством белка и долей клеток с конденсатами. Эта корреляция, однако, не может объяснить резкое увеличение образования биоконденсатов при стрессовых воздействиях (инкубации в буферах рН 5,0, рН 7,0, гиперосмотическом шоке). Возможно, резкое увеличение образования биоконденсатов можно объяснить повышением локальной концентрации белка в клетке вследствие уменьшения объема клетки при гиперосмотическом шоке.

В ходе этапа собрана аннотированная коллекция образцов мочи от 52 пациентов с нефропатиями различной этиологии. Для каждого образца была получена сопутствующая информация: для каждого образца была получена сопутствующая информация: предварительный диагноз о типе нефропатии, концентрация белка в моче, пол, раса, наличие данных по биопсии почечной ткани, возраст, вес, рост, индекс массы тела, скорость клубочковой фильтрации, суточная потеря белка, наличие у пациента артериальной гипертензии, сахарного диабета и сердечно-сосудистых заболеваний.

В ходе проекта впервые была продемонстрирована способность к конгофиилии мочи собранной у пациантов с различными типами ренальных амилоидозов, а также с различными нефропатиями не амилоидного типа. Мы показали, способность к конгофиилии мочи у пациентов с различными типами ренальных амилоидозов, а также с различными нефропатиями не амилоидного типа. Используя метод протемного анализа амилоидов в сочетании с масс-спектрометрию, мы выявили несколько кандидатов в амилоиды, агрегация которых может быть связана с конгофилией. Основным кандидатом из этих белов является сLC-IgK (легкая константная цепь иммуноглобулина каппа). Для константного домена данного белка ранее в литературе описана способность к амилоидной агрегации. В этой связи мы предположили, что присутствие агрегатов сLC-IgK в моче можно использовать для диагностики ренальных амилоидозов различных типов. Поскольку в моче может присутствовать как агрегированная, так и мономерная форма белка сLC-IgK, то обычные подходы такие как вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ затруднены. В этой связи для детекции амилоидной формы белка сLC-IgK мы решили адаптировать метод циклической амплификации амилоидов (PMCA). Метод PMCA позволяет детектировать наличие агрегированных форм белка в образце, даже если они находятся там, в исчезающе малой концентрации.
Предлагаемый метод PMCA состоит из 3-х этапов:
1) выделение суммарного белка;
2) амплификация амилоидных фибрилл рекомбинантного белка сLC-IgK (включает в себя циклические раунды: - рост амилоидных фибрилл (за счёт полученного нами на этапе 1 рекомбинантного белка сLC-IgK) – разбивка крупных амилоидных фибрилл на фрагменты с помощью ультазвука);
3) детекция амилоидных фибрилл, окрашенных амилоид-специфичным красителем Тиофлавином Т (ThT) методом флуорометрии.
На заключительном этапе работы мы использовали полученный нами рекомбинантный белок сLC-IgK для разработки метода PMCA для детекции агрегатов белка в моче. Мы предположили, что инкубация мономеров сLC-IgK с агрегированной формой этого белка из мочи и многократное повторение циклов фрагментации-инкубации приведет к увеличению количества агрегатов, что позволит их детектировать по изменению флуоресценции тиофлавина Т. Необходимо было подобрать условия, при которых скорость самоагрегации белка оставалась низкой, при этом агрегация ускорялась при добавлении специфичных компонентов из образцов мочи пациентов с AL-амилоидозом. Анализ образцов с различными диагнозами, включая AL-амилоидоз, фокально-сегментарный гломерулосклероз, мембранозную нефропатию и множественную миелому, где присутствие сLC-IgK показал, что во всех случаях наблюдался рост флуоресценции Тиофлавина-T при наличии белка из мочи. При этом интенсивность сигнала коррелировала не с типом патологии, а с количеством белка в образце. Мы предположили, что это может быть связано с неспецифическим влиянием альбумина, основного белка в моче.
Для проверки этой гипотезы мы инкубировали бычий альбумин и провели эксперименты с добавлением альбумина в раствор сLC-IgK, что подтвердило его неспецифическое влияние на рост флуоресценции ThT. Мы также исследовали, способны ли полученные in vitro агрегаты сLC-IgK ускорять агрегацию мономеров. Полученные нами данные показали, что добавление агрегатов сLC-IgK не привели к ускорению агрегации мономерного белка. Эти результаты указывают на отсутствие соответствия между динамикой флуоресценции ThT и свойствами амилоидов по ускорению агрегации мономеров и формированию фибрилл.
Полученные нами результаты подчеркивают необходимость дальнейших исследований для более глубокого понимания механизмов агрегации и их связи с диагнозами, а также для уточнения роли различных компонентов, присутствующих в моче.

Таким образом, в ходе заключительного этапа выполнения научно-исследовательской работы поставленные задачи решены в полном объеме.