Белки представляют не только основные молекулы в живых организмах, но также достаточно широко используются в промышленности, и не только в пищевой. Относительно высокая поверхностная активность белков позволяет их применять для стабилизации эмульсий и пен. Прежде всего, для этих целей в промышленности используются белки животного происхождения, но их относительно высокая стоимость и вред, наносимый окружающей среде при производстве, ограничивают их использование. Более дешевыми и менее экологически вредными оказываются растительные белки. Поэтому задача замены животных белков на растительные белки, где это возможно, представляет одну из основных задач устойчивого развития. Однако задача не простая, поскольку функциональные свойства растительных белков заметно хуже, в частности, их поверхностная активность значительно меньше. Наиболее важно, что белки растительного происхождения, как правило, плохо растворимы в воде, и их растворимость увеличивается только при очень малых или очень больших значениях рН. По этой причине о поверхностных свойствах растворов растительных белков известно значительно меньше, и они стали относительно интенсивно изучаться только в последние годы, когда возникла задача модификации растительных белков для улучшения их функциональных свойств. Модифицировать белки можно различными способами. Например, можно создать комплексы белков с поверхностно-активными веществами или полиэлектролитами. Однако наиболее естественным способом, рассматриваемом в данном проекте, представляется формирования нано- и микроагрегатов белков. Водные дисперсии таких агрегатов устойчивы, и, таким образом, проблема растворимости снимается в этом случае.
То, что белки образуют агрегаты в водных растворах известно достаточно давно, но исследовался в основном только один класс агрегатов, а именно, амилоидные фибриллы, причем только в работах по медицине. Это связано с возникновением амилоидов в человеческом организме при тяжелых нейродегенеративных заболеваниях. Уже в двадцатом веке было показано, что эти образования состоят из белковых нитей наноразмеров и ими занимались в основном медики. Однако в последние годы было обнаружено, что амилоидные фибриллы в большинстве случаев совсем нетоксичны, и могут быть использованы для решения разнообразных практических задач. Их использование в значительной степени сдерживается скудной информацией о поверхностных свойствах их дисперсий. Поэтому основные результаты, полученные в первый год выполнения проекта, относятся, прежде всего, к определению механизма формирования адсорбционного слоя фибриллярных агрегатов на водной поверхности, структуры этого слоя и его равновесных и неравновесных свойств, в частности, дилатационной динамической поверхностной упругости, определяющей устойчивость жидкофазных дисперсных систем.
Отметим, что поверхностные свойства растворов растительных белков начали изучаться только в последние годы. В большинстве работ авторы ограничиваются только измерением поверхностного натяжения. Поэтому на первом этапе выполнения данного проекта было проведено подробное исследование поверхностных свойств растворов нескольких растительных белков с помощью методов поверхностной тензиометрии, дилатационной поверхностной реологии, эллипсометрии, электронной микроскопии, микроскопии атомных сил и микроскопии при угле Брюстера. Затем для некоторых из этих белков были синтезированы амилоидные фибриллы, и свойства их водных дисперсий сравнивались со свойствами растворов нативных белков. Кроме того, были проведены исследования адсорбционных и нанесенных слоев рекомбинантных белков, прежде всего, вицилина, полученных микробиологическим методом и отличающихся от обычно используемых изолятов растительных белков более высокой степенью чистоты.
Для анализа исследуемых изолятов использовался электрофорез в полиакриамидном геле. Результаты показали, что наряду с основным компонентом изоляты имеют примеси субъединиц другой молекулярной массы. При нагревании растворов этих белков в течение определенного времени, зависящем от структуры белка, и при рН, близком к 2, в растворе образуются амилоидные фибриллы, формы которых для исследуемых белков могут сильно различаться.
Кинетические зависимости поверхностного натяжения и динамической поверхностной упругости для растворов глобулина фасоли всегда монотонны и при приближении к равновесию поверхностная упругость достигает примерно 48 мН/м. Если представить эти результаты в виде зависимости упругости от давления, то все данные ложатся на одну кривую за исключением самой высокой концентрации. Качественно такие же результаты получаются для растворов глобулина овса и глобулина бобов мунг. Некоторые различия возникают только в скорости адсорбции и стационарных значениях поверхностных свойств. Для растворов глобулина нута кинетические зависимости поверхностной упругости, в отличие от других исследованных растительных белков, оказываются немонотонными. Эта особенность кинетической кривой может быть связана с образованием неустойчивых поверхностных агрегатов или с наличием гибких белковых цепей, приводящих к образованию петель и хвостов в дальней области поверхностного слоя. Последняя ситуация представляется более вероятной, но более точное выяснение причин появления локальных экстремумов на кинетической зависимости динамической поверхностной упругости требует еще дополнительно исследования.
При переходе к водным дисперсиям амилоидных фибрилл динамическая поверхностная упругость для большинства систем заметно увеличивается. При этом для фибрилл глобулина фасоли оказывается, что изменения поверхностных свойств дисперсии длинных фибрилл с длиной контура больше 1 мкм происходят много быстрее, чем в случае раствора маленьких глобул белка. Было показано, что этот эффект связан с сильным влиянием низкомолекулярных пептидов, образующихся при получении фибрилл. Очистка дисперсии центрифугированием и последующим растворением осадка, действительно, приводит к резкому уменьшению скорости изменения поверхностных свойств дисперсии фибрилл. Однако независимо от степени очистки стационарная поверхностная упругость оказывается выше поверхностной упругости раствора нативного белка, примерно на 7 мН/м. Обнаруженное различие между поверхностными свойствами растворов нативного белка и дисперсиями фибрилл при одинаковых весовых концентрация белка еще усиливается для систем, содержащих глобулин овса или глобулин бобов нут, и может достигать 30 мН/м. Важно отметить, что зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления также заметно различаются для растворов нативного белка и для дисперсий фибрилл. Эти результаты указывают на различия в структуре адсорбционного слоя в исследованных системах. Можно предположить, что при адсорбции фибрилл в поверхностном слое образуется сетка нитевидных агрегатов. Эту сетку удается обнаружить методом атомно-силовой микроскопии после переноса адсорбционного слоя с водной поверхности на поверхность слюды методом Ленгмюра-Шеффера. При этом на АСМ-изображениях возникают отдельные лентообразные агрегаты на фоне более бледной сетки фибрилл глобулина овса.
Возникает вопрос, всегда ли динамическая поверхностная упругость водной дисперсии фибрилл превосходит эту величину для растворов соответствующего нативного белка? Для выяснения этого вопроса было проведено исследование для водных дисперсий вьющихся коротких фибрилл овальбумина (ОВА). Полученные результаты позволили установить связь между формой фибрилл и динамическими поверхностными свойствами их дисперсий. Оказалось, что динамическая поверхностная упругость дисперсий ОВА ниже, чем в случае растворов нативных белков, в отличие от результатов для дисперсий длинных и более жестких фибрилл других белков. Короткие вьющиеся фибриллы ОВА образуют на поверхности воды непрерывный рыхлый адсорбционный слой, состоящий как из скоплений фибрилл разного размера, так и из отдельных фибрилл. В этом случае примеси полипептидов, образующиеся в результате гидролиза белка при синтезе фибрилл, не могут быть полностью удалены путем только однократной очистки дисперсии фибрилл. Кроме того, центрифугирование и последующее редиспергирование приводят к разрушению крупных фибрилл ОВА с высокой персистентной длиной и длиной контура, первоначально возникающих в процессе синтеза. После двукратной очистки на кинетических зависимостях поверхностных свойств появляется значительный индукционный период, после которого свойства меняются медленнее, чем в случае дисперсии однократно очищенных фибрилл и растворов нативного белка вследствие увеличения среднего размера кинетических единиц в системе. Таким образом была обнаружена система с поверхностными свойствами, отличными от свойств дисперсий фибрилл большинства белков.
В ходе выполнения проекта было также обнаружено, что для растворов белков с прочными дисульфидными мостиками между различными аминокислотными остатками удается получить высокую динамическую поверхностную упругость, вплоть до 250 мН/м, если в раствор добавляется восстанавливающий агент (дитиотрейтол) и одновременно температура раствора повышается до ~ 900 . В этом случае внутримолекулярные дисульфидные связи у адсорбированных молекул сначала разрушаются, а затем при понижении температуры снова возникают, но уже между разными молекулами, приводя к образованию жесткой адсорбционной пленки на межфазной границе.
Особый интерес представляют результаты для рекомбинантных белков, полученных микробиологическим способом и очищенных с помощью аффинной хроматографии: вицилина, основного запасного белка гороха, и двух его доменов купин-1.1 и купин-1.2. В отличие от изолятов белков рекомбинантным белкам на электрофореграмме соответствует строго одна полоса. Кинетические зависимости поверхностного давления для разных концентраций вицилина имеют различную форму. Однако если ввести нормализованное время τ, где используемый коэффициент α зависит от концентрации, то все кривые сливаются в одну обобщающую кривую, «master curve» по терминологии, используемой в англоязычной литературе. Этот подход был предложен несколько лет назад группой авторов из Института Шарля Садрона в Страсбурге. Для произвольного механизма адсорбции он не имеет строгого обоснования и должен рассматриваться как эмпирический. Для начальных стадий адсорбции при диффузионном механизме адсорбции коэффициент α дается квадратичной зависимостью от концентрации. Если есть значительный адсорбционный барьер, то возникает линейная зависимость от концентрации. Однако в общем случае могут быть более сложные зависимости. Важно отметить, что обобщающая кривая представляет индивидуальную характеристику белка и для различных белков различна. К настоящему времени, кроме вицилина и купинов такие кривые были получены для глиадина, белка подсолнечника, белков сои, риса, бобов манг, и комплексов белка люпина с пектином. При малых поверхностных давлениях все зависимости похожи и наблюдается квадратичная зависимость фактора сдвига α от концентрации, указывая на диффузионнно-контролируемую адсорбцию, но при высоких поверхностных давлениях возникают значительные различия. В частности, есть различия между вицилином, купин-1.1 и купин- 1.2, что указывает на различия в механизме адсорбции и в межмолекулярных взаимодействиях в поверхностном слое.
Еще одна master curve возникает, если поверхностную упругость откладывать как функцию поверхностного давления. Для для растворов большинства белков в этом случае получается монотонная зависимость, но для рекомбинантных белков и белка нута эта зависимость имеет локальный максимум и последующий локальный минимум. Максимальные и минимальные значения упругости, поверхностное давление, соответствующее экстремумам, различаются для различных белков, и связаны с особенностями структуры адсорбционного слоя, но общую форму зависимости удается объяснить с помощью теории поверхностной вязкоупругости для водных систем, содержащих линейные гибкоцепные макромолекулы. Тем самым, экстремумы возникают, если в системе имеются более или менее свободные амфифильные макроцепи, частично переходящие в дальнюю область поверхностного слоя.
Таким образом, динамическая поверхностная упругость для дисперсий нано- и микроагрегатов белков, прежде всего амилоидных фибрилл, выше чем для растворов нативных белков. Это означает, что фибриллы белков должны быть эффективными стабилизаторами пен и эмульсий, и, следовательно, найдут применение в пищевой, фармацевтической и косметической отраслях промышленности. Кроме того, исследования водных систем, содержащих растительные белки, в первый год выполнения проекта позволили найти ряд интересных особенностей этих систем. Вопрос о возможной экстраполяции некоторых из этих результатов на системы, содержащие животные белки, в настоящее время пока остается открытым.
Важным результатом первого года выполнение проекта представляется создание многослойных пленок липидов и фибрилл глобулярных белков, как растительного, так и животного происхождения на водной поверхности. На первом этапе исследований определялось взаимодействие фибрилл бета-лактоглобулина (БЛГ) и липида, дипальмитоилфосфатидил глицерина (ДПФГ), в поверхностном слое. Эти результаты позволяют получить дополнительную информацию о процессах в клеточных мембранах, а с другой стороны, могут приводить к созданию биосовместимых материалов. Структура поверхностного слоя и способность макромолекул проникать в монослой липида зависят от электростатических взаимодействий между компонентами, поверхностной активности макромолекул и упаковки молекул в монослое липида. Заряженный монослой липида на межфазной границе уменьшает адсорбционный барьер для противоположно заряженных макромолекул и их агрегатов, приводя к увеличению скорости адсорбции и увеличению поверхностной концентрации агрегатов (фибрилл). Отметим, что взаимодействия между молекулами липида и фибриллами у поверхности клеток приводит к росту локальной концентрации агрегатов в этой области. С другой стороны, образование относительно толстых полислоев на межфазной границе может быть использовано с целью стабилизации пен и эмульсий. Дилатационная поверхностная упругость водных дисперсий фибрилл БЛГ оказалась выше соответствующих значений для растворов нативного БЛГ. Полученные результаты свидетельствуют о сильном влиянии монослоя липида на адсорбцию противоположно заряженных молекул белка и фибриллярных агрегатов. Даже в случае молекул хлорида полидиаллилдиметиламмония, не обладающих поверхностной активностью, их адсорбция резко увеличивается, если на поверхности присутствует противоположно заряженный монослой липида. В то же время взаимодействие амфифильных глобул БЛГ с монослоем липида не может быть сведено только к электростатическому взаимодействию. Проникновение молекул БЛГ в монослой липида возможно только когда поверхностное давление меньше, чем давление самопроизвольно адсорбированных молекул белка на водной поверхности. При этом взаимодействие между молекулами белка и липида может приводить к изменению третичной структуры белка. Если молекулы БЛГ и фибриллы БЛГ противоположно заряжены по отношению к монослою липида на поверхности раствора белка или дисперсии фибрилл, адсорбционный барьер сильно уменьшается, и скорость адсорбции молекул белка или их фибрилл резко увеличивается. Одновременно поверхностная концентрация фибрилл и толщина адсорбционного слоя сильно увеличиваются при приближении к равновесию. Этот эффект позволяет объяснить, например, рост концентрации фибрилл у поверхности клеточных мембран.
Подобные эффекты были обнаружены также в случае адсорбции фибрилл растительного белка на водной поверхности с монослоем липида. В этом случае образование толстого и плотного слоя фибрилл у межфазной границы также может быть использовано для эффективной стабилизации жидкофазных дисперсных систем. Так, например, смешанный слой молекул липида и фибрилл может обеспечить значительный стерический барьер для коалесценции капель и пузырьков. Это означает, что. комплексы липидов и фибрилл растительных белков могут заменить соответствующие композиции, содержащие животные белки, в пищевой, фармацевтической и косметической отраслях промышленности.
Параллельно с исследованиями белковых систем в рамках проекта изучались научные основы направленного синтеза функциональных неорганических наноматериалов с контролируемой морфологией и свойствами.
Для гидроксиапатита (ГАП) установлено, что состав реакционной среды определяет механизм роста частиц по пути ориентированного присоединения. С помощью квантово-химического моделирования показано, что ионы экранируют специфичные кристаллографические грани, направляя рост в различных направлениях, что предопределяет термическую стабильность и фазовый состав керамики после спекания.
На примере оксида цинка (ZnO) продемонстрирована возможность управления долей кристаллографических граней в конечном продукте путем изменения состава реакционной среды и введения ионов-регуляторов, что напрямую влияет на его фотокаталитическую эффективность в разложении красителей различной химической природы.
Для диоксида олова (SnO₂), допированного никелем (Ni-SnO₂), показано, что гидротермальная обработка первичных сферических наночастиц приводит к их анизотропному росту в наностержни. Рост инициируется вдоль оси c, а затем продолжается вдоль оси a. Расчеты методом DFT выявили перераспределение положения допанта (Ni) в решетке из конфигурации ХОZ в более стабильную ОХ в процессе синтеза.
Композитные мембраны на основе полисульфона, модифицированные наностержнями ГАП с различными размерами и соотношением осей, установлено, что более крупные частицы увеличивают шероховатость поверхности, что коррелирует с улучшением транспортных свойств.
Многофункциональные сорбенты-фотокатализаторы на основе слоистых двойных гидроксидов (СДГ), допированных ионами хрома и меди, показали способность к одновременной сорбции катионов токсичных металлов и фотокаталитическому разложению красителей под видимым светом. Наибольшую эффективность в совместном удалении загрязнителей продемонстрировал образец CrMgAl, также демонстрирующий активность в реальной природной воде.
Фотокатализаторы на основе наностержней Ni-SnO₂ проявили высокую активность в видимой области спектра. Оптимальный образец продемонстрировал 94% деградации метиленового синего за 60 минут и сохранил эффективность (82-89% для различных красителей) в многокомпонентной смеси в реальной речной воде.
На основании всего вышеизложенного:
Комбинация экспериментальных методов с квантово-химическим моделированием позволила выявить фундаментальные зависимости между условиями синтеза, морфологией наночастиц и их функциональными характеристиками.
Для СДГ установлено, что замещение трехзарядных катионов алюминия является более эффективной стратегией улучшения многофункциональных свойств, чем замещение двухзарядных ионов магния.
Для Ni-SnO₂ показано, что фотокаталитическая активность коррелирует со способностью образца формировать активированный поверхностный комплекс с молекулами красителя, что подтверждено расчетами энергии взаимодействия. Доминирующей активной формой кислорода являются супероксид-радикалы (•O₂⁻), что делает данные образцы перспективными для удалегия бактерий.
Разработанный подход позволяет перейти от эмпирического подбора параметров синтеза к целенаправленному конструированию наночастиц с заданными свойствами для конкретных применений.
Таким образом, материаловедческое направление проекта не только привело к созданию конкретных функциональных материалов с рекордными характеристиками, но и сформировало методологический базис для дальнейшего получения композитных материалов.