Одним из ключевых процессов развития фиброза легких является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). ЭМП – это процесс в результате, которого альвеолоциты II типа теряют свое прикрепление к базальной мембране и полярность, приобретают подвижность, перемещаются в интенстиций и становятся продуцирующими белки внеклеточного матрикса миофибробластами. В исследованиях было показано, что основным цитокином, запускающим и регулирующим процессы ЭМП, является трансформирующий фактор роста бета (TGF-β). Воздействие на ткань легкого такого профибротического агента, как блеомицин стимулирует синтез провоспалительных цитокинов и TGF-β. Стимулирование синтеза TGF-β в легочной ткани происходит в различных типах клеток легких, в том числе и в альвеолоцитах II типа. Целью нашего исследования было на клеточной линии альвеолоцитов крысы (L2) оценить влияние блеомицина на уровни мРНК экспрессии TGF-β, эпителиального маркера Е-кадгерина и мезенхимальных маркеров гладкомышечного актина альфа (α-SMA) и проколлагена III.
Клеточную культуру L2 выращивали до 60-70% конфлюентности в четырех культуральных флаконах. Далее в два из четырех флаконов в культуральную среду добавляли блеомицин до конечной концентрации 20 мкг/мл (начало эксперимента). Через 24 часа и через 48 часов от начала эксперимента клетки линии L2 собирали из одного флакона с блеомицином и из одного контрольного флакона. Тотальная мРНК была выделена из собранных L2 клеток, была выполнена обратная транскрипция и получена кДНК, на основании кДНК была выполнена серия количественных полимеразных цепных реакций (кПЦР) со специфическими праймерами к TGF-β, к Е-кадгерину, к α-SMA и к проколлагену III. В качестве референсного гена был взят бета-актин. Всего для каждого маркера было выполнено по 6 кПЦР.
В результате проведенного исследования было выявлено статистически значимое увеличение уровней мРНК TGF-β в клетках L2 как при воздействии на них блеомицина в течение 24 (p<0,05) и 48 (p<0,05) часов, так и при увеличении времени выращивания клеток с 24 часов до 48 часов (p<0,05). Оценка изменения транскрипционных уровней Е-кадгерина под воздействием блеомицина показала, что добавление в культуральную среду блеомицина стимулирует мРНК экспрессию этого маркера, как при воздействии блеомицина в течение 24 часов (p<0,01), так и в течение 48 часов (p<0,01) по сравнению с контрольными флаконами. Более того, увеличение продолжительности воздействия блеомицина на клетки L2 с 24 до 48 часов увеличило транскрипционный уровень Е-кадгерина (p<0,05). Оценка уровней мРНК экспрессии α-SMA показала, что только воздействие блеомицина в течение 48 часов вызывало относительное увеличение этого показателя (p<0,05). Время культивирования клеток L2 и воздействие на них блеомицина достоверно не повлияли на транскрипционые уровни прокаллагена III.
Таким образом, проведенное исследование позволило показать способность клеток L2 к увеличению уровней мРНК экспрессии ключевого для развития фиброза легких цитокина TGF-β под воздействием блеомицина и влияние блеомицина на транскрипционные уровни эпителиальных и мезенхимальных маркеров в этой клеточной линии. Полученные результаты делают перспективным проведение дальнейших исследований с увеличением времени культивирования клеток L2 в культуральной среде, содержащей блеомицин, аналогичные исследования на других клеточных линиях альвеолоцитов, исследования с оценкой уровней белков основных эпителиальных и мезенхимальных маркеров и исследования с расширенным спектром исследуемых цитокинов и маркеров.
