Актуальность поставленных в рамках проекта задач и методы их решения
Этот проект является продолжением и развитием проекта «Enhanced sampling methods applied to the rational design of antitumor peptides», поддержанного DAAD и Санкт-Петербургским государственным университетом в 2019 году. Его целью является создание противоопухолевых пептидов, которые бы избирательно убивали опухолевые клетки и при этом не проявляли бы цитотоксической активности по отношению к нормальным. Для решения этой задачи мы выбрали вариант стратегии направленной доставки лекарств к клеткам-мишеням: пептиды, обладающие высокой аффинностью к рецепторам опухолевых клеток, сшиваются с цитотоксическими молекулами ("боеголовками") посредством линкера, разрезаемого ферментами на поверхности или внутри клетки-мишени. Такой подход позволяет использовать более цитотоксичные «боеголовки» для увеличения эффективности препарата без риска повышения его токсичности для организма в целом. Эта стратегия успешно развивается в настоящее время, и несколько созданных в ее рамках лекарств уже одобрены FDA или вошли в клинические исследования (Angiopep-2paclitaxel conjugate, Angiochem Inc.; LHRH-receptor-targeted cytolytic peptide, EP-100; NCT02828774 и др.).
Одна из сложностей создания биологически активных конъюгатов пептидных лигандов с цитотоксическими молекулами заключается в том, что прямое объединение нескольких фрагментов с известными свойствами и структурой не гарантирует получения активного бифункционального соединения. Особенно это относится к конъюгатам, у которых в роли "боеголовки" выступает пептид. Так, одна часть химерного пептида может дестабилизировать другую, и тогда весь пептид потеряет вторичную структуру. Или же наоборот, химерная последовательность может принять стабильную конформацию, не характерную для ее отдельных частей. В обоих случаях пептид утратит способность связываться с рецептором и покажет в экспериментах отсутствие активности. Таким образом, разработка биологически активных конъюгатов, их синтез и постановка экспериментов зачастую требуют дополнительных средств и, главное, времени.
Отличительной чертой данного проекта является использование молекулярной динамики в совокупности с методами эффективного сэмплирования конформационного пространства биомолекул для оптимизации последовательности предложенных конъюгатов, все части которых представлены пептидами. С использованием данного подхода предполагается, во-первых, оценивать стабильность химерных пептидов и фрагментов в их составе и таким образом предсказывать, не дестабилизирует ли один из фрагментов другой, а, во-вторых, определять, как влияет добавление "боеголовки" и линкера на способность лиганда связываться с клеточным рецептором (изменение селективности лигандов, стабильности лиганд-рецепторных комплексов, путей и кинетики их образования и распада). Стандартная молекулярная динамика способна дать ответы на эти вопросы, но так как ландшафты свободной энергии конформационных изменений пептидов в растворе и образования/распада лиганд-рецепторных комплексов очень сложны (представлены множеством высоких энергетических барьеров и метастабильных состояний между ними), получение результатов методом стандартной молекулярной динамики может занять очень много времени, и это делает задачу практически нерешаемой. Использование методов эффективного сэмплирования конформационного пространства позволяет существенно сократить время расчета, чем и обусловлена целесообразность их применения.
Научный заделМы предложили последовательности химерных пептидов, составленные из 1) лиганда кинтегрину αVβ6, одному из опухолевых маркеров, 2) линкера, содержащего субстрат фермента лизосом катепсина B и 3) антимикробного пептида протегрина, играющего роль "боеголовки".
Задел по протегрину.Протегрин был открыт в 1993 году в Институте экспериментальной медицины, в Отделе общей патологии и патологической физиологии, с которым я веду активное сотрудничество. Наряду с антимикробной активностью протегрина в отделе исследовались его противоопухолевые свойства. Было показано, что протегрин активен в отношении антибиотикоустойчивых опухолевых клеток (в частности, доксорубицин-устойчивых), но обладает низкой селективностью и токсичен для нормальных клеток. В связи с этим протегрин как таковой в терапии опухолей неприменим. В то же время создание системы направленной доставки протегрина к опухолевым клеткам откроет пути разработки лекарственных препаратов на его основе. Сейчас в Институте экспериментальной медицины синтезируются и проверяются в клеточных экспериментах химерные пептиды, состоящие из протегрина и пептидного фрагмента, взаимодействующего с тем или иным опухолевым рецептором.
Задел по лигандам к интегрину αVβ6.В первой части проекта, работа над которой была начата в 2019 году в Институте исследования полимеров в Майнце, в качестве лигандов были взяты два пептида, обладающие высокой селективностью по отношению к интегрину αVβ6: фрагмент предшественника TGFβ3, природного лиганда интегрина αVβ6, (первичная последовательность HGRGDLGRLKK-NH2) и пептид из вируса ящура (первичная последовательность NAVPNLRGDLQVLAQKVART). Для первого из них мы с использованием parallel biased metadynamics, одного из методов эффективного сэмплирования конформационного пространства, рассчитали ландшафт свободной энергии конформационных переходов в растворе и затем, с помощью алгоритма уменьшения размерности конформационного пространства sketch-map, идентифицировали метастабильные состояния. Результаты будут представлены на конференции "Free Energy Workshop 2020" 11-13 марта в Мюнстере и опубликованы в статье, над рукописью которой мы сейчас работаем. Для второго пептида мы на основе траекторий молекулярной динамики оценили параметры ЯМР (химические сдвиги 15N, 1HN, 1HA, времена релаксации 15N T1 и T2, значения 15N{1H}гетероядерных NOE) и получили более или менее хорошее согласие с имеющимися в литературе экспериментальными данными. Мы продолжаем расчеты свободной энергии и ЯМР параметров этого пептида в растворе, чтобы определить его метастабильные конформации и охарактеризовать продолжительность их жизни и динамику. Так как выбранные методы хорошо проявили себя в моделировании отдельных лигандов, мы в ближайшее время планируем применить их для расчета в растворе метастабильных конформаций и динамики предложенных химерных пептидов.
Выбор принимающей организацииИнститут полимеров им. Макса Планка входит в число ведущих мировых научных центров в области изучения полимеров. В Отделе теории полимеров под руководством профессора Курта Кремера значительное число направлений исследований посвящено биополимерам. Д-р Омар Валссон, в научной группе которого планируется стажировка, занимается разработкой методов эффективного сэмплирования конформационного пространства молекул. Он продуктивно сотрудничает с М. Паринелло, создателем одного из этих методов - метадинамики, является автором вариационного подхода для повышения эффективности сэмплирования конформационного пространства (variationally enhanced sampling). Первый этап совместной работы с ним оказался очень продуктивным. Я получила ценный опыт использования методов эффективного сэмплирования конформационного пространства для моделирования белковых молекул в растворе. Этот опыт я сейчас применяю для работы над этим и другими проектами. Однако моделирование образования и распада белковых комплексов в совокупности с расчетом равновесных и кинетических констант связывания имеет свою специфику. У д-ра Омара Валссона есть большой опыт в проведении таких расчетов. Продолжение стажировки в его группе позволило бы перенять его опыт и начать использовать методы эффективного сэмплирования конформационного пространства для моделирования образования и распада белковых комплексов.
Предполагаемые результаты
Предполагается изучить, как методы эффективного сэмплирования конформационного пространства биомолекул используются в моделировании белок-белковых взаимодействий, и применить эти методы к белковым комплексам, образованным интегрином αVβ6 и его лигандами.