Description

Актуальность поставленных в рамках проекта задач и методы их решения
 Этот проект является продолжением и развитием проекта «Enhanced sampling methods applied to the rational design of antitumor peptides», поддержанного DAAD и Санкт-Петербургским государственным университетом в 2019 году. Его целью является создание противоопухолевых пептидов, которые бы избирательно убивали опухолевые клетки и при этом не проявляли бы цитотоксической активности по отношению к нормальным. Для решения этой задачи мы выбрали вариант стратегии направленной доставки лекарств к клеткам-мишеням: пептиды, обладающие высокой аффинностью к рецепторам опухолевых клеток, сшиваются с цитотоксическими молекулами ("боеголовками") посредством линкера, разрезаемого ферментами на поверхности или внутри клетки-мишени. Такой подход позволяет использовать более цитотоксичные «боеголовки» для увеличения эффективности препарата без риска повышения его токсичности для организма в целом. Эта стратегия успешно развивается в настоящее время, и несколько созданных в ее рамках лекарств уже одобрены FDA или вошли в клинические исследования (Angiopep-2paclitaxel conjugate, Angiochem Inc.; LHRH-receptor-targeted cytolytic peptide, EP-100; NCT02828774 и др.).
Одна из сложностей создания биологически активных конъюгатов пептидных лигандов с цитотоксическими молекулами заключается в том, что прямое объединение нескольких фрагментов с известными свойствами и структурой не гарантирует получения активного бифункционального соединения. Особенно это относится к конъюгатам, у которых в роли "боеголовки" выступает пептид. Так, одна часть химерного пептида может дестабилизировать другую, и тогда весь пептид потеряет вторичную структуру. Или же наоборот, химерная последовательность может принять стабильную конформацию, не характерную для ее отдельных частей. В обоих случаях пептид утратит способность связываться с рецептором и покажет в экспериментах отсутствие активности. Таким образом, разработка биологически активных конъюгатов, их синтез и постановка экспериментов зачастую требуют дополнительных средств и, главное, времени.
Отличительной чертой данного проекта является использование молекулярной динамики в совокупности с методами эффективного сэмплирования конформационного пространства биомолекул для оптимизации последовательности предложенных конъюгатов, все части которых представлены пептидами. С использованием данного подхода предполагается, во-первых, оценивать стабильность химерных пептидов и фрагментов в их составе и таким образом предсказывать, не дестабилизирует ли один из фрагментов другой, а, во-вторых, определять, как влияет добавление "боеголовки" и линкера на способность лиганда связываться с клеточным рецептором (изменение селективности лигандов, стабильности лиганд-рецепторных комплексов, путей и кинетики их образования и распада). Стандартная молекулярная динамика способна дать ответы на эти вопросы, но так как ландшафты свободной энергии конформационных изменений пептидов в растворе и образования/распада лиганд-рецепторных комплексов очень сложны (представлены множеством высоких энергетических барьеров и метастабильных состояний между ними), получение результатов методом стандартной молекулярной динамики может занять очень много времени, и это делает задачу практически нерешаемой. Использование методов эффективного сэмплирования конформационного пространства позволяет существенно сократить время расчета, чем и обусловлена целесообразность их применения.

Научный задел
Мы предложили последовательности химерных пептидов, составленные из 1) лиганда кинтегрину αVβ6, одному из опухолевых маркеров, 2) линкера, содержащего субстрат фермента лизосом катепсина B и 3) антимикробного пептида протегрина, играющего роль "боеголовки".

Задел по протегрину.
Протегрин был открыт в 1993 году в Институте экспериментальной медицины, в Отделе общей патологии и патологической физиологии, с которым я веду активное сотрудничество. Наряду с антимикробной активностью протегрина в отделе исследовались его противоопухолевые свойства. Было показано, что протегрин активен в отношении антибиотикоустойчивых опухолевых клеток (в частности, доксорубицин-устойчивых), но обладает низкой селективностью и токсичен для нормальных клеток. В связи с этим протегрин как таковой в терапии опухолей неприменим. В то же время создание системы направленной доставки протегрина к опухолевым клеткам откроет пути разработки лекарственных препаратов на его основе. Сейчас в Институте экспериментальной медицины синтезируются и проверяются в клеточных экспериментах химерные пептиды, состоящие из протегрина и пептидного фрагмента, взаимодействующего с тем или иным опухолевым рецептором.

Задел по лигандам к интегрину αVβ6.
В первой части проекта, работа над которой была начата в 2019 году в Институте исследования полимеров в Майнце, в качестве лигандов были взяты два пептида, обладающие высокой селективностью по отношению к интегрину αVβ6: фрагмент предшественника TGFβ3, природного лиганда интегрина αVβ6, (первичная последовательность HGRGDLGRLKK-NH2) и пептид из вируса ящура (первичная последовательность NAVPNLRGDLQVLAQKVART). Для первого из них мы с использованием parallel biased metadynamics, одного из методов эффективного сэмплирования конформационного пространства, рассчитали ландшафт свободной энергии конформационных переходов в растворе и затем, с помощью алгоритма уменьшения размерности конформационного пространства sketch-map, идентифицировали метастабильные состояния. Результаты будут представлены на конференции "Free Energy Workshop 2020" 11-13 марта в Мюнстере и опубликованы в статье, над рукописью которой мы сейчас работаем. Для второго пептида мы на основе траекторий молекулярной динамики оценили параметры ЯМР (химические сдвиги 15N, 1HN, 1HA, времена релаксации 15N T1 и T2, значения 15N{1H}гетероядерных NOE) и получили более или менее хорошее согласие с имеющимися в литературе экспериментальными данными. Мы продолжаем расчеты свободной энергии и ЯМР параметров этого пептида в растворе, чтобы определить его метастабильные конформации и охарактеризовать продолжительность их жизни и динамику. Так как выбранные методы хорошо проявили себя в моделировании отдельных лигандов, мы в ближайшее время планируем применить их для расчета в растворе метастабильных конформаций и динамики предложенных химерных пептидов.

Выбор принимающей организации
Институт полимеров им. Макса Планка входит в число ведущих мировых научных центров в области изучения полимеров. В Отделе теории полимеров под руководством профессора Курта Кремера значительное число направлений исследований посвящено биополимерам. Д-р Омар Валссон, в научной группе которого планируется стажировка, занимается разработкой методов эффективного сэмплирования конформационного пространства молекул. Он продуктивно сотрудничает с М. Паринелло, создателем одного из этих методов - метадинамики, является автором вариационного подхода для повышения эффективности сэмплирования конформационного пространства (variationally enhanced sampling). Первый этап совместной работы с ним оказался очень продуктивным. Я получила ценный опыт использования методов эффективного сэмплирования конформационного пространства для моделирования белковых молекул в растворе. Этот опыт я сейчас применяю для работы над этим и другими проектами. Однако моделирование образования и распада белковых комплексов в совокупности с расчетом равновесных и кинетических констант связывания имеет свою специфику. У д-ра Омара Валссона есть большой опыт в проведении таких расчетов. Продолжение стажировки в его группе позволило бы перенять его опыт и начать использовать методы эффективного сэмплирования конформационного пространства для моделирования образования и распада белковых комплексов.

Предполагаемые результаты
Предполагается изучить, как методы эффективного сэмплирования конформационного пространства биомолекул используются в моделировании белок-белковых взаимодействий, и применить эти методы к белковым комплексам, образованным интегрином αVβ6 и его лигандами.

Layman's description

Проект посвящен созданию противоопухолевых пептидов, которые бы избирательно поражали больные клетки и не имели бы цитотоксической активности по отношению к здоровым. В литературе эта задача решается в рамках стратегии направленной доставки лекарств к клеткам-мишеням. Чтобы отвечать предъявляемым требованиям активный пептид должен состоять в общем случае из трех фрагментов: 1) “боеголовки”, убивающей клетку, 2) лиганда, связывающегося с рецептором на поверхности клетки и выполняющего функцию доставки «боеголовки» к клетке, и 3) линкера, соединяющего эти два фрагмента. Тем не менее прямое объединение активных фрагментов в одну пептидную последовательность, не гарантирует получение активного многофункционального пептида. Так, один фрагмент может дестабилизировать другой, и тогда весь пептид потеряет вторичную структуру. Или же наоборот, химерная последовательность может принять стабильную конформацию, не характерную для ее отдельных частей.
Подбор оптимальной последовательности пептида экспериментальным путем требует много денег и времени. Выявление стабильных конформаций пептида методом стандартной молекулярной динамики существенно дешевле, но тоже требует много времени, так как ландшафт свободной энергии пептидов обычно представлен многими минимумами и барьерами между ними. По этой причине только очень длинное моделирование может гарантировать, что оно правильно передаст соотношение конформаций пептида в растворе или в связывающем сайте белка. Наконец третий подход — это молекулярная динамика в совокупности с методами эффективного сэмплирования конформационного пространства. При этом подходе к потенциалу, определенному в стандартной молекулярной динамике, добавляется дополнительный потенциал, который модифицирует ландшафт свободной энергии пептида, устраняя его неровности. В итоге пептид свободно переходит из одной конформации в другую, а реальные частоты этих конформаций рассчитываются после завершения моделирования с учетом величины добавленного потенциала. Время моделирования и требуемые компьютерные мощности при таком подходе значительно меньше, чем при стандартной молекулярной динамике. Поэтому использование методов эффективного сэмплирования конформационного пространства при дизайне пептидов может принести ощутимую пользу.
Изучение методов эффективного сэмплирования конформационного пространства молекул и получение опыта их использования на практике и стало целью визита в Институт исследования полимеров в Майнце.

Key findings for the project

1 Постановка моделирований
Интегрин αVβ6 состоит из двух субъединиц: альфа и бета. И хотя считается, что пептид в основном взаимодействует с бета-субъединицей, мы выполнили ряд моделирований методом стандартной молекулярной динамики и определили, что минимальная стабильная часть белка, необходимая для моделирования процессов связывания и отсоединения пептида, представляет собой комплекс между доменом βI (β- субъединица) и β-пропеллерным доменом (α-субъединица).
Для моделирования мы экспериментально выбрали два силовых поля. Первое - Amber14sb. Это стандартное силовое поле, которое часто используется для моделирования хорошо свернутых белков, и, хотя оно позволяет выполнять расчеты с большой скоростью, мы заметили, что оно переоценивает взаимодействие между пептидом и ионом Mg2 +, который является важным компонентом сайта связывания пептида. По этой причине мы выбрали также силовое поле DES-Amber. Он медленнее, чем Amber14sb, но позволяет более точно моделировать белок-белковые комплексы, даже если один из компонентов комплекса является неупорядоченным белком, и обеспечивает лучшее соответствие экспериментальным данным взаимодействия пептида с Mg2 +.
2 Методы
Для моделирования событий образования и распада белок-пептидного комплекса, а также для оценки свободной энергии связывания мы решили использовать раздельно смещаемую метадинамику. Раздельно смещаемая метадинамика - это модификация метадинамики, которая позволяет использовать более трех коллективных переменных одновременно. В рамках этого метода мы накладываем одномерные гауссианы на все коллективные переменные одновременно, но с условными весами, зависящими от текущих значений потенциала смещения. Например, если первая коллективная переменная в момент времени tau имеет маленькое значение потенциала смещения, а вторая коллективная переменная имеет большое значение потенциала смещения, вес первого гауссиана будет больше, чем вес второго гауссиана. Мы решили использовать этот метод, потому что нам не удалось добиться связывания и отсоединения пептида с помощью любых трех возможных коллективных переменных. Мы все еще корректируем параметры добавления внешнего потенциала и на данный момент используем семь коллективных переменных.
Редкая метадинамика [4] часто используется для моделирования кинетики переходов и, в частности, для получения значений времен перехода. Было продемонстрировано, что если мы не накладываем потенциал смещения на область переходного состояния, мы можем извлечь времена перехода из метадинамического моделирования. Эти времена следует масштабировать, используя потенциал смещения, который мы добавили на область начального метастабильного состояния. Обычно мы выполняем несколько нечастых симуляций и получаем распределение времен перехода. Было показано, что если все сделано правильно, это распределение должно подчиняться статистике Пуассона, и мы можем использовать тест Колмогорова-Смирнова, чтобы проверить полученное распределение. Этот тест заключается в следующем: мы можем построить экспериментальную кумулятивную функцию полученного распределения, и мы можем сгенерировать теоретическое распределение Пуассона с тем же средним значением времени, а затем сравнить их. Нулевая гипотеза состоит в том, что обе кривые получены из одного и того же распределения. Нулевая гипотеза отклоняется, если значение p <α, α = 0,05.
Поскольку этот метод требует специальной обработки данных, я изучил этот метод на простой системе корнформационных переходов дипептид аланина в вакууме. Эта система имеет очень маленький размер и хорошо изучена. Принято считать, что время перехода C7eq → C7ax находится в микросекундном диапазоне, а время обратного перехода - в наносекундном диапазоне.
3 Первые результаты
Наши первые симуляции продемонстрировали, что взаимодействие между пептидом и ионом Mg2 + очень сильное. Согласно литературным данным, время пребывания пептида в связывающем сайте интегрина составляет около 35 минут при 300 К. Моделирование процессов образования и разрушения комплекса при таком сильном связывании является сложной задачей, и очень трудно найти правильные параметры (коллективные переменные и т. д.) для его проведения. Но мы полагаем, что большая часть энергии взаимодействия между пептидом и белком обеспечивается именно присутствием в сайте связывания интегрина иона Mg2 +. Также мы предполагаем, что по крайней мере некоторые элементарные события путей связывания и отсоединения пептида одинаковы в присутствии и в отсутствие иона Mg2 +. Поэтому мы решили начать расчеты с моделирования образования и разрушения белок-пептидного комплекса в отсутствие иона Mg2 +.
Мы начали моделирование методом нечастой метадинамики при 300 К с использованием набора двух коллективных переменных: 1) карта контактов между белком и пептидом, которая описывает естественные контакты в нативном комплексе, 2) карта контактов, которая описывает естественные контакты пептида. Мы определяем момент диссоциации пептида как уменьшение естественных контактов между белком и пептидом (первая коллективная переменная) примерно до нуля. Мы получили разумную оценку времени диссоциации (350 мс), которая соответствует энергии связи между пептидом и магнием 5 ккал/моль. Однако это моделирование все еще продолжается, и нам нужно получить больше переходов, чтобы сделать предположения о пути диссоциации.
Одним из важных результатов, которые мы получили в результате этого моделирования, является электростатическая природа комплекса встречи пептида с белком. Пептид содержит много положительно заряженных остатков, а сайт связывания белка заряжен отрицательно. В результате пептид не уходит с поверхности белка, даже если количество естественных контактов между белком и пептидом уменьшается до нуля. Этот комплекс встречи состоит из многих конформационно различных состояний, и мы предполагаем, что он образуется первым, когда пептид стыкуется с поверхностью белка в области сайта связывания. Мы предполагаем, что нам нужен отдельный набор симуляций сдругими коллективными переменными, чтобы учесть время разрушения и образования комплекса встречи.
Моделирование методом стандартной молекулярной динамики очень помогает при выборе и проверке параметров метадинамики, но оно не всегда возможно, потому что временные рамки моделируемых процессов обычно очень велики. К счастью, мы обнаружили, что в отсутствие Mg2 + при 400 К пептид диссоциирует из сайта связывания довольно быстрою .Мы решили провести серию моделирований в этих условиях, чтобы лучше понять механизм отсоединения пептида и структуру комплексов встречи. Сейчас эта работа продолжается.
Мы можем изучить процесс связывания пептида с белком и рассчитать свободную энергию связывания только в рамках моделирования с добавлением внешнего потенциала. Для этого мы начали моделирование комплекса в отсутствие иона Mg2+ методом раздельно смещаемой метадинамики с использованием набора из семи коллективных переменных: 1) карта контактов между белком и пептидом, которая описывает естественные контакты в нативном комплексе, 2) карта контактов который описывает естественные контакты пептида. 3) расстояние между центрами масс пептида и связывающего кармана белка 4) координационное число двух гидрофобных остатков пептида: L6 и L9, 5) координационное число остатка D5 пептида, 6) координационное число остатка R3 пептида, 7) координационное число между всеми положительно заряженными атомами пептида и всеми отрицательно заряженными атомами связывающего кармана белка (электростатическая коллективная переменная). Моделирование сейчас продолжается, и мы ждем результатов
4. Дальнейшие планы
4.1 Краткосрочные планы
a) Мы собираемся завершить моделирование, которое мы проводим в рамках нечастой метадинамики, и моделирование методом стандартной молекулярной динимики при 400 К. Мы скорректируем значение времени диссоциации в отсутствие Mg2 + и опишем путь отсоединения, а также структуру комплекса встречи. Мы также собираемся начать еще одну серию симуляций в рамках нечастой метадинамики, но с использованием другого набора коллективных переменных, чтобы убедиться, что выбранные коллективные переменные не влияют на описание процесса ухода пептида из связывающего сайта белка.
b) Мы завершим моделирование, которую мы начали методом раздельно смещаемой метадинамики (по результатам, при необходимости, мы скорректируем коллективные переменные). Мы будем использовать эти данные для расчета ландшафта свободной энергии взаимодействия между пептидом и белком и свободной энергии образования комплекса.
c) Мы собираемся использовать этот же подход для изучения комплекса между белком и пептидом в присутствии Mg2 +.
4.2 Долгосрочные планы
В следующих частях проекта мы планируем моделировать химерные пептиды в растворе и в сайте связывания интегрина αVβ6. К настоящему времени мы намерены использовать антимикробный пептидный протегрин в качестве «боеголовки», а аминокислотную последовательность, содержащую субстрат фермента катепсина B, в качестве линкера. Оба эти фрагмента кажутся очень многообещающими в качестве индивидуальных агентов. Однако последовательность целых пептидов обязательно должна быть оптимизирована с учетом данных, полученных для отдельных лигандов. Активность химерных пептидов будет проверена нашими сотрудниками в Институте экспериментальной медицины (отделение общей патологии и патологической физиологии), где в 1993 году был открыт протегрин.
AcronymD. Mendeleev 2020
StatusFinished
Effective start/end date15/11/20 → 14/03/21

ID: 71728142