В течение нескольких лет наш коллектив занимается изучением влияния препаратов гуминовых кислот на живые культуры, в т.ч. одно-клеточную водоросль Chlorella vulgaris. Нами используется ряд пара-метров, которые могут отражать влияние внешних факторов на физио-логические процессы живого организма. Модификатором таких факто-ров или собственно фактором могут являться гуминовые кислоты.
Многочисленные исследования показали, что гуминовые веще-ства обладают широким спектром воздействия на живые организмы. Одним из важных влияний гуминовых веществ является физиологиче-ская стимуляция процессов роста и развития организмов. Для оценки действия препаратов мы использовали следующие характеристики – прирост биомассы, интенсивность фотосинтеза и дыхания, а также чис-ленность клеток культуры Chlorella vulgaris. В ходе работы также ис-пользовалась оценка размеров клеток.
В нашей работе мы предлагаем два подхода к изучению распре-деления размеров клеток, которые позволяют ответить на вопрос, изме-няется ли размер клеток под влиянием внешних факторов. Первый метод – прямое микроскопирование культуры Chlorella vulgaris с исполь-зованием камеры Горяева. Второй – метод лазерной дифрактометрии с использованием прибора Shimadzu SALD-2201. Первый метод является очень трудоемким, но формирует более достоверные результаты. Вто-рой метод экспрессный, но его применимость к биологическим объектам и живым культурам, в частности, находится под вопросом.
Задача данной работы состояла в изучении возможности иссле-дования биологических микрообъектов лазерным дифрактометром и разработке алгоритма, позволяющего получать достоверные данные. Можно отметить, что использование микроскопа позволяет напрямую измерять размеры клеток, т.к. в камере Горяева расстояния между опор-ными штрихами известны. В нашем опыте в серии фотографий необхо-димо измерить не менее 300 клеток, что в полном варианте требует не менее 100 тысяч измерений.
В нашем исследовании мы использовали препарат, выделенный из верхней 5-сантиметровой толщи чернозема парующего, находящего-ся в Стрелецкой степи (Курская область). Данный препарат в ранее проведенных опытах показал свою инертность относительно всех физиологических характеристик, исследуемых нами, т.е. не наблюдалось значительного прироста биомассы, изменения в показателях дыхания и фотосинтеза, а также численности клеток культуры. Именно с этим препаратом был проведен опыт по изучению размера и численности клеток культуры Chlorella vulgaris.
Для реализации поставленной задачи был заложен опыт, где ис-пользовалась культура Chlorella vulgaris, со. 157 из РЦ СПбГУ «Куль-тивирование микроорганизмов», выращенная в условиях стерильности на среде Тамия. Рабочая концентрация раствора препарата ГК составила 0,003%. Суспензия хлореллы готовилась (разбавлялась питательной средой) таким образом, чтобы оптическая плотность на длине волны 680 нм в кювете 10 мм составляла около 0.1. Варианты постановки опыта: а) 24 часа с воздействием света; б) 24 часа без воздействия света; в) 5 суток с воздействием света; г) 5 суток без воздействия света. Для контроля были измерены параметры суспензии в момент постановки опыта. Для всех проб разных вариантов опыта измерено содержание растворенного кислорода с помощью анализатора МАРК-302Э, получены данные по распределению частиц на лазерном дифрактометре и сделаны фотографии через микроскоп для последующей обработки. Определение распределения частиц суспензии было проведено минимум в двукратной повторности.
Результаты распределения частиц на лазерном дифрактометре не могут быть использованы напрямую, т.к. прибор «видит» все частицы, которые встречаются на пути лазерного луча. В нашем опыте отмечается присутствие фракций менее 1.5 и более 7.0 мкм, что не может быть одиночными клетками культуры, исходя из литературных и полученных при помощи микроскопа данных. Выделение рабочего диапазона частиц необходимо указывать дополнительно для соответствующего перерасчета. В случае прямого учета клеток исследователь легко отличает клетки водоросли от других объектов.
Точную оценку численности клеток культуры возможно провести только методом прямого счета с использованием микроскопа – лазер-ный дифрактометр не дает такой информации. Косвенным показателем содержания клеток может служить оптическая плотность суспензии, но для дисперсных сред зависимость между «концентрацией» клеток и оптической плотностью нелинейна и требует дополнительного изуче-ния. Наиболее целесообразным видится совмещение двух методов – лазерной дифрактометрии для оценки распределения клеток по разме-рам и прямого счета для установления количества клеток в суспензии.
Нами показано, что распределения размеров клеток, рассчитан-ные на основе прямого учета и лазерной дифрактометрии хоть и близки, но все же отличаются. Одной из проблем в использовании лазерной ди-фрактометрии является то, что прибор «видит» примеси, которые явно отличаются по своим размерам от клеток культуры, но для изучения их природы нужны дополнительные исследования.
Работа выполнена при поддержке РЦ СПбГУ «Культивирование микроорганизмов» проект № 116-7485.
