Введение. Доказанным этапом онкогенеза является нарушение экспрессии онкогенов, которые в норме контролируют процесс клеточных делений. Мутации, активирующие экспрессию онкогенов, приводят к возникновению неограниченных пролиферативных сигналов и могут вызывать опухолевую трансформацию. Предотвратить это помогают защитные реакции клеток, такие как индукция апоптоза или запуск клеточного старения. Последние исследования показывают, что разные типы клеток по-разному предрасположены к развитию той или иной реакции на онкогенный стимул. В то же время, реакция эндометриальных стромальных клеток на активацию онкогена до сих пор остается неописанной.
Цель. Оценка влияния сверхэкспрессии онкогена HRAS (G12V) на функционирование эндометриальных стромальных клеток (эСК) человека.
Материалы и методы. Для сверхэкспрессии HRAS (G12V) эСК линии 2804 были модифицированы системой из двух лентивирусных векторов. Один из них содержал мутантный онкоген HRAS (G12V), имеющий перед промотором регуляторную последовательность Tet-operator. Эта последовательность представляет собой сайт связывания белка-репрессора TetR, который кодировался вторым вектором. Такая система позволяла запускать экспрессию HRAS (G12V) только при добавлении в питательную среду тетрациклина. На разных сроках с момента запуска экспрессии клетки были проанализированы с помощью методов иммуноблоттинга, иммунофлуоресценции, проточной цитометрии, а также окрашены с использованием хромогенного субстрата при pH = 6.0 для выявления активности ассоциированной со старением β-галактозидазы (SA-β-Gal). На последнем этапе изучалось изменение реакции эСК на сверхэкспрессию онкогена под действием эстрогена и ингибиторов белков mTOR, ATM, AKT, ERK1/2, p53 и p38.
Результаты. После индукции сверхэкспрессии HRAS (G12V) у клеток постепенно замедлялась пролиферация вплоть до полной остановки через 10 дней, наблюдалось увеличение размеров и повышение активности SA-β-Gal, а также активация р53/р21/Rb, Raf/MEK/ERK и PI3K/AKT сигнальных каскадов. Кроме того, в ядрах эСК были зафиксированы фокусы с фосфорилированной формой гистона H2AX, что свидетельствует об активации клеточного ответа на повреждение ДНК. Ингибирование mTOR, AKT и ERK1/2 частично предотвращало увеличение размеров клеток и способствовало снижению активности SA-βGal, однако не приводило к восстановлению пролиферативного потенциала. Подавление активности ATM, p53 и p38, так же как и воздействие на клетки эстрогеном, не оказало значительного влияния на реакцию эСК в условиях сверхэкспрессии HRAS (G12V).
Выводы. В ответ на сверхэкспрессию HRAS (G12V) эндометриальные стромальные клетки приобретают фенотип клеточного старения. Ассоциированный со старением блок пролиферации в данном случае является устойчивым признаком, который поддерживается несколькими механизмами и не отменяется при подавлении отдельных из них.
