TY - CONF

T1 - ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ПЛОТНЫХ КОНТАКТОВ В ЛЕГОЧНЫХ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ И В ЛЕГКИХ КРЫС

AU - Каретникова, Екатерина Сергеевна

AU - Марков, Александр Георгиевич

PY - 2023/12/25

Y1 - 2023/12/25

N2 - Одной из ключевых особенностей эпителиальных тканей является формирование зон плотных контактов (ПК) между клетками. В состав ПК входят трансмембранные белки семейства клаудина, окклюдин и ряд адаптерных белков, к которым относится белок ZO-2. Уровень и специфичность межклеточной проницаемости эпителиев опре-деляется белками семейства клаудинов [1]. Эпителии легких формируют барьер между внутренней средой организма и воздухом, в связи с чем в легочной ткани превалируют клаудины, снижающие межклеточную проницаемость, клаудин-3, -4 и -18 [2].Одним из широко применяемых в современных научных исследованиях типом моделей являются клеточные линии. Культивирование клеток in vitro способно повлиять на протекающие в клетках процессы и уровни экспрессии генов. Для детализации процессов, происходящих в эпителиях клетках легочной ткани крыс, в качестве моделей используются клеточные линии, выделенные из легких крыс: L2, R3/1 и RLE-6TN [3, 4]. Совпадение или несовпадение уровней экспрессии генов в клеточных линиях с уровнями экспрессии этих генов в ткани, с одной стороны, показывает сходность про-цессов, протекающих в клетках, а с другой стороны, различия между клеточной линией и тканью необходимо учитывать при интерпретации результатов исследований. В настоящее время данные об уровнях экспрессии белков ПК в эпителиальных клеточ-ных линиях легких крайне ограничены.Целью исследования была сравнительная оценка уровней экспрессии белков ПК (клаудин-3, -4, -18, ZO-2 и окклюдин) в эпителиальных клеточных линиях, выделенных из легких крыс, L2, R3/1 и RLE-6TN, а также сопоставление полученных данных с уровнями экспрессии этих белков в легких крыс.Клеточные линии L2 и RLE-6TN были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, США); линия R3/1 [5] была предоставлена профессором М. Каспером (Технический университет Дрездена, Германия). Культивирование клеточных линий L2, R3/1 и RLE-6TN проводилось в культуральной среде DMEM/F-12 (Gibco, Invitrogen, США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, пенициллином 100 Ед/мл и стрептомицином 100 мкг/мл (Gibco, Invitrogen, США). Клеточные линии выращивали при 37 °С в увлажненном стерильном воздухе с добавлением СО2 до 5%.Крысы Вистар массой тела 200-250 г были взяты из вивария, где содержались со сменой 12-часовых периодов освещенности и темноты при постоянном доступе к корму и воде ad libitum. Эвтаназия для забора образцов легочной ткани выполнялась внутримышечным введением золетила и ксилазила. Выделение РНК, ее очистка от примеси ДНК и обратная транскрипция были выполнены с помощью наборов peqGOLD Total RNA (PeqLab, VWR, Германия), DNase I digestion kit (PeqLab, VWR, Германия) и qScript cDNA SuperMix (qScript, Quanta BioSci-ences, США), соответственно. Для проведения количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) был использован набор GoTaq qPCR MasterMix (Promega, Мэдисон, США). Количественная ПЦР была выполнена на амплафикаторе iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Уровни мРНК в образцах были рассчитаны на основании пороговых циклов исследованных маркеров и пороговых циклов бета-актина, как гена с референсным уровнем экспрессии.Статистическая обработка данных была выполнена с помощью программного обеспечения Microsoft Excel professional version 2016 и Prism 8 for Windows Version 8.2.1 (441), GraphPad Software. Статистическая достоверность различий между исследуемыми группами была определена с помощью однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Тьюки. Уровень значимости p<0.05 был принят как статистически значимый.В исследовании впервые были определены уровни экспрессии белков ПК (клаудина-3, -4, -18, ZO-2 и окклюдина) в эпителиальных клеточных линиях L2, R3/1 и RLE-6TN. Впервые было проведено сопоставление уровней мРНК исследованных белков между тканью легких и клеточными линиями. Сравнение уровней экспрессии белков ПК между клеточными линиями показало, что уровни мРНК клаудина-3, -4, -18 и ZO-2 приблизительно на два порядка, а окклюдина – на четыре порядка выше в кле-точной линии RLE-6TN по сравнению с линиями L2 и R3/1. Сопоставление уровней мРНК исследованных белков в легких с уровнями в клеточных линиях выявило, что в легких уровни клаудина-3 и -4 более, чем на три порядка, а клаудина-18 более, чем на четыре порядка выше, чем в клеточных линиях. Уровни экспрессии ZO-2 и окклюдина были достоверно выше в ткани легкого по сравнению с уровнями мРНК этих белков в клетках RLE-6TN, но имеющиеся отличия были в пределах одного порядка. В то время как разница между уровнями мРНК в легких и клеточных линиях L2 и R3/1 составила приблизительно два и четыре порядка для ZO-2 и окклюдина, соответственно. Таким образом, полученные данные показали, что в клеточных линиях L2, R3/1 и RLE-6TN сохраняется экспрессия белков ПК, белков характерных для эпителиальных тканей, что позволяет использовать эти клеточные линии для изучения различных воз-действий на уровни экспрессии этих белков, однако необходимо учитывать снижение транскрипционных уровней этих белков в клеточных линиях по сравнению с тканью легкого.Ключевые слова: легкие, клеточная линия, плотные контакты, клаудин, окклюдин, экспрессияРабота выполнена при поддержке гранта РНФ 23-25-00556.Список литературы1. Markov A.G., Aschenbach J.R. and Amasheh S. Claudin clusters as determinants of epithelial barrier function. IUBMB Life.2015; 67:29-35.2. Koval M. Claudin heterogeneity and control of lung tight junctions. Annu Rev Physiol.2013; 75:551-67. 3. Nagarajan D., Wang L., Zhao W., et al. Trichostatin A inhibits radiation-induced epithelial-to-mesenchymal transition in the alveolar epithelial cells. Oncotarget.2017; 8:101745-101759. 4. Rentzsch I., Santos C.L., Huhle R., et al. Variable stretch reduces the pro-inflammatory response of alveolar epithelial cells. PLoS One.2017; 12:e0182369.5. Koslowski R., Barth K., Augstein A., et al. A new rat type I-like alveolar epithelial cell line R3/1: bleomycin effects on caveolin expression. Histochem Cell Biol.2004; 121:509-19.

AB - Одной из ключевых особенностей эпителиальных тканей является формирование зон плотных контактов (ПК) между клетками. В состав ПК входят трансмембранные белки семейства клаудина, окклюдин и ряд адаптерных белков, к которым относится белок ZO-2. Уровень и специфичность межклеточной проницаемости эпителиев опре-деляется белками семейства клаудинов [1]. Эпителии легких формируют барьер между внутренней средой организма и воздухом, в связи с чем в легочной ткани превалируют клаудины, снижающие межклеточную проницаемость, клаудин-3, -4 и -18 [2].Одним из широко применяемых в современных научных исследованиях типом моделей являются клеточные линии. Культивирование клеток in vitro способно повлиять на протекающие в клетках процессы и уровни экспрессии генов. Для детализации процессов, происходящих в эпителиях клетках легочной ткани крыс, в качестве моделей используются клеточные линии, выделенные из легких крыс: L2, R3/1 и RLE-6TN [3, 4]. Совпадение или несовпадение уровней экспрессии генов в клеточных линиях с уровнями экспрессии этих генов в ткани, с одной стороны, показывает сходность про-цессов, протекающих в клетках, а с другой стороны, различия между клеточной линией и тканью необходимо учитывать при интерпретации результатов исследований. В настоящее время данные об уровнях экспрессии белков ПК в эпителиальных клеточ-ных линиях легких крайне ограничены.Целью исследования была сравнительная оценка уровней экспрессии белков ПК (клаудин-3, -4, -18, ZO-2 и окклюдин) в эпителиальных клеточных линиях, выделенных из легких крыс, L2, R3/1 и RLE-6TN, а также сопоставление полученных данных с уровнями экспрессии этих белков в легких крыс.Клеточные линии L2 и RLE-6TN были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, США); линия R3/1 [5] была предоставлена профессором М. Каспером (Технический университет Дрездена, Германия). Культивирование клеточных линий L2, R3/1 и RLE-6TN проводилось в культуральной среде DMEM/F-12 (Gibco, Invitrogen, США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, пенициллином 100 Ед/мл и стрептомицином 100 мкг/мл (Gibco, Invitrogen, США). Клеточные линии выращивали при 37 °С в увлажненном стерильном воздухе с добавлением СО2 до 5%.Крысы Вистар массой тела 200-250 г были взяты из вивария, где содержались со сменой 12-часовых периодов освещенности и темноты при постоянном доступе к корму и воде ad libitum. Эвтаназия для забора образцов легочной ткани выполнялась внутримышечным введением золетила и ксилазила. Выделение РНК, ее очистка от примеси ДНК и обратная транскрипция были выполнены с помощью наборов peqGOLD Total RNA (PeqLab, VWR, Германия), DNase I digestion kit (PeqLab, VWR, Германия) и qScript cDNA SuperMix (qScript, Quanta BioSci-ences, США), соответственно. Для проведения количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) был использован набор GoTaq qPCR MasterMix (Promega, Мэдисон, США). Количественная ПЦР была выполнена на амплафикаторе iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Уровни мРНК в образцах были рассчитаны на основании пороговых циклов исследованных маркеров и пороговых циклов бета-актина, как гена с референсным уровнем экспрессии.Статистическая обработка данных была выполнена с помощью программного обеспечения Microsoft Excel professional version 2016 и Prism 8 for Windows Version 8.2.1 (441), GraphPad Software. Статистическая достоверность различий между исследуемыми группами была определена с помощью однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Тьюки. Уровень значимости p<0.05 был принят как статистически значимый.В исследовании впервые были определены уровни экспрессии белков ПК (клаудина-3, -4, -18, ZO-2 и окклюдина) в эпителиальных клеточных линиях L2, R3/1 и RLE-6TN. Впервые было проведено сопоставление уровней мРНК исследованных белков между тканью легких и клеточными линиями. Сравнение уровней экспрессии белков ПК между клеточными линиями показало, что уровни мРНК клаудина-3, -4, -18 и ZO-2 приблизительно на два порядка, а окклюдина – на четыре порядка выше в кле-точной линии RLE-6TN по сравнению с линиями L2 и R3/1. Сопоставление уровней мРНК исследованных белков в легких с уровнями в клеточных линиях выявило, что в легких уровни клаудина-3 и -4 более, чем на три порядка, а клаудина-18 более, чем на четыре порядка выше, чем в клеточных линиях. Уровни экспрессии ZO-2 и окклюдина были достоверно выше в ткани легкого по сравнению с уровнями мРНК этих белков в клетках RLE-6TN, но имеющиеся отличия были в пределах одного порядка. В то время как разница между уровнями мРНК в легких и клеточных линиях L2 и R3/1 составила приблизительно два и четыре порядка для ZO-2 и окклюдина, соответственно. Таким образом, полученные данные показали, что в клеточных линиях L2, R3/1 и RLE-6TN сохраняется экспрессия белков ПК, белков характерных для эпителиальных тканей, что позволяет использовать эти клеточные линии для изучения различных воз-действий на уровни экспрессии этих белков, однако необходимо учитывать снижение транскрипционных уровней этих белков в клеточных линиях по сравнению с тканью легкого.Ключевые слова: легкие, клеточная линия, плотные контакты, клаудин, окклюдин, экспрессияРабота выполнена при поддержке гранта РНФ 23-25-00556.Список литературы1. Markov A.G., Aschenbach J.R. and Amasheh S. Claudin clusters as determinants of epithelial barrier function. IUBMB Life.2015; 67:29-35.2. Koval M. Claudin heterogeneity and control of lung tight junctions. Annu Rev Physiol.2013; 75:551-67. 3. Nagarajan D., Wang L., Zhao W., et al. Trichostatin A inhibits radiation-induced epithelial-to-mesenchymal transition in the alveolar epithelial cells. Oncotarget.2017; 8:101745-101759. 4. Rentzsch I., Santos C.L., Huhle R., et al. Variable stretch reduces the pro-inflammatory response of alveolar epithelial cells. PLoS One.2017; 12:e0182369.5. Koslowski R., Barth K., Augstein A., et al. A new rat type I-like alveolar epithelial cell line R3/1: bleomycin effects on caveolin expression. Histochem Cell Biol.2004; 121:509-19.

KW - легкие

KW - клеточная линия

KW - плотные контакты

KW - клаудин

KW - окклюдин

KW - экспрессия

M3 - тезисы

T2 - Всероссийская конференция по естественным и гуманитарным наукам с международным участием «Наука СПбГУ – 2023»

Y2 - 21 November 2023 through 21 November 2023

ER -