TY - JOUR

T1 - Полногеномная амплификация малых количеств ДНК для определения молекулярного кариотипа клеток

AU - Сайфитдинова, Алсу Фаритовна

AU - Павлова, Ольга Андреевна

AU - Зелинский, Андрей Андреевич

AU - Рябинина, Марина Владиславовна

AU - Глотов, Олег Сергеевич

AU - Богомаз, Денис Игоревич

AU - Рубель, Александр Анатольевич

N1 - Сайфитдинова А.Ф., Павлова О.А., Зелинский А.А., Рябинина М.В., Глотов О.С., Богомаз Д.И., Рубель А.А. Полногеномная амплификация малых количеств ДНК для определения молекулярного кариотипа клеток // Интегративная физиология. - 2023. - Т. 4, № 3. С. 324–334. Doi: 10.33910/2687-1270-2023-4-3-324-334.

PY - 2023/10/31

Y1 - 2023/10/31

N2 - Задача равномерного масштабирования предельно малых количеств ДНК из отдельных клеток для молекулярно-генетических исследований потребовала разработки специализированных методов. За 30 лет были предложены разные подходы, базирующиеся на использовании вырожденных праймеров. Однако ограничение методов определяется также свойствами используемых полимераз. В настоящем исследовании предложено использование двухступенчатой полногеномной амплификации для получения надежных данных о молекулярном кариотипе исходного образца на основе анализа 20 пикограммов (пг) ДНК. В протоколе на первом этапе фланкирования фрагментов ДНК и амплификации с вытеснением второй цепи была использована пара частично вырожденных праймеров: 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNGG и 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNTTT, а на втором этапе полимеразной цепной реакции ограничились использованием праймера на основе конститутивной части 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGG. В работе приведены условия реакции и сравнение использования различных полимераз, а также их сочетаний. Показана возможность применения для первого этапа комбинации полимераз Bst и Pfu в присутствии 10 мМ ионов магния, а также выявлен потенциал для использования полимеразы Klentaq1, несущей замену D732N, для развития методов полногеномной амплификации. Продемонстрировано, что предложенный метод позволяет масштабировать исходное предельно малое количество ДНК для получения образца, пригодного для анализа методом массового параллельного секвенирования (секвенирование нового поколения, next generation sequencing, NGS) с применением стандартных коммерческих протоколов интерпретации данных.

AB - Задача равномерного масштабирования предельно малых количеств ДНК из отдельных клеток для молекулярно-генетических исследований потребовала разработки специализированных методов. За 30 лет были предложены разные подходы, базирующиеся на использовании вырожденных праймеров. Однако ограничение методов определяется также свойствами используемых полимераз. В настоящем исследовании предложено использование двухступенчатой полногеномной амплификации для получения надежных данных о молекулярном кариотипе исходного образца на основе анализа 20 пикограммов (пг) ДНК. В протоколе на первом этапе фланкирования фрагментов ДНК и амплификации с вытеснением второй цепи была использована пара частично вырожденных праймеров: 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNGG и 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGGNNNNNNTTT, а на втором этапе полимеразной цепной реакции ограничились использованием праймера на основе конститутивной части 5’-TGTGTTGGGTGTGTTTGG. В работе приведены условия реакции и сравнение использования различных полимераз, а также их сочетаний. Показана возможность применения для первого этапа комбинации полимераз Bst и Pfu в присутствии 10 мМ ионов магния, а также выявлен потенциал для использования полимеразы Klentaq1, несущей замену D732N, для развития методов полногеномной амплификации. Продемонстрировано, что предложенный метод позволяет масштабировать исходное предельно малое количество ДНК для получения образца, пригодного для анализа методом массового параллельного секвенирования (секвенирование нового поколения, next generation sequencing, NGS) с применением стандартных коммерческих протоколов интерпретации данных.

KW - вырожденные праймеры

KW - амплификация с множественным вытеснением цепи

KW - пцр

KW - секвенирование ДНК отдельных клеток

KW - изменение числа копий участков генома

KW - молекулярный кариотип

U2 - 10.33910/2687-1270-2023-4-3-324-334

DO - 10.33910/2687-1270-2023-4-3-324-334

M3 - статья

VL - 4

SP - 324

EP - 334

JO - Интегративная физиология

JF - Интегративная физиология

SN - 2687-1270

IS - 3

ER -