Актуальность.
Рост населения на планете и сопутствующий ему повышенный спрос на пластиковые материалы обуславливают возрастающую потребность в более устойчивом производстве биоразлагаемых полимеров. Предложенные первоначально биопластики на основе полимолочной кислоты обладают неудовлетворительными параметрами разложения многими микроорганизмами и практически не разлагаются в морской воде, а также требуют значительных затрат по выращиванию/переработке с/х растений. Это привело во всем мире к росту интереса к другому классу биопластиков с улучшенными свойствами деградации – на основе полигидроксиалканоатов. Наиболее распространенным вариантом этого химического класса является полигидроксибутират, который производится некоторыми микроорганизмами. На рынке биопластиков и биоразлагаемых полимеров в России пока только планируется производство биопластиков, причем на основе полимолочной кислоты, что привело нашу страну к существенному отставанию в этой области. Т.о., предлагаемый проект направлен на преодоление существующего отставания путем создания высокопроизводительных штаммов-продуцентов поли-β-гидроксибутирата, как основы для производства биоразлагаемого пластика в контексте задач и приоритетов национальных проектов «Биоэкономика», «Новые материалы и химия» и «Экологическое благополучие».
Цель научного исследования состоит в разработке не имеющих аналогов в РФ экспрессионных платформ и на их основе создании штаммов цианобактерий – высокоэффективных продуцентов полигидроксибутирата– основы биоразлагаемых биопластиков.
Общий план выполнения НИР.
В рамках первого этапа проекта (2027 г.) планируется:
-Разработать схему применения сайт-направленного мутагенеза для получения штаммов с измененным метаболизмом в результате делеции гена, кодирующего белок-ингибитор 2,3-фосфоглицерат-независимой фосфоглицератмутазы; сконструировать вектор.
-Сконструировать экспрессионные вектора, содержащие гены, кодирующие ключевые ферменты биосинтеза полигидроксибутирата - ацетил-КоА-ацетилтрансферазу и ацетоацетил-КоА-редуктазу - из цианобактерии Synechocystis sp. и гетеротрофной бета-протеобактерии Cupriavidus necator.
-Оптимизировать условия и рецептуры сред для культивирования штаммов-продуцентов с целью получения максимальной биомассы и выхода полигидроксибутирата.
В рамках второго этапа проекта (2028 г.) планируется:
-Отработать методику оценки полигидроксибутирата в пересчете на сухой вес клеток.
-На основе вектора, сконструированного в 2027 г; получить штаммы с делецией гена, кодирующего белок-ингибитор 2,3-фосфоглицерат-независимой фосфоглицератмутазы.
-Провести скрининг отобранных штаммов и выбрать штаммы с наибольшим выходом полигидроксибутирата.
В рамках третьего этапа проекта (2029 г.) планируется:
-Провести трансформацию выбранного штамма(ов), полученных в 2028 г, вектором(ами), содержащими гены, кодирующие ключевые ферменты биосинтеза полигидроксибутирата - ацетил-КоА-ацетилтрансферазу и ацетоацетил-КоА-редуктазу Synechocystis sp. и Cupriavidus necator.
-Провести скрининг полученных штаммов и отобрать штаммы, демонстрирующие наибольшие уровни синтеза полигидроксибутирата по сравнению с диким типом (не менее 70% по сухому весу).
-Разработать оптимальные методы очистки полигидроксибутирата для использования полимера в последующих этапах получения биопластика.
Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел.
Проводимые в лаборатории СПбГУ, возглавляемой проф. Е.В. Ермиловой, исследования метаболизма цианобактерий и одноклеточных водорослей позволили расшифровать многие аспекты организации регуляторных систем и показать, что фотосинтезирующие микроорганизмы могут служить удобной экспериментальной системой для изучения фундаментальных аспектов биологии как эукариотических микроорганизмов, так и растений (Chellamuthu, Ermilova, Lapina et al., Cell, 2014; Ermilova, 2020, Front. Plant Sci.; Vlasova et a., 2025, Plant Science). За время исследования коллективом лаборатории механизмов регуляции метаболизма, которые позволяют микроводорослям оптимизировать клеточные ответы, были разработаны оригинальные микробиологические и молекулярно-генетические подходы. Среди фотосинтезирующих прокариотических микроорганизмов важными объектами для решения вопросов клеточной биологии и биотехнологии являются цианобактерии. Нами впервые в мире показана возможность S-нитрозилирования белков одноклеточными цианобактериями, что доказывает консервативность NO-зависимого регуляторного механизма от цианобактерий до архепластид (Zalutskaya et al., 2026; Lapina et al., 2026)). Цианобактерии синтезируют целый ряд полезных для дальнейшего использования соединений, включая полигидроксибутират (PHB), который представляет собой перспективный вариант для производства биопластика с хорошими биодеградируемыми свойствами. Полученные нами исследования позволили выявить ряд ключевых компонентов, вовлеченных в контроль формирования PHB, и определить ключевые мишени для создания экспрессионных платформ. Отработан ряд методов, включая сфйт-направленный мутагенез, метод искусственных микроРНК, Pull-Down-метод с последующей тандемной масс-спектрометрией, методику на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса, конфокальную микроскопию, спектрофлуориметрию и анализ S-нитрозилирования белков. Краткий обзор результатов авторского коллектива показывает, что они внесли заметный вклад в изучение метаболизма и синтеза вторичных метаболитов у фотосинтезирующих микроорганизмов, владеют методами протеомного и метаболомного анализа и все это, а также наличие в лаборатории коллекции цианобактерий, а также необходимой приборной базы позволяет считать, что программа проекта будет успешно выполнена.
