Научная проблема: Широкое применение антибактериальных лекарственных препаратов (ЛП) приводит к возникновению резистентности к входящим в их состав лекарственным веществам (ЛВ), а также появлению «супербактерий», обладающих устойчивостью к различным антибактериальным ЛВ. Кроме того, в настоящее время вектор развития медицинской практики смещается в сторону индивидуального подхода, к терапии заболеваний и развитию такого направления здравоохранения, как персонализированная медицина, методология которой заключается в использовании комплекса физико-химических и молекулярно-биологических методов для оценки фармакокинетических и фармакогеномных особенностей организма пациента с целью наиболее безопасного и эффективного выбора лекарственного средства (ЛС) и схемы его дозирования для терапии заболевания. В свою очередь, биофармацевтический анализ с применением инструментальных методов играет важную роль для оптимизации режима дозирования антибактериальных ЛС, оценки их терапевтической эффективности и исследования особенностей генетически детерминированных процессов метаболизма конкретных ЛВ в организме человека. Обычно такой анализ предполагает извлечение, концентрирование, качественное и количественное определение конкретного ЛВ и/или его метаболитов в биологическом материале. Учет индивидуальных особенностей организма пациента при фармакотерапии на основании данных биофармацевтического анализа способствует повышению эффективности лечения, более быстрому выздоровлению пациентов и снижению частоты развития резистентности. В этом направлении особый интерес представляют неинвазивные инструментальные методы определения ЛВ в слюне и моче. В последнее время особое внимание уделяют разработке эффективных методов, позволяющих повысить производительность биофармацевтического анализа, а также снизить трудозатраты, сократить расход проб, реагентов и образующихся отходов. Новые возможности для анализа биомедицинских объектов открывают методы жидкостной микроэкстракции, обеспечивающие его миниатюризацию, экологическую безопасность, селективность и требуемую чувствительность. В этом направлении актуальной задачей является разработка избирательных и экологически безопасных методов микроэкстракции ЛВ, в том числе предполагающих массоперенос из проб биомедицинских объектов в экстрагенты нового поколения – супрамолекулярные растворители (СМР). Постоянно возрастающая потребность в биофармацевтическом анализе вызывает необходимость разработки автоматизированных способов, в т.ч. включающих микроэкстракционное выделение ЛВ. Повысить экспрессность и воспроизводимость инструментального анализа биопроб можно путем его автоматизации на принципах проточных методов, в которых основной акцент сделан на замену ручных рутинных процедур, составляющих основу стадии пробоподготовки, простыми легко автоматизируемыми операциями объединения и смешения потоков пробы и растворов реагентов.
Конкретная задача: Проект предполагает решение следующих задач: 1. Обосновать возможность применения солей ди-(2-этилгексил)-фосфорной кислоты и алкилполиглюкозидов в качестве прекурсоров СМР для микроэкстракционного выделения различных ЛВ и выявить способы инициирования фазового разделения и ускорения массопереноса. 2. Изучить фазовое поведение СМР на основе солей ди-(2-этилгексил)-фосфорной кислоты и алкилполиглюкозидов, а
также определить условия выделения фазы СМР в присутствии различных инициаторов фазового разделения в каждом
случае. Исследовать физико-химические свойства и состав полученных СМР.
3. Выявить основные закономерности извлечения антибактериальных ЛВ (фторхинолонов, карбапенемов,
тетрациклинов) из биологических жидкостей (моча, слюна) в фазу СМР в изучаемых экстракционных системах и
установить возможные механизмы взаимодействия супрамолекулярных агрегатов с аналитами.
4. Разработать гидравлическую схему для автоматизации процедуры микроэкстракционного выделения и
концентрирования целевых ЛВ из биологических жидкостей в фазу СМР на принципах проточного анализа.
5. Оптимизировать условия хроматографического анализа фаз экстрактов для неинвазивного определения
антибактериальных ЛВ.
6. Реализовать способ жидкостной микроэкстракции фторхинолонов из проб мочи в СМР на основе солей ди-(2-
этилгексил)-фосфорной кислоты с последующим определением аналитов методом высокоэффективной хроматографии
с флуориметрическим детектированием (ВЭЖХ-ФЛ).
7. Разработать способ on-line жидкостной микроэкстракции для автоматизированного выделения антибактериальных
ЛВ (фторхинолонов, карбапенемов, тетрациклинов) в СМР на основе алкилполиглюкозидов с последующим их
определением методом жидкостной хроматографии с подходящим способом детектирования (фотометрическое,
флуориметрическое или масс-спектрометрическое).
8. Подтвердить возможности разработанных способов путем биофармацевтического анализа проб биологических
жидкостей и подтвердить правильность получаемых результатов, выполнить валидацию.
Масштаб проекта и его комплексность состоит в детальном исследовании супрамолекулярных систем на основе ди-(2-
этилгексил)-фосфорной кислоты и алкилполиглюкозидов с точки зрения их физико-химических свойств и
экстрагирующей способности по отношению к антибактериальным ЛВ, а также в разработке новых
миниатюризированных и автоматизированных подходов для выполнения биофармацевтического инструментального
анализа.
Задел:
Руководитель имеет научный задел в области микроэкстракционных методов и их автоматизации на принципах
проточных методов. В 2020 году он успешно защитил диссертацию на соискание учёной степени кандидата
химических наук на тему: «Микроэкстракционное выделение в фармацевтическом анализе антибактериальных и
нестероидных противовоспалительных лекарственных средств». Результаты диссертационной работы были
опубликованы в форме 7 статей в высокорейтинговых журналах (Analytica Chimica Acta, Talanta, Food Chemistry, Journal
of Chromatography A, Trends in Analytical Chemistry).
В ходе выполнения исследований Алексеем Сергеевичем были тщательно изучены экстракционные свойства
кислотных растворителей с переключаемой гидрофильностью (РПГ) – высших карбоновых и ди-(2-этилгексил)-
фосфорной кислот – перспективных для извлечения веществ с амфотерными свойствами в отличие от ранее
предложенных основных РПГ (вторичных и третичных аминов), в присутствии которых может происходить ионизация
целевых веществ в сильнощелочной среде и, как следствие, затрудняться их экстракция. Были предложены
экспрессные и высокочувствительные способы хроматографического определения антибиотиков фторхинолонового
[C. Vakh, A. Pochivalov, V. Andruch, L. Moskvin, A. Bulatov. A fully automated effervescence-assisted switchable solvent-based
liquid phase microextraction procedure: Liquid chromatographic determination of ofloxacin in human urine samples.
Analytica Chimica Acta. V. 907, 2016, Pages 54-59. DOI: 10.1016/j.aca.2015.12.004], сульфаниламидного [A. Pochivalov, C.
Vakh, S. Garmonov, L. Moskvin, A. Bulatov. An automated in-syringe switchable hydrophilicity solvent-based microextraction.
Talanta. V. 209, 2020, 120587, DOI: 10.1016/j.talanta.2019.120587] и тетрациклинового [S. Lebedinets, C. Vakh, K.
Cherkashina, A. Pochivalov, L. Moskvin, A. Bulatov. Stir membrane liquid phase microextraction of tetracyclines using
switchable hydrophilicity solvents followed by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A.
V.1615, 2020, 460743. DOI: 10.1016/j.chroma.2019.460743] рядов в биологических жидкостях, включающие их
микроэкстракционное выделение на принципах образования кислотных РПГ. Предложенные способы нашли
применение в практике персонализированной медицины, относящейся к приоритетным направлениям научно-
технологического развития РФ, для неинвазивного контроля содержания антибиотиков в биологических жидкостях, в
том числе для оценки фенотипа ацетилирования путем определения фармакокинетических параметров метаболизма
лекарственных веществ после анализа проб мочи. Представлены новые подходы к реализации микроэкстракционного
выделения фторхинолонов и тетрациклинов из суспендированных проб пищевых продуктов и водных сред в
кислотные РПГ на импрегнированных мембранах и на принципе in situ образования дисперсной фазы экстрагента с ее
одновременным выделением на вращающемся пористом гидрофобном диске.
В области микроэкстракции на принципах образования супрамолекулярных систем автором впервые были изучены
свойства высших первичных аминов как амфифилов. В качестве агентов коацервации было предложено использовать
растворы электролитов, полярные растворители и природные монотерпеноиды. Впервые показано, что при введении в
изотропный раствор первичного амина вещества, хорошо гидратирующегося водой или способного вступать в
химическое взаимодействие с амином, происходит процесс коацервации и in situ генерирование отдельной фазы, в
которую концентрируются целевые аналиты. Разработанные подходы нашли применение для высокочувствительного
определения антибиотиков сульфаниламидного ряда в биологических жидкостях [P. Bogdanova, A. Pochivalov, C. Vakh,
A. Bulatov. Supramolecular solvents formation in aqueous solutions containing primary amine and monoterpenoid
compound: Liquid phase microextraction of sulfonamides. Talanta. V. 216, 2020, 120992, DOI:
10.1016/j.talanta.2020.120992].
Предложенные подходы были также реализованы в автоматизированном варианте в проточных системах. Для ВЭЖХ-
ФЛ определения офлоксацина в гомогенных растворах (лекарственные препараты, моча) предложен автоматизированный метод пробоподготовки, предполагающий микроэкстракционное выделение в экстрагент с
«переключаемой гидрофильностью» [C. Vakh, A. Pochivalov, V. Andruch, L. Moskvin, A. Bulatov. A fully automated
effervescence-assisted switchable solvent-based liquid phase microextraction procedure: Liquid chromatographic
determination of ofloxacin in human urine samples. Analytica Chimica Acta. V. 907, 2016, Pages 54-59. DOI:
10.1016/j.aca.2015.12.004]. Для ВЭЖХ-УФ определения сульфаниламидов в лекарственных препаратах и мочи был
предложен метод пробоподготовки, включающий их жидкостную микроэкстракцию из проб в камере шприцевого
насоса проточного анализатора [A. Pochivalov, C. Vakh, S. Garmonov, L. Moskvin, A. Bulatov. An automated in-syringe
switchable hydrophilicity solvent-based microextraction. Talanta. V. 209, 2020, 120587, DOI:
10.1016/j.talanta.2019.120587]. Кроме того, был разработан способ экстракционно-фотометрического определения
диклофенака в лекарственных препаратах и слюне, включающий регистрацию оптической плотности органической
фазы посредством оптоволоконного зонда в условиях жидкостной экстракции в узлах системы для проточного анализа
[A. Pochivalov, C. Vakh, V. Andruch, L. Moskvin, A. Bulatov. Automated alkaline-induced salting-out homogeneous liquidliquid
extraction coupled with in-line organic-phase detection by an optical probe for the determination of diclofenac.
Talanta. V. 169, 2017, Pages 156-162. DOI: 10.1016/j.talanta.2017.03.074].
Результаты исследований неоднократно докладывались на Всероссийских и международных конференциях.
Представленные работы были поддержаны грантами Правительства Санкт-Петербурга (2015, 2016, 2017 и 2021 гг.),
Президента РФ (МД-6597.2016.3), фондов РФФИ (16-33-00037 мол_а, 18-33-01176 мол_а, 18-33-20004 мол_а_вед) и
РНФ (21-13-00020, 22-73-10039). По результатам исследования автором проекта опубликована 21 оригинальная работа
в таких журналах как Analytica Chimica Acta, Talanta, Journal of Molecular Liquids, Analyst, Food Chemistry, Journal of
Chromatography A и 2 обзорные статьи в журналах Trends in Analytical Chemistry и ChemTexts, посвященные
применению глубоких эвтектических растворителей и проточного анализа в аналитической химии. За время научной
деятельности им опубликованы 23 научные статьи в изданиях, индексируемых в базе Scopus, которые процитированы
в общей сложности 503 раза. Индекс Хирша равен 12.
Руководитель проекта является научным руководителем студентов очной формы обучения Института химии СПбГУ,
участие которых планируется в проекте: Лодянова Юрия Олеговича и Жаворонка Марка Филиппа Игоревича. Они
активно участвуют в исследованиях научной группы, конференциях, конкурсах и являются авторами статей в
международных рецензируемых журналах по теме проекта [M. F. Zhavoronok, C. Vakh, A. Bulatov. Automated primary amine-based supramolecular solvent microextraction with monoterpenoid as coacervation agent before high-performance liquid chromatography. Journal of Food Composition and Analysis. V. 116. 2023. 105085. DOI: 10.1016/j.jfca.2022.105085].
Ссылки на публикации за последние 3 года:
1. Shishov A., Pochivalov A., Dubrovsky I., Bulatov A. Deep eutectic solvents with low viscosity for automation of liquid-phase microextraction based on lab-in-syringe system: Separation of Sudan dyes. Talanta. 2023. Volume 366. 124243. DOI: 10.1016/j.talanta.2022.124243 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 6.556; https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0039914022010396)
2. Pochivalov A., Pavlova K., Garmonov S., Bulatov A. Behaviour of deep eutectic solvent based on terpenoid and long-chain alcohol during dispersive liquid-liquid microextraction: Determination of zearalenone in cereal samples. Journal of Molecular Liquids. 2022. Vol. 366. 120231. DOI: 10.1016/j.molliq.2022.120231 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 6.633; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167732222017706).
3. Pochivalov A., Cherkashina K., Sudarkin A., Osmolowsky M., Osmolovskaya O., Krekhova F., L. Nugbienyo, Bulatov A.. Liquid-liquid microextraction with hydrophobic deep eutectic solvent followed by magnetic phase separation for preconcentration of antibiotics. Talanta. 2023. Vol. 252. 123868. DOI: 10.1016/j.talanta.2022.123868 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 6.556; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914022006646).
4. Pochivalov A., Cherkashina K., Shishov A., Bulatov A. Microextraction of sulfonamides from milk samples based on hydrophobic deep eutectic solvent formation by pH adjusting. Journal of Molecular Liquids. 2021. Vol. 663. 116827. DOI: 10.1016/j.molliq.2021.116827 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 6.165; https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167732221015518).
5. Cherkashina K., Pochivalov A., Simonova V., Shakirova F., Shishov A., Bulatov A. A synergistic effect of hydrophobic deep eutectic solvents based on terpenoids and carboxylic acids for tetracycline microextraction. Analyst. 2021. Vol. 146. pp. 3449-3453. DOI: 10.1039/D1AN00096A (импакт-фактор Web of Science, Scopus 5.227; https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/an/d1an00096a#:~:text=Hydrophobic%20deep%20eutectic%20solvents%20were,synergistic%20effect%20on%20tetracycline%20extraction).
6. Bogdanova P., Pochivalov A., Vakh C., Bulatov A. Supramolecular solvents formation in aqueous solutions containing primary amine and monoterpenoid compound: Liquid phase microextraction of sulfonamides. Talanta. 2020. V. 216. 120992. DOI: 10.1016/j.talanta.2020.120992 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 6.556; https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0039914020302836).
7. Shishov A., Pochivalov A., Nugbienyo L., Andruch V., Bulatov A. Deep eutectic solvents are not only effective extractants. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 2020. V. 129. 115956. DOI: 10.1016/j.trac.2020.115956 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 14.908; https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0165993620301850).
8. Kanashina D., Pochivalov A., Timofeeva I., Bulatov A. Mixed surfactant systems based on primary amine and medium-chain fatty acid: Micelle-mediated microextraction of pesticides followed by the GC–MS determination. Journal of Molecular Liquids. 2020. V. 306. 112906. DOI: 10.1016/j.molliq.2020.112906 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 6.633; https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167732220302646).
9. Pochivalov A., Vakh C., Garmonov S., Moskvin L., Bulatov A. An automated in-syringe switchable hydrophilicity solvent-based microextraction. Talanta. 2020. V. 209. 120587. DOI: 10.1016/j.talanta.2019.120587 (импакт-фактор Web of Science, Scopus 6.556; https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0039914019312202).
Реализованные научно-исследовательские работы по теме НИОКТР за 3 года:
1. Грант РНФ «Дизайнерские экстракционные системы для эффективного инструментального анализа пищевых продуктов» № 21-13-00020, 2021-н.в., Россия, исполнитель.
2. Грант Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых ученых, молодых кандидатов наук «Микроэкстракционное выделение и концентрирование лекарственных веществ для их последующего определения в сложных по составу объектах», 2021 г., Россия, исполнитель.
3. Грант РНФ «Новые подходы для экологически безопасного и автоматизированного контроля качества пищевых продуктов, агро- и акваобъектов с применением глубоких эвтектических растворителей» № 22-73-10039, 2022-2023, Россия, исполнитель.
Защищенная руководителем кандидатская диссертация: «Микроэкстракционное выделение в фармацевтическом анализе антибактериальных и нестероидных противовоспалительных лекарственных средств» (2020 г.)
Устные доклады Почивалова А.С. на конференциях за последние 3 года:
1. «Automation of switchable-hydrophilicity solvent liquid-phase microextraction based on in-syringe concept», Международный симпозиум «V4 Symposium Flow Analysis & Capillary Electrophoresis», 28 июня – 1 июля 2021, г. Краков, Польша
2. "Методы микроэкстракционного выделения для контроля качества антибактериальных и нестероидных противовоспалительных лекарственных средств", XI Всероссийская научная конференция студентов и аспирантов с международным участием «молодая фармация – потенциал будущего», 15 марта – 23 апреля 2021 года, Санкт-Петербург
3. "Жидкостная микроэкстракция как метод концентрирования микотоксинов из проб пищевых продуктов", IV Cъезд аналитиков России, 26-30 сентября 2022 г., Москва
