(1) Совместно с промышленным партнером разработали план экспериментов, определили обязанности сторон в рамках выполнения проекта. Закупили партию личинок зоофобаса и поместили их для содержания на стандартный кормовой рацион (на базе промышленного партнера). Получили образцы ТБО для проведения первой серии экспериментов. Совместно с промышленным партнером установили экспериментальную систему культивирования зоофобаса на ТКО, заложили опыт по переработке мусора личинками зоофобаса в трех параллельных экспериментах. Провели запланированные отборы проб для изучения микрофауны гумуса на разных этапах его хранения.

(2) Провели анализ литературных данных по переработке отходов личинками насекомых и использованию метабаркодинга для экспресс-оценки сообществ микроорганизмов в различных субстратах. Ключевым преимуществом личинок Zoophobas morio, в отличие от других организмов, является способность с помощью мощного ротового аппарата и специфического кишечного микробиома эффективно деполимеризовать и усваивать различные синтетические полимеры, включая пенополистирол, полиэтилен и полипропилен. В качестве современного и эффективного инструмента для мониторинга микробиома и выявления патогенов широко используется метод ДНК-метабаркодинга. Мы выделяем его преимущества перед традиционными методами: высокую пропускную способность, воспроизводимость, независимость от культивирования и возможность комплексного анализа как бактериальных, так и протозойных сообществ. Мы заключаем, что интеграция биоконверсии ТКО с помощью личинок Zoophobas morio и регулярного метабаркодингового контроля представляет собой перспективную и технологичную основу для создания безопасных и устойчивых систем переработки отходов. Отдельный раздел работы был посвящен критически важному аспекту биобезопасности получаемых продуктов – биогумуса и биомассы личинок. Подготовленную обзорную статью направили в печать в журнал «Экология и промышленность России» (Scopus/РИНЦ/RSCIWoS. Статья принята в печать).

(3) Получили материал из кишечника «стерильных» зоофобасов (по 15 червей в трех повторностях для каждой серии экспериментов), поддерживавшихся на стандартном кормовом рационе (точку отсчета» при изучении изменений в микробиоме кишки личинок в ходе переработки ими ТКО) и материал из кишечника зоофобасов, перерабатывавших ТКО (по 25 червей в трех повторностях для каждой серии экспериментов). Содержимое различных отделов кишечника зоофобаса и полученный в результате переработки биогумус высеяли на набор питательных сред для изучения с использованием методов обогащающего культивирования. Использовали как стандартные для изучения разнообразия микрофауны среды (PJ – Prescott and James 1955; WG – Geissen et al. 2014), так и агаризованные питательные среды, более специализированные для выделения протистов из образцов, содержащих малое количество влаги (NN - Page 1988 и wMY - Spiegel et al., 1995). Высевы просматривали на 5-6. 10-12 и 23-26 дни инкубации. Анализ высевов из кишечника зоофобаса показал, что активная протозойная фауна кишки ожидаемо достаточно бедна (3-6 видов протистов). Анализ произведенного личинками биогумуса выявил существенное разнообразие протистов, в первую очередь – амебозоев. Обнаружено не менее 8 видов амеб и ряд видов инфузорий и мелких жгутиконосцев. Проведено документирование выделенных штаммов, установлены лабораторные культуры для изучения. Подготовлен материал для необходимых электронно-микроскопических исследований штаммов амеб родов Korotnevella и Cochliopodium. Заморожены отобранные одиночные клетки для выделения ДНК, из ряда видов выделена ДНК из одиночных клеток амеб с использованием набора Arcturus PicoPure DNA isolation kit (Thermo). По предварительным оценкам все обнаруженные виды амебоидных протистов – новые для науки, их необходимо описывать и именовать. Из биогумуса описали новый для науки вид амеб отряда Leptomyxida, статья направлена в печать.

(4) Выделили тотальную ДНК из всех образцов из кишки зоофобаса и из произведенного им биогумуса. Полученную ДНК амплифицировали с использованием двух наборов универсальных эукариотических праймеров, амплифицирующих участки V4 и V9 гена 18S рРНК, праймерной системы, избирательно уменьшающей амплификацию грибов для участка V4 и двух наборов праймеров для амплификации участка гена 16S рРНК у бактерий. Провели работы по адаптации праймерных систем, в частности – работы по оптимизации программ ПЦР для амплификации природной ДНК с использованием современных высокопроцессивных ДНК-полимераз семейства Tersus. В результате этой работы отказались от сложных «двухступенчатых» программ амплификации, существенно уменьшили время элонгации и увеличили количество циклов амплификации. Полученные программы в ходе работы продемонстрировали более высокую эффективность нежели оригинальные, предложенные в свое время для использованных праймерных пар. Полученный материал подготовлен для NGS секвенирования. В связи со сложной логистикой расходных материалов для систем Illumina и большими сроками поставки расходных материалов, приняли решение отказаться от пробного запуска для предварительной оценки полученной ДНК (такой технической возможности у научного парка сейчас нет, так как частичный запуск требует поиска дополнительных образцов для полной загрузки секвенирующей ячейки) и аккумулировать собранный материал по всем сериям экспериментов для полного запуска Illumina MiSeq в конце 2025 – начале 2026 года.

(5) При работе с полученным штаммами столкнулись с рядом проблем в описании морфологии клеток амеб, для чего пришлось провести более широкий анализ терминологии, используемой при описании амебоидных протистов и внести в нее ряд усовершенствований и новшеств. Первые же работы по описанию амеб из кишки зоофобаса показали, что в экологическом научном сообществе работающим в этой области исследований обычно применяемая нами терминология и форма описания амебоидных протистов, в особенности – плазмодиальных форм не является очевидной, а традиционное описание вида представляется рецензентам расплывчатым и вызывает критику, в основном – из-за большого количества описательных и недостаточного количества измеримых признаков. С аналогичной проблемой мы столкнулись и при публикации ряда статей по материалам, поддержанным иными нашими проектами. Таким образом проблема по всей видимости имеет системный характер. Для решения этой проблемы занялись разработкой более строго количественного языка описания форм амебозоев, на примере ряда штаммов лептомиксид изолированных из различных местообитаний. В рамках этих исследований разработали обновленную форму описания, в частности – количественные оценки соотношения площадей компактных и разветвлённых частей тела амеб, выполненные с использованием возможностей программ NisElements Ar и BS. Разработали подходы и схемы для описания строения ядра текамебид у видов, демонстрирующих выраженный полиморфизм организации ядерного аппарата клетки. Модифицированную форму представления данных использовали при описании ряда новых видов амеб, и она по всей видимости оказалась более прогрессивной, замечания рецензентов экологических журналов удалось снять. С использованием разработанных подходов в печать подали пять статей, одна из них уже прошла рецензирование. Подобную форму представления данных будет необходимо и далее использовать при описании видов, особенно с учетом публикации работ по проекту в журналах экологической направленности.

(6) Были продолжены работы по адаптации методов работы с амебоидными протистами применительно к материалу из кишечника зоофобаса. В частности, работали над использованием специальных сред и приспособлений для культивирования микроаэрофильных организмов. Внесли дальнейшие модификации в применяемые методы наблюдения и клонирования протистов, в основном направленные на уменьшение доступа кислорода в препараты при микроскопировании.

(7) Одной из задач проекта является разработка подходов для обнаружения и оценки наличия в биогумусе потенциально патогенных групп организмов, в частности – амеба-резистентных бактерий (АРБ), равно как и организмов, способных вызвать эпизоотии у зоофобаса при массовом культивировании. Вопрос особенно актуален именно в связи с использованием ТКО в качестве субстрата, так как их бактериальная и грибная обсеменённость никак не контролируется, и уровень переработки или сохранения подобной фауны совершенно не изучен. Существенная часть грибов и бактерий в подобных субстратах связана с амебоидными протистами, которые служат одновременно резервуаром, вектором и переносчиком этих бактерий. Провели анализ литературных данных посвященных амеба-резистентным бактериям и иным эндобионтам амеб (вирусы, грибы). Поняли, что вирусный компонент подобных ассоциаций крайне разнообразен и важен и его несомненно необходимо также взять в работу. По результатам этого анализа подготовили и представили приглашенный пленарный доклад на Конгрессе исследователей симбиотических систем (КИСС 2025, Москва), тезисы доклада опубликованы в сборнике имеющем ISBN и DOI и проиндексированном в РИНЦ.