Актуальность и значимость изучения генетических основ моногенных и многофакторных заболеваний диктуются основной стратегией развития современной медицины - переводом ее на уровень персонализированной медицины (ПМ), представляющей собой интегральную медицину, которая включает в себя разработку персонализированных средств лечения, тестирование на предрасположенности к болезням, профилактику, диагностику и лечение заболеваний с учетом индивидуальных генетических особенностей пациентов. Необходимыми условиями развития и внедрения методов ПМ являются выявление генетических и эпигенетических механизмов патогенеза заболеваний. Выявление молекулярных механизмов патогенеза болезней, их конкретных клинических фенотипов является основой для разработки методов ранней диагностики и новейших методов лечения, основанных, в том числе, на технологии геномного редактирования.
Актуальность исследования онкологических заболеваний (рак молочной железы, яичников, рак почки, мелкоклеточный рак легкого) определяется их высокой распространенностью, сложностью прогнозирования и непредсказуемостью клинического течения, а также высоким уровнем смертности как в России, так и во всем мире. Несмотря на то что патогенез онкологических заболеваний активно изучается, в настоящее время не существует тест-систем для ранней диагностики заболеваний и/или прогноза их течения. Высокоспецифичных маркеров, которые могли бы свидетельствовать об эффективности терапии рака почки и предсказывать риск развития резистентности к терапии, не существует. В связи с этим, актуальным является поиск маркеров для контроля эффективности лечения пациентов с раком почки на основе комплексного генетического и эпигенетического анализа опухоли и ее микроокружения.
Актуальными являются и проблемы поиска новых генетических и эпигенетических маркеров риска развития распространенных аллергических заболеваний (бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита), а также оценка эффективности проводимой терапии глюкокортикостероидными и антигистаминными препаратами для раскрытия этиологии и патогенеза данных заболеваний, разработки новых подходов диагностики и лечения.
Актуальность клинико-молекулярно-генетических исследований моногенных (олигогенных) патологий нервной системы связана с их широкой клинической и генетической гетерогенностью, перекрыванием патогенетических механизмов различных нозологий и значительной долей случаев заболеваний с неустановленной генетической причиной. Поиск молекулярно-генетических причин их развития с использованием технологий секвенирования нового поколения открывает перспективы дальнейшего развития этого направления, нацеленного на разработку новых эффективных подходов диагностики, профилактики и лечения таких болезней.
В связи с вышесказанным, планируется провести комплексное исследование генетических и эпигенетических механизмов развития ряда онкологических и аллергических заболеваний, а также отдельных наследственных заболеваний нервной системы с использованием современных технологий геномного анализа для разработки эффективных подходов диагностики, профилактики и лечения этих заболеваний.
Целью настоящего исследования является раскрытие молекулярных механизмов патогенеза многофакторных онкологических и аллергических заболеваний, а также моногенных нейродегенеративных патологий, направленное на разработку новых эффективных подходов ДНК-диагностики и патогенетического лечения.
В соответствие с целью, на 2020 год были поставлены следующие задачи:
1. Провести поиск генетических маркеров риска развития рака молочной железы и рака яичников, а также специфических маркеров различных типов данных заболеваний на основе данных полногеномных исследований.
2. Сформировать коллекцию образцов венозной крови пациентов с метастатическим раком почки, получающих терапию ингибиторами контрольных точек иммунитета (ИКТИ), а также индивидов контрольной группы, первостепенные родственники которых не имели онкологических заболеваний, выделить ДНК из образцов венозной крови.
3. Провести поиск мутаций в гене супрессоре опухолевого роста TP53 в образцах опухолевой ткани больных мелкоклеточным раком легкого.
4. Провести анализ литературных данных и отбор полиморфных вариантов в генах предшественников микроРНК, участников биосинтеза и процессинга микроРНК или сайтах связывания микроРНК с мишенью с использованием баз данных Национального центра биотехнологических информаций (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org), полиморфизма сайта связывания микроРНК (http://compbio.uthsc.edu/miRSNP/miRSNP_detail_all.php) для формирования панели для генотипирования, содержащей ~60 полиморфных локусов.
5. Провести генотипирование и анализ ассоциации полиморфных вариантов генов-кандидатов аллергических заболеваний и генов, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов, применяемых для лечения аллергопатологии.
6. Провести полное секвенирование экзома у пациентов с аутосомно-доминантной спастической параплегией с неустановленной генетической причиной заболевания; биоинформатический анализ результатов исследования и их валидацию методом секвенирования по Сэнгеру.

Рак молочной железы - многофакторное генетически гетерогенное заболевание. Мутации в таких генах как BRCA1, BRCA2, CDH1, PTEN, STK11, TP53, PALB 2, ATM , CHEK2 и NBN характеризуются высокой и умеренной пенетрантностью. На основе полногеномных ассоциативных исследований (GWAS) выявлены более 170 полиморфных локусов, широко распространенных в популяциях, с низкой пенетрантностью, каждый из которых обусловливает небольшое повышение риска развития рака груди. Для выявления женщин, подверженных повышенному риску, и определения более точного значения оценки риска развития, необходимо объяснить оставшуюся часть генетической наследственности рака молочной железы.
При раке молочной железы HOXB13 играет важную роль в прогрессировании заболевания. Высокий уровень экспрессии HOXB13 в отношении к IL17BR связан с высоким риском рецидива и неблагоприятным исходом у женщин с эстроген - позитивным РМЖ [Zhao et al., 2014]. Кроме того, высокая экспрессия HOXB13 связана с плохим ответом на терапию тамоксифеном [Shah et al., 2013]. На сегодняшний день получены противоречивые результаты анализа зародышевых мутаций гена HOXB13 с риском развития рака молочной железы [Alanee et al., 2012; Laitinen et al., 2013].
В рамках консорциума по изучению факторов риска рака молочной железы (ВСАС) было проведено генотипирование по четырем миссенс мутациям в гене HOXB13: p.G84E, p.P190L, p.R217C и p.R268Q у 68521 женщин с раком молочной железы и 54865 индивидов контрольной группы. В результате данного исследования все мутации были выявлены у женщин европейского происхождения, но не у азиатов. Мутации p.P190L и p.R217C выявлены также у женщин африканского происхождения. Варианты p.P190L и p.R268Q являются слишком редкими, поэтому невозможно получить достоверные оценки риска развития рака груди. Анализ частоты мутаций p.G84E и p.R217C в гене HOXB13 показал, что они не ассоциированы с риском развития рака молочной железы. Также не выявлено ассоциации с разными подтипами РМЖ
С использованием современной технологии массового параллельного секвенирования у женщин с РМЖ/РЯ был проведен поиск патогенных вариантов генов, ответственных за развитие онкологического заболевания.
Инсерция c.180dupT в гене PLEKHG7 (Plecstrin homology domain-containing protein, family G , member 7) в гетерозиготном состоянии определена у 35 летней пациентки с протоковой карциномой молочной железы. РМЖ также диагностирован у матери пробанда. Скрининг варианта PLEKHG7*c.180dupT у 800 пациенток с РМЖ не выявил дополнительных носителей этого мутантного варианта.
По данным dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/), вариант c.180dupT (rs769642940) является редким и его частота составляет 0.000048 (TOPMED), 0.00005 (ExAC) и 0.000052 (GnomAD_exomes). Предположительно, он имеет патогенное клиническое значение.
К сожалению, информация, представленная в научной литературе, ограничена в области исследований роли PLEKHG7 в туморогенезе молочной железы, но в одной из работ было продемонстрировано, что PLEKHG7 может выступать в качестве опухолевого супрессора при развитии остеосаркомы [Both et al., 2014]. Известно, что PLEKHG7 стимулирует обмен гуаниловыми нуклеотидами, связанными с ГТФазой семейства Rho. В нормальных клеточных физиологических условиях концентрация ГТФ выше таковой чем у ГДФ, предпочтительна замена ГДФ на ГТФ в ассоциации с ГТФазой. Домен - Pleckstrin homology domain (PH domain) характерен для многих белков, вовлеченных в передачу сигналов внутри клетки или в качестве компонентов, формирующих цитоскелет. Этот домен может связывать липиды фосфатидилинозитола в биологических мембранах (таких как фосфатидилинозитол (3,4,5) -трифосфат и фосфатидилинозитол (4,5) -бифосфат) и белки, такие как бетагамма-субъединицы гетеротримерных G-белков или протеин киназа C. Благодаря этим взаимодействиям PH домены играют определенную роль в формировании комплекса белков различных мембран, определяя, таким образом, взаимодействие разных компонентов клетки через передачу сигналов [Scheffzek and Welti, 2012].

Рак почки (РП) – это гетерогенная группа злокачественных опухолей, подавляющее большинство которых представляют собой почечно-клеточные карциномы различных морфологических типов. Ежегодно в мире регистрируют более 300 тысяч новых случаев РП [Mohammadian et al., 2017]. В 2018 г. в России опухоли почки были первично диагностированы у 23 908 пациентов, а прирост показателя заболеваемости с 2008 по 2018 г. составил 43,43 %. В Республике Башкортостан в 2018 году показатель заболеваемости раком почки составил 641,3 на 100 тысяч населения [Каприн А.Д., Старинский В.В., 2019]. Среди опухолей мочеполовой системы РП занимает третье место, а по смертности находится на первом [Mohammadian et al., 2017]. Несмотря на интенсивные исследования процессов канцерогенеза и бурно развивающееся фармакологическое направление по разработке противоопухолевых таргетных препаратов, рак почки занимает третье место среди опухолей мочеполовой системы по частоте встречаемости, а по смертности находится на первом. Наиболее распространенным гистологическим типом РП является светлоклеточный рак (СРП), составляющий около 60–85% всех случаев этого заболевания. Для СРП характерны высокая молекулярно-генетическая гетерогенность, метастатическая активность и неблагоприятный прогноз. Отличительной чертой метастазирования при СПР является его непредсказуемость. На момент установления диагноза «рак почки» метастазы определяются примерно в 25 % случаев, примерно у половины пациентов болезнь приобретает системный характер в разные сроки после оперативного лечения [Матвеев В.Б., 2006]. При последующем наблюдении больных с локализованным или местно-распространенным процессом метастазы возникают у 30% пациентов [Jemal et al., 2003].
Метастазирование опухоли является одной из основных причин смертности от рака почки, в связи с чем особый интерес приобретает изучение молекулярных механизмов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), поскольку инвазивный рост опухоли становится возможным в результате того, что злокачественно измененные клетки отделяются от опухолевого массива из-за снижения или полной потери молекул межклеточной адгезии и, как следствие, приобретают способность к аномально высокой подвижности, позволяющей преодолевать жесткие структурные элементы окружающей стромы [Ковалев А.А., 2012; Крахмаль Н.В., 2015]. При этом в процесс инвазии активно включаются различные молекулярные и клеточные механизмы, которые, согласно опубликованным данным, зависят непосредственно от ЭМП. В настоящее время известно, что ЭМП лежит в основе процессов эмбриогенеза, воспаления и регенерации тканей и, несомненно, играет ключевую роль в механизмах канцерогенеза [Tam W.L., Weinberg R.A., 2013]. Понимание процесса ЭМП и участвующих в нем факторов поможет создать теоретическую основу для разработки новых подходов к рациональной терапии рака, в частности для предотвращения опухолевой инвазии и метастазирования – главных специфических особенностей злокачественного роста.
Исследования метастазирования при онкологических заболеваниях, в том числе при онкоурологических, активно ведутся специалистами разного профиля во всем мире. Нерешенными в нашей стране остаются вопросы эффективности и целесообразности различных вариантов лекарственного лечения метастатического РП, что определяет назначение малоэффективных препаратов и схем терапии. Практически отсутствует подход к выбору лечебной тактики на основании определения прогностических групп [Алексеев Б.Я с соавт., 2012]. Высокий метастатический и инвазивный потенциал РП обусловливает необходимость разработки системы маркеров, способных предсказать развитие опухоли в сторону метастазирования, что позволит своевременно назначать препараты, целенаправленно воздействующие на процессы метастазирования и инвазии и определять тактику лечения больных. В настоящее время известно, что метастазирование не сводится к пассивному распространению клеток первичной опухоли в другие органы по кровеносным и лимфатическим сосудам. В метастазировании наиболее значимы три процесса: изменение биохимии, морфологии и миграционных способностей опухолевых клеток; появление на поверхности рецепторов, обеспечивающих направленную миграцию к органам-мишеням; формирование в органе-мишени специфического окружения, в которое метастатические клетки могут попасть, выжить и размножиться. В обеспечение этих особенностей вовлечены специфические гены и сигнальные пути [Брага Э. с соав., 2016].
Поскольку в метастазировании задействованы биохимические механизмы общего значения, в регуляции соответствующих генов важную роль играют микроРНК, которые участвуют в системных механизмах регуляции [Chan S.H.et al., 2015]. В последние годы идентифицировано несколько факторов транскрипции (Snail, Slug, Twist, ZEB1, ZEB2), являющихся индукторами ЭМП и образования метастазов [Li, L. & Li, 2015]. Показано, что микроРНК-205 и семейство микроРНК-200 (микроРНК-200а, микроРНК-200b, микроРНК-200c, микроРНК-141 и микроРНК-429) являются эпителиальными маркерами и репрессорами ЭМП [Wang X. et al., 2013]. Члены семейства микроРНК-200 функционируют, содействуя мезенхимально-эпителиальному переходу (процессу, обратному ЭМП) и ингибируют индукцию ЭМП путем воздействия на мРНК, кодирующих ZEB1 и ZEB2. И наоборот, ZEB1 репрессирует транскрипцию генов микроРНК-200 за счет непосредственного связывания с их промоторной областью.
Роль семейства микроРНК-200 в регуляции ЭМП также недавно описано при раке почки [Wang X. et al., 2013]. Тем не менее, точная роль ЭМП при метастатическом каскаде почечно-клеточных карцином остается плохо изученной. Известно только, что изменения в регуляторной сети микроРНК являются критическими для индукции ЭМП.
Учитывая то, что в настоящее время не существует генетических маркеров прогноза метастазирования опухоли почки, актуальным является создание системы прогностических маркеров для формирования групп лиц, имеющих повышенный риск инвазивного роста опухоли с целью планирования необходимых профилактических мероприятий и выбора тактики лечения. За отчетный период проведен анализ литературных данных и выбраны полиморфные варианты в генах предшественников микроРНК, генах биосинтеза и процессинга микроРНК и сайтах связывания микроРНК с мишенью с использованием баз данных Национального центра биотехнологических информаций (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org), полиморфизма сайта связывания микроРНК (http://compbio.uthsc.edu/miRSNP/miRSNP_detail_all.php) и сформирована панель для проведения генотипирования с использованием технологии микрочипов QuantStudio™12K Flex Real-Time PCR System, содержащей ~100 полиморфных локусов.
Революционным достижением в области онкологии является появление новых препаратов для лечения онкологических заболеваний - ингибиторов контрольных точек иммунитета (ИКТИ, check-point inhibitors) - является. У некоторых больных эффект после применения данной группы препаратов может сохраняться длительное время, значительно увеличивая продолжительность жизни пациентов по сравнению с ранее проводимым лечением. К сожалению, выявлена проблема, демонстрирующая, что только у 15-40% пациентов лечение препаратами ИКТИ эффективно. В настоящее время маркером оценки эффективности препаратов ИКТИ считается высокая экспрессия PD-L1, однако, данный маркер не является специфичным, иногда при высоком уровне его экспрессии пациенты не отвечают на лечение, и в то же время описаны случаи, когда при низкой экспрессии PD-L1 препарат является эффективным для некоторых пациентов. Тем не менее, других маркеров, которые могли бы свидетельствовать об эффективности терапии ИКТИ, предсказывать риск развития резистентности к терапии, не существует. В связи с этим, актуальным является поиск маркеров для контроля эффективности лечения пациентов с раком почки препаратами ИКТИ на основе комплексного генетического и эпигенетического анализа опухоли и ее микроокружения.
Учитывая вышеизложенное, в соответствие с поставленной задачей проекта, для поиска маркеров эффективности терапии ИКТИ за отчетный период сформирована коллекция образцов венозной крови и выделена ДНК 40 пациентов с метастатическим раком почки, получающих терапию ингибиторами контрольных точек иммунитета (ИКТИ), а также 100 индивидов контрольной группы, первостепенные родственники которых не имели онкологических заболеваний.

Рак легкого является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний и основной причиной смертности от них во всем мире. Мелкоклеточный рак легкого (МРЛ) составляет около 15–20% всех случаев рака легкого и относится к наиболее злокачественно текущим онкопатологиям, характеризуется коротким анамнезом, быстрым течением, имеет тенденцию к раннему метастазированию [Kato et al. 1969; Jackman and Johnson, 2005]. Пятилетняя выживаемость при данном заболевании составляет <7% [Shepherd et al. 2007].
Как правило, МРЛ выявляется уже на стадии распространенного процесса, и, тем не менее, характеризуется высокой первичной чувствительностью к цитотоксической терапии. Однако, по истечении 6-12 месяцев, у большинства пациентов развивается резистентность. Несмотря на многочисленные клинические исследования новых лекарственных препаратов, призванных улучшить терапию МРЛ, положительных результатов достичь не удается, и на протяжении 30 лет режимы лечения данной патологии остаются неизменны. С целью увеличения продолжительности ответа на лечение крайне необходима тщательная молекулярно-генетическая характеристика МРЛ. Обнаружение генетических и эпигенетических нарушений, свойственных данной патологии, будет способствовать выявлению новых терапевтических мишеней. Кроме того, изменения на молекулярно-генетическом уровне возникают раньше гистологических, и потому могут быть использованы в диагностических целях.
Генетические исследования МРЛ, как и других эпителиальных опухолей, выявили многочисленные хромосомные перестройки. Кроме того, данный вид рака характеризуется высокой частотой мутаций, что, по-видимому, связано с воздействием мутагенов табачного дыма. В большинстве случаев МРЛ обнаруживаются делеции участков, которые содержат гены-супрессоры опухолей (3p, 5q, 13q, 17p), амплификация участков, содержащих различные онкогены (1p, 2p, 3q, 5p, 8q и 19p), соматические мутации в генах факторов транскрипции, ферментов, вовлеченных в модификации хроматина, рецепторов тирозинкиназ и других белков [Sabari et al., 2017].
В частности, в области 3р локализован ген ломкой гистидиновой триады FHIT, уровень экспрессии которого имеет прогностическое значение в отношении выживаемости больных МРЛ. Также в этой области находится еще один ген супрессора опухолевого роста – RASSF1A. Данный ген кодирует белок, участвующий в регулировании клеточного цикла, апоптозе и стабильности микротрубочек. Более чем в 90% МРЛ наблюдается инактивация гена RASSF1A гиперметилированием промотора [Huang et al., 2014]. Ряд исследований свидетельствует о полном подавлении у больных МРЛ экспрессии гена FUS1, участвующем в индукции G1-ареста и апоптоза. Кроме того, у 72% больных МРЛ выявляется сниженная экспрессия гена супрессора опухолей RARb.
Также следует отметить высокую частоту мутирования у больных МРЛ гена PIK3CA, участвующего в клеточном сигналлинге и ангиогенезе [Wakuda et al., 2014].
У подавляющего большинства больных с МРЛ выявляются потери и различные мутации (делеции, нонсенс-мутации, нарушения сплайсинга) гена онкосупрессора ретинобластомы RB1. Кроме того, по данным полногеномных исследований, у более чем 90% больных МРЛ выявляются мутации в гене супрессора опухолей TP53 (большинство – миссенс-мутации в ДНК-связывающем домене, а также гомозиготные делеции). В 40-70% случаев изменяется экспрессия данного гена [Wistuba et al., 2001; Sato et al., 2007]. Ген TP53 локализован в области 17p13.1 и кодирует транскрипционный фактор р53, запускающий в ответ на повреждения ДНК остановку клеточного цикла. Показано, что примерно в 50% случаев онкопатологии наблюдаются мутации в данном гене, при этом частоты таких повреждений варьируют в зависимости от типа опухоли. Известно, что мутации в TP53 могут приводить к изменению его конформации, экспрессии и увеличению периода полураспада в клетках, что повышает интерес к ним как к потенциальным мишеням иммунотерапии. Мутированный р53 может связываться с диким типом р53 и менять его структуру и свойства. Потеря функции р53 приводит к нарушениям репарации ДНК и накоплению мутаций в делящихся клетках [Stricker et al., 2010].
Методом мультиплексной амплификации лигированных зондов (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) проведен поиск делеций и дупликаций в области 17p13, содержащей ген-супрессор опухолей TP53, в образцах опухолевой ткани, фиксированной в формалине и залитой в парафин, полученной от 70 больных с гистологически подтвержденным диагнозом «мелкоклеточный рак легкого». Результаты проведенного исследования показали, что 40% изученных образцов ДНК больных имели делеции или дупликации как минимум одного экзона гена TP53. Большинство выявленных дупликаций и делеций происходили в первом и 11-м экзонах гена, соответственно. Однако либо делеция, либо дупликация были обнаружены во всех экзонах гена TP53, кроме третьего. Всего, дупликации были выявлены у 16 образцов, делеции – у 12. Также у одного образца выявлены одновременно и делеции и дупликация в гене TP53.
Помимо делеции 11-го экзона гена TP53, обнаруженной у пяти образцов, частыми были делеции 4-6-го экзонов, выявленные у четырех образцов. Наибольшее число делеций, с 4-го по 6 и с 8-го по 11-й экзоны, выявлено у двух образцов. Все выявленные делеции носили гетерозиготный характер. Из 16 образцов, имеющих дупликации в гене TP53, у 15 выявлены дупликации первого экзона. У двух образцов помимо дупликации первого обнаружены дупликации второго экзона, а у одного – дупликация пятого экзона, кроме того, у одного образца выявлены одновременно дупликации в четвертом, седьмом и десятом экзонах гена TP53.
Хромосомные нарушения в области 17p13 характерны для различных видов раков, в том числе рака прямой кишки, мочевого пузыря, молочной железы и мезотелиомы. Показано, что у подавляющего большинства больных мелкоклеточным раком лёгкого выявляются мутации гена TP53, локализованного в области 17p13, в связи с чем предполагается, что он участвует в развитии данной патологии. Проведенный анализ показал, что в гене TP53 наиболее частыми являются мутации первого экзона. Он является некодирующим, тем не менее, в нескольких исследованиях обнаружено, что данный экзон может играть значительную роль в регуляции экспрессии гена на уровне трансляции белка [Bazrafshani et al., 2015]. Рядом авторов выявлены частые делеции с 5-го по 8-й экзоны гена TP53 у больных раком мочевого пузыря [Berggren et al., 2001]. Известно, что область с 4-го по 8-й экзон содержит ДНК-связывающий домен гена TP53. Показано, что выявляемые в данном регионе мутации ассоциированы с более низкой выживаемостью больных с В-клеточной лимфомой [Peroja et al., 2018]. Следует отметить, что миссенс-мутации TP53 приводят к увеличению периода полураспада белка, а также могут являться предиктивным маркером в отношении ответа на различные агенты, вызывающие повреждение ДНК, что позволяет рассматривать их как потенциальные терапевтические мишени [Liu et al., 2002].
Таким образом, более трети из исследованных образцов имели структурные изменения в кодирующих областях гена TP53. Наиболее частыми событиями являлись дупликации первого экзона, выявленные у 23% образцов, и делеции с четвертого по шестой и 11-го экзонов гена TP53, выявленные у 17% образцов.

По данным Всемирной организации аллергии, около 30-40% населения мира страдают различными аллергическими заболеваниями [http://www.worldallergy.org]. Бронхиальная астма (БА), аллергический ринит (АР) и атопический дерматит (АД) (атопическая триада) – три распространенных, взаимосвязанных между собой аллергических заболевания, часто трансформирующихся из одного в другое и сопутствующих друг другу. Доказательствами взаимосвязи БА, АР и АД служат многочисленные результаты исследований: 30-40% больных АР имеют БА, а клинические проявления АР встречаются более чем у 80% больных атопической БА [Casale T.B. et al., 2004]. Одним из самых исследуемых аллергических заболеваний является БА.
Бронхиальная астма представляет собой гетерогенное заболевание, характеризующееся хроническим воспалением дыхательных путей, наличием респираторных симптомов, которые варьируют по времени и интенсивности и проявляются вместе с вариабельной обструкцией дыхательных путей [GINA, 2020]. По эпидемиологическим данным в мире более 300 млн больных БА, а распространенность заболевания варьирует от 1 до 18% [GINA, 2020]. Распространенность БА в РФ среди взрослых составляет 6,0-6,9 %, среди детей и подростков – 8-10 % [Chuchalin A.G. et al., 2014; Ильина Н. И. и др., 2017]. БА формируется при взаимодействии генетических, эпигенетических и средовых факторов, при этом наследуемость заболевания варьирует от 36% до 77% [March M. E. et al., 2015; Davidson E.J. et al., 2018].
В настоящее время активно изучаются эпигенетические механизмы патогенеза БА. Наиболее изучены такие процессы как метилирование ДНК, модификации гистонов, дифференциальная активность микроРНК, которые позволяют более подробно объяснить значительный вклад наследственности в формирование БА [Menzella F. et al., 2016; Kabesh M. et al., 2016]. Проведен ряд масштабных эпигенетических исследований БА с использованием полногеномного анализа метилирования (EWAS) в результате которых выявлены дифференциально метилированные участки промоторных областей генов, ассоциированные с риском развития и особенностями течения БА [Stefanowicz D. et al., 2012; Liang L. et al., 2015; Yang I.V. et al., 2015; Somineni H.K. et al., 2016; Langie S. et al., 2016; Hong X., et al. 2016; De Vries A. et al., 2017; Hoang T.T. et al., 2020 и др.].
Большое число современных исследований посвящено изучению роли малых некодирующих РНК (микроРНК). МикроРНК участвуют в процессах созревания, пролиферации и дифференцировки клеток дыхательной и иммунной системы, являются основными регуляторами иммунного ответа организма, продукции антител и высвобождении медиаторов воспаления [Баулина Н.М. и др., 2016; Mondejar-Parreno G. et al., 2019; Shefler I. et al., 2019].
В результате секвенирования РНК клеток гладкой мускулатуры дыхательных путей с БА и здоровых людей выявлена дифференциальная экспрессия 26 микроРНК, обнаружено 38 мРНК, подавление которых может быть использовано при таргетной терапии БА [Alexandrova E. et al., 2016]. При полногеномном анализе экспрессии микроРНК бронхоэпителиальных клеток больных с тяжелой формой БА (Frac-seq) обнаружен ряд микроРНК (miRNA-22-5p, miRNA-148a-3p, miRNA-342-3p, miRNA-495-3p, miRNA-543, miRNA-197-3p), активность которых подавляет снижение экспрессии мРНК интерлейкина-6, вызванное использованием ГКС [Martines-Nunes R.T. et al., 2018]. Установлено значительное повышение экспрессии miRNA-221 и дифференциальная экспрессия 83 микроРНК в лимфоцитах периферической крови детей с БА. Показано, что miRNA-221 снижает активность белка Spred-2, участвующего в активации факторов роста [Liu F. et al, 2012], а подавление miRNA-221 приводит к уменьшению степени воспаления дыхательных путей [Qin H.B. et al., 2012]. Установлена повышенная экспрессия 88 микроРНК и сниженная экспрессия 41 микроРНК в моноцитах крови пациентов с БА, наиболее низкий уровень экспрессии обнаружен для miRNA-29c. При проведении функциональных исследований показано, что трансфекция антагомира anti-miRNA-29c в макрофагах усиливает экспрессию рецептора гамма, связанного с рецептором ретиноевой кислоты ROR-γt и фактором транскрипции GATA-3 в CD4-клетках и повышает уровни интерлейкинов IL-4 and IL-17 в супернатанте [Zhang X. et al., 2018]. Установлено значительное увеличение экспрессии miRNA-1248 в сыворотке пациентов с БА по сравнению с контрольной группой, miRNA-1248 связываясь с 3'-нетранслируемой областью IL-5 приводит к увеличению экспрессии IL-5 [Panganiban R.P. et al., 2012]. Обнаружена пониженная экспрессия микроРНК hsa-miRNA-15a, подавляющей экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста-A (VEGFA), в CD4 + T-лимфоцитах периферической крови пациентов с БА [Nakano T. et al., 2013]. Выявлена более низкая экспрессия 3-х микроРНК (miRNA-22-3p, miRNA 513a-5p и miRNA-625-5p), полученных из периферической крови пациентов с БА, подавляющих активность генов убиквитин-лигазы (CBL), гена коактиватора 1a рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом типа b (PPARGC1B) и гена рецептора эстрогена альфа (ESR1), участвующих в регуляции иммунного ответа и пути активации воспалительных цитокинов [Dong X. et al., 2016]. Обнаружена пониженная экспрессия микроРНК-1 и дисбаланс Th1/Th2 клеток в периферической крови детей с обострением БА, причем более сильные изменения отмечаются с увеличением степени тяжести заболевания [Tian M. et al., 2018]. Показано, что экспрессия miRNA-199a-5p в плазме и мокроте пациентов с нейтрофильной БА отрицательно коррелируют с ОФВ1, ФЖЕЛ, пиковой объемной форсированной скоростью выдоха (ПОС) [Huang Y. et al., 2018].
Обнаружен ряд однонуклеотидных полиморфных вариантов в генах микроРНК и таргетных генах сайтов связывания микроРНК, влияющих на активность экспрессии генов и возможность взаимодействия с целевыми мРНК, которые играют определенную роль в патогенезе БА [Neha S.D. et al., 2016; Trinh H.K.T. et al., 2017]. Установлена ассоциация аллелей полиморфных вариантов предшественников микроРНК hsa-miRNA-146a (rs2910164*С) и hsa-miRNA-149 (rs2292832*T) с более низким риском развития БА у больных из Китая [Su X.W. et al., 2011]. Обнаружена ассоциация аллельных вариантов микроРНК-133a-1 (rs8089787*C и rs9948906*С), аллеля rs1707*С пре-микроРНК-152 с риском развития БА у пациентов с из Китая [Zhou P.P. et al.,2016]. Показана ассоциация генотипа rs11614913*СС полиморфного варианта микроРНК-196a2 с тяжелой формой БА и высокой частотой случаев обострений БА у детей из Египта [Hussein M. H. et al., 2016]. Выявлена ассоциация генотипов rs11614913*СС и rs11614913*CТ микроРНК-196a2 с эозинофильной БА и более высоким содержанием эозинофилов в мокроте по сравнению с носителями генотипа rs11614913*ТТ у пациентов с БА из Кореи [Trinh H.K.T. et al., 2017]. Одной из наиболее исследованных является микроРНК-155, дифференциальная экспрессия которой обнаружена в различных культурах клеток и тканей дыхательных путей. МикроРНК-155 является ключевым регулятором врожденных лимфоидных клеток 2 типа ILC2, определяющим активность действия IL-33. Показано, что внутривенное введение антагомира микроРНК-155 подавляет экспрессию CLTA4, повышает пролиферативный ответ Th-клеток у мышей с аллергической БА [Zhang Y. et al., 2017]. Выявлен более низкий уровень miRNA-155 в мокроте пациентов с аллергической БА по сравнению со здоровым контролем [Malmhall C. et al., 2017]. Обнаружено, что микроРНК-155 подавляет экспрессию циклооксигеназы-2 COX-2 и секрецию простогландина Е2 PGE2, снижает чувствительность бета-2-адренорецепторов у пациентов с БА [Comer B.S. et al., 2015].
Однако, опубликованные данные о патогенетической значимости микроРНК в развитии БА немногочисленны и часто не учитывают эндотипы и фенотипы заболевания, этнические различия исследуемых групп. Таким образом, в настоящее время актуальным является проведение эпигенетических исследований БА на различных выборках пациентов с учетом фенотипов и эндотипов заболевания.
За отчетный период проведен анализ литературных данных и выбраны полиморфные варианты в генах предшественников микроРНК, генах биосинтеза и процессинга микроРНК и сайтах связывания микроРНК с мишенью с использованием баз данных Национального центра биотехнологических информаций (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org), полиморфизма сайта связывания микроРНК (http://compbio.uthsc.edu/miRSNP/miRSNP_detail_all.php) и сформирована панель для проведения генотипирования с использованием технологии микрочипов QuantStudio™12K Flex Real-Time PCR System.
Одной из важнейших проблем современной медицины является недостаточно эффективный контроль симптомов БА и других аллергических заболеваний (аллергического ринита, атопического дерматита), который значительно снижает качество жизни пациентов и приводит к развитию более тяжелой формы заболевания. Эффективность лекарственной терапии аллергических заболеваний во многом определяется генетическими факторами, которые необходимо учитывать при определении тактики лечения. В последние годы активно проводятся фармакогенетические исследования БА, направленные на изучение генов, принимающих участие в метаболизме лекарственных препаратов, применяемых для лечения аллергического воспаления (глюкокортикостероидов, β2-агонистов, антилейкотриенов, антигистаминных препаратов и др.).
Согласно результатам фармакогенетических исследований показано, что 50-60% вариабельности в эффективности использования лекарственных средств определяется генетической предрасположенностью [Isidoro-García M. et al., 2017; Farzan N. et al., 2017]. Современные фармакогенетические исследования БА проводятся с использованием полногеномных анализов ассоциации (GWAS), с помощью анализа полиморфных вариантов генов-кандидатов и других современных подходов. Множество работ посвящено изучению генов, участвующих в метаболизме основных групп лекарственных препаратов, применяемых для лечения аллергического воспаления (глюкокортикостероидов, бета-2-агонистов, антилейкотриенов, антигистаминных препаратов и др.) [Tantisira K.G. et al., 2004, Брянцева О.Н. и др. 2006; Жданова М.В. и др., 2008; Telleria J.J. et al., 2008; Tantisira K.G. et al. 2009; García-Martín E., 2009; Szczepankiewicz A. et al., 2010; Pietras T. et al., 2011; Simon T. et al., 2012; Mougey E.B. et al., 2013; Миронова Ж.А., и др. 2013; Panek M. et al. 2013; Kmyta V. et al., 2015; Awasthi S. et al., 2015, Raje N. et al., 2015, Keskin O. et al., 2016; Slankard M. et al. 2016; Федорова Ю.Ю., Карунас А.С. и др. 2019; Савельева О.Н., Карунас А.С. и др. 2020].
Целью данного этапа проекта явилось изучение роли полиморфных вариантов генов аргиназ, участвующих в метаболизме широко применяемых противоастматических препаратов - бета-2-агонистов (ARG1, ARG2) и генов, участвующих в метаболизме гистамина (HRH1, HRH2, HRH3 и HRH4), в развитии бронхиальной астмы.
В работе использованы образцы ДНК 430 неродственных индивидов, проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ), в возрасте 2-17 лет. Группу пациентов составили 236 больных БА (70 девочек, 166 мальчиков) различной этнической принадлежности (русские – 84, татары – 108, башкиры – 44). Все обследованные являлись пациентами детского отделения Клиники ФГБОУ ВО «Башкирского государственного медицинского университета» Минздрава России и аллергологического отделения ГБУЗ «Республиканской детской клинической больницы» г. Уфы. Основным критерием включения детей в группу наблюдения явился установленный ранее диагноз БА в соответствии с критериями GINA (Global Initiative for Asthma) и критериями отечественных программных документов по диагностике, лечению и профилактике БА [Национальная программа, под редакцией Чучалина А.Г., 2012].
Оценка показателей функции внешнего дыхания была проведена на компьютерном спирографе «Erich Jaeger» (Германия) с анализом кривой «поток-объем». Оценивались следующие показатели: жизненная емкость легких (ЖЕЛ), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за 1 сек. (ОФВ1), максимальные объемные скорости потока кривой в точках, соответствующих объему легких 75%, 50%, 25% ФЖЕЛ (МОС75, MOC50, МОС25, соответственно). Градации нормы и снижение параметров спирограммы в % от долженствующей величины для детей до 18 лет оценивались по Клементу Р.Ф. и Зильберу Н.А. [Клемент Р.Ф. и Зильбер Н.А., 1993]. Оценка степени контроля БА на фоне проводимой не менее 3-х месяцев терапии проводилась на основании клинических признаков за последние 4 недели (частота дневных симптомов и частота ночных пробуждений в неделю, потребность в препаратах для купирования приступов в неделю, ограничение активности из-за БА) с использованием валидизированного вопросника «Тест по контролю над астмой» (Asthma Control Test, АСТ). В качестве контроля исследована группа практически здоровых детей без бронхолегочных, аллергических и аутоиммунных заболеваний, с неотягощенной наследственностью в отношении аллергических заболеваний, с низким уровнем IgE, состоящая из 194 человек (119 девочек, 75 мальчиков) соответствующей этнической принадлежности (русские – 75, татары – 83, башкиры – 36). Все дети с 15 лет, участвующие в исследовании, и родители детей младше 15 лет дали информированное согласие на участие в исследовании. Протокол исследования одобрен локальным биоэтическим комитетом ИБГ УФИЦ РАН (протокол № 7 от 10.02.2011 г.).
Молекулярно-генетическое исследование выполнено с помощью современных высокотехнологичных методов. Выделение ДНК из крови проведено методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew C.C., 1984]. Анализ полиморфных вариантов генов выполнен с помощью методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК, рестрикционного анализа, ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией (FLASH/RTAS), c использованием систем для ПЦР в реальном времени (QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США); BioRad CFX96 (США); LightCycler® 96 (Roche, Швейцария/Германия)).
Cтатистическая обработка результатов исследования проведена с использованием пакета программ статистического анализа SPSS v.23, PLINK 1.07, с применением программного обеспечения Microsoft Exсel, с использованием параметрической и непараметрической статистики в зависимости от шкал и характера распределения переменных с помощью программы GraphPad Prism 6 (http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/). Для проверки соответствия наблюдаемого распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению по закону Харди-Вайнберга использовался критерий x2. При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля применялся критерий x2 для таблиц сопряженности 2×2 с поправкой Йейтса на непрерывность. В случае наличия достоверных отличий в исследуемых выборках проводилась оценка показателя отношения шансов (odds ratio, OR), а также границ его 95% доверительного интервала (CI95%). Анализ межгенных взаимодействий проводился с помощью программы MDR v.3.0.2 (Multifactor–Dimensionality Reduction) [Ritchie M.D., 2001]. Неравновесие по сцеплению между парами полиморфных локусов оценивалось с помощью коэффициента D, предложенного Левонтином, и коэффициентом корреляции r2 Пирсона. Определение частот гаплотипов и тестирование различий в распределении частот гаплотипов в исследуемых выборках проводилось согласно EM-алгоритму, реализованному в программе Haploview 4.2 (https://www.broadinstitute.org/haploview/haploview).
За текущий отчетный период выполнен анализ литературных данных и информационных ресурсов (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/, http://www.ensembl.org, https://www.snpedia.com), на основании которого с учетом функциональной значимости и частоты встречаемости в европейских популяциях выбраны полиморфные варианты генов рецепторов гистамина (HRH1, HRH2, HRH3 и HRH4) и белков, участвующих в метаболизме бета-2-агонистов (ARG1, ARG2):
В группах больных БА и в соответствующих контрольных группах практически здоровых индивидов проведено исследование частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов ARG1 (rs2781667 (c.57+665C>T)), ARG2 (rs17249437 (c.185-8016T>C), rs3742879 (c.859+101A>G), rs7140310 (c.363-1623T>G)), HRH1 (rs901865 (c.-17T>C)), HRH2 (rs2067474 (c.-1018G>A)), HRH3 (rs3787429 (c.996G>C, p.Ser332=)), HRH4 (rs11665084 (c.413C>T, p.Ala138Val)). Распределение частот генотипов указанных полиморфных вариантов соответствовало распределению Харди-Вайнберга (p>0,05). Учитывая неоднородность населения Республики Башкортостан в этническом отношении, в исследуемые выборки включены индивиды наиболее многочисленных этнических групп Башкортостана: русских, татар и башкир. Проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов исследованных полиморфных локусов, как между контрольными группами различной этнической принадлежности, так и между выборками больных БА и соответствующего по происхождению и возрасту контроля. Проведен анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов с тяжестью БА, уровнем контроля течения заболевания, с показателями легочной функции по данным спирографии, с уровнем иммуноглобулина E.
Ген аргиназы ARG1. Ген, кодирующий аргиназу (ARG1), локализован на 6 хромосоме в области 6q23.2, состоит из 8 экзонов и расположенных между ними интронов. Аргиназа представляет собой фермент, катализирующий гидролиз L-аргинина с образованием орнитина и мочевины (Dimitriades et al., 2014). Два изофермента аргиназы I и II типа кодируются генами ARG1 и ARG2 (Vonk et al., 2010). Аллергическое воспаление вызывает снижение общего количества NO и увеличение продукции проконтрактильного и провоспалительного пероксинитрита (ONOO-), в частности iNOS, что приводит к обструкции, воспалению и увеличению гиперреактивности дыхательных путей. Кроме того, при аллергической БА под влиянием Th2-цитокинов (IL-4, IL-13) и TGF-β увеличивается экспрессия аргиназы, что повышает продукцию L-орнитина, полиаминов и L-пролина, участвующих в ремоделировании дыхательных путей, вызывая клеточную пролиферацию, повышенную выработку коллагена и фиброз клеток (Meurs et al., 2019).
При проведенном нами сравнительном анализе частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs2781659 гена ARG1 в группах больных БА и контроля русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, установлена ассоциация аллеля rs2781667*С с риском развития БА у индивидов татарской этнической принадлежности (р=0,04; OR=1,57; CI95% 1,02-2,41). Генотип rs2781667*TT и аллель rs2781667*T полиморфного варианта гена ARG1 являются маркерами пониженного риска развития БА у татар (р=0,03; OR=0,38; CI95% 0,16-0,91 и р=0,04; OR=0,64; CI95% 0,41-0,98, соответственно).
Вклад аллельных вариантов изучаемых генов-кандидатов в вариабельность количественных признаков (уровень IgE, возраст начала заболевания) определяли с помощью критерия Краскела-Уоллиса (в случае трех групп) или Манна-Уитни (в случае двух групп). Проведенный нами анализ вариабельности уровня IgE у пациентов с различными генотипами полиморфного локуса rs2781667 гена ARG1 в группе русских с БА выявил более высокие показатели IgE у носителей генотипа rs2781667*CС по сравнению с носителями генотипов rs2781667*CT и rs2781667*TT. Выявлено статистически значимое повышение уровня IgE у носителей генотипа rs2781667*CС по сравнению с носителями генотипа rs2781667*CT (p=0,003).
По данным литературы, ассоциация аллельных вариантов гена ARG1 с эффективностью терапии БА впервые установлена в работе Litonjua A. с соавт. у детей с БА европейского происхождения, находящихся на терапии бета-2-агонистами, обнаружена значимая ассоциация аллеля rs2781659*G гена ARG1 с более выраженным бронходилатационным ответом, а ген ARG1 предложен в качестве возможного маркера риска, определяющего эффективность терапии БА [Litonjua et al., 2008]. В работе Vonk с соавт. наблюдалось значительное снижение бронходилатационного ответа у пациентов с БА из Нидерландов с генотипом rs2781667*TT гена ARG1 в ответ на терапию бета-2-агонистами. В то же время, у больных тяжелой БА с генотипом rs2781667*СС гена ARG1 было выявлено снижение показателей ОФВ1 на фоне лечения ИГКС [Vonk et al., 2010]. Установлена ассоциация аллеля rs2781666*T и гаплотипа CT (rs60389358, 2781666) гена ARG1 с риском развития БА и показан значительно более высокий уровень сывороточной аргиназы у пациентов c БА из Индии [Donthi et al., 2018]. Напротив, в некоторых исследованиях не обнаружено значимой ассоциации полиморфных вариантов гена ARG1 с эффективностью лечения БА [Almomani et al., 2019; Scaparrotta et al., 2019]. В совокупности полученные результаты и литературные данные подтверждают, что аллельные варианты гена ARG1 могут вносить вклад в риск развития БА и эффективность терапии заболевания.
Ген аргиназы ARG2. Ген ARG2 расположен в хромосомной области 14q24.1, состоит из 8 экзонов [Vonk et al., 2010]. При сравнении групп больных со здоровыми индивидами статистически значимых ассоциаций полиморфного варианта rs17249437 гена ARG2 с риском развития БА не обнаружено (p>0,05). Отличия в распределении частот генотипов rs17249437 выявлены при разделении пациентов с учетом отклонений от нормы параметров спирографии в сравнении с группой контроля. Частота гомозиготного генотипа rs17249437*TT (67,74% и 67,74%) у русских со значительными снижениями параметров ОФВ1 и МОС25 была статистически значимо выше, чем в контрольной группе индивидов (41,89%; p=0,02; OR=2,91; CI95% 1,2-7,05 и p=0,02; OR=2,91; CI95% 1,2-7,05, соответственно). Частота гетерозиготного генотипа rs17249437*TС у пациентов русской этнической принадлежности со значительно сниженными показателями ОФВ1 и МОС25 была ниже (19,35% и 22,58%), чем в контрольной группе (48,65%; р=0,005; OR=0,25; CI95% 0,09-0,69 и р=0,01; OR=0,31; CI95% 0,12-0,8, соответственно).
У русских пациентов с БА с частично-контролируемым и неконтролируемым течением заболевания, которым чаще 3-х раз в неделю требовались бета-2-агонисты для купирования симптомов заболевания, выявлена более высокая частота встречаемости аллеля rs17249437*Т (87,93%) и генотипа rs17249437*ТТ (82,76%), по сравнению с пациентами с контролируемым течением заболевания (67,27% для аллеля rs17249437*Т (р=0,004, OR=3,54 (CI95% 1,46-8,59)) и 43,64% для генотипа rs17249437*ТТ (р=0,0006, OR=6,20 (CI95% 2,06-18,64)). Аналогичная ассоциация обнаружена и у больных БА татарской этнической принадлежности. В группе пациентов с частично-контролируемым и неконтролируемым течением заболевания выявлялись чаще аллель rs17249437*Т (77,59%) и генотип rs17249437*ТТ (58,62%), по сравнению с больными БА с контролируемым течением заболевания - 60,26% для аллеля rs17249437*Т (р=0,02, OR=2,28 (CI95% 1,14-4,58) и 33,33% для генотипа rs17249437*ТТ (р=0,02, OR=2,83 (CI95% 1,18-6,80)).
Анализ ассоциаций полиморфного варианта rs3742879 гена ARG2 с развитием БА у индивидов различной этнической принадлежности не выявил статистически значимых различий между группами больных и контроля (p>0,05). При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs3742879 в группах пациентов с различными показателями спирографии установлено, что у русских, больных БА, со значительным снижением ОФВ1 генотип rs3742879*GG встречался значительно чаще (25,81%), чем в контрольной группе (9,33%, p=0,03; OR=3,38; CI95% 1,1-10,35).
При исследовании полиморфного варианта rs7140310 гена ARG2 не выявлено статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов между больными БА и контролем различной этнической принадлежности (p>0,05). Наименее распространенным во всех этнических группах является аллель rs7140310*С, обнаруженный в контрольной группе русских с частотой 14,67 %, у татар – 19,28 %, у башкир – 18,06 %.
В результате исследования полиморфных вариантов rs17249437, rs3742879, rs7140310, гена ARG2 в выборках различной этнической принадлежности выявлено значительное неравновесие по сцеплению между полиморфными локусами rs17249437 и rs3742879 (D’=0,76 у русских, D’= 0,85 у татар, D’= 0,9 у башкир) во всех изученных группах. При проведении гаплотипического анализа данных полиморфных вариантов гена ARG2 не обнаружено статистически значимых различий частот гаплотипов между больными БА и контрольной группой (p>0,05).
Полученные нами результаты противоречат данным работы Vonk с соавт., в которой выявлена ассоциация аллеля rs17249437*T, генотипа rs7140310*TT и аллеля rs3742879*G c более высокими значениями ОФВ1, а генотипа rs3742879*AA c увеличением гиперреактивности бронхов у взрослых пациентов с БА, проживающих в Нидерландах [Vonk et al., 2010]. Кроме того, наши данные частично не согласуются с данными исследования Батожаргаловой с соавт., по итогам которого показана ассоциация комбинации генотипов NOS2A*(CCTTTT)nS/L и rs3742879*AA гена ARG2 c повышенным риском развития БА у девочек из России [Батожаргалова и др., 2017]. В тоже время Salam с соавт. при исследовании полиморфных вариантов гена ARG2 обнаружили ассоциацию аллеля rs3742879*G в составе гаплотипа TAGTCATGGC (rs12885261, rs7144243, rs3759757, rs4902501, rs7156352, rs4902503, rs7140310, rs742869, rs3742879, rs10483801) со значительно более высоким риском возникновения заболевания у больных БА европейского происхождения [Salam et al., 2009]. Это может свидетельствовать о значимой роли аллельных вариантов гена ARG2 в развитии БА именно в структуре гаплотипа. В нашем исследовании полиморфных вариантов гена ARG2 в выборках различной этнической принадлежности выявлено значительное неравновесие по сцеплению между полиморфными локусами rs17249437 и rs3742879 во всех изученных группах. При проведении гаплотипического анализа данных полиморфных вариантов гена ARG2 значимых ассоциаций не обнаружено, что, возможно связано с малочисленностью сравниваемых групп.
Ген гистаминового рецептора 1 типа HRH1. Проведено исследование полиморфного варианта rs901865 (c.-17T>C) гена HRH1, расположенного в хромосомной области 3p25.3 и кодирующего H1-гистаминовый рецептор. Ген HRH1 экспрессируется в различных тканях и клетках, включая нервные, эндотелиальные, дендритные, эпителиальные клетки дыхательных путей и лимфоциты. Гистамин вызывает сокращение гладких мышц дыхательных путей, увеличивает проницаемость сосудов, индуцирует выработку простагландинов и факторов активации тромбоцитов, связываясь с HRH1. Показано, что многие немедленные реакции гиперчувствительности организма могут быть вызваны активацией гистаминового рецептора HRH1 [Chu J.T. et al., 2019, Micallef S. et al., 2016, Thangam E.B. et al., 2018]. По литературным данным, обнаружено значительное повышение экспрессии мРНК гена HRH1 после стимуляции гистамином мононуклеарных клеток периферической крови детей с аллергией [Kordulewska N., 2019].
Выполненный нами анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта rs901865 гена HRH1 выявил, что менее распространенным в контрольных группах детей русской, татарской, башкирской этнической принадлежности является аллель rs901865*T (16,0%, 10,98%, 12,5%, соответственно). Установлена ассоциация генотипа rs901865*CT и аллеля rs901865*T гена HRH1 с риском развития БА (р=0,01, OR=2,37, CI95% 1,21-4,64 и р=0,02, OR=2,04, CI95% 1,13-3,69), а также с неконтролируемым течением БА у индивидов татарской этнической принадлежности (р=0,004, OR=3,02, CI95% 1,39-6,57 и р=0,02, OR=2,18, CI95% 1,1-4,29). Генотип rs901865*CC и аллель rs901865*C гена HRH1 оказались маркерами пониженного риска развития БА (р=0,01, OR=0,42, CI95% 0,22-0,82 и р=0,02, OR=0,49, CI95% 0,27-0,89 соответственно) и неконтролируемого течения БА (р=0,01, OR=0,36, CI95% 0,17-0,77 и р=0,02, OR=0,46, CI95% 0,23-0,91) у татар.
При сравнительном анализе показателей функции внешнего дыхания выявлены статистически значимые ассоциации различных генотипов по данному локусу с показателями спирографии у татар. Частоты гетерозиготного генотипа rs901865*CT и аллеля rs901865*T гена HRH1 у больных БА татарской этнической принадлежности со значительно сниженными показателями МОС25 были статистически значимо выше (41,38% и 24,14%), чем в контрольной группе (19,51%, р=0,02, OR=2,91, CI95% 1,16-7,3 и 10,98%, р=0,01, OR=2,58, CI95% 1,19-5,6). Частоты генотипа rs901865*CC и аллеля rs901865*C (55,17% и 75,86%) гена HRH1 в выборках татар были значительно ниже, чем в контрольной группе (79,27%, р=0,01, OR=0,32, CI95% 0,13-0,80 и 89,02%, р=0,01, OR=0,39, CI95% 0,18-0,84, соответственно).
Согласно литературным данным, Anvari S. с соавт. обнаружена ассоциация генотипа rs901865*TT гена HRH1 c риском развития аллергической БА у детей [Anvari S. et al., 2015]. Установлено, что у индивидов из Китая, носителей аллеля rs901865*T гена HRH1, значительно повышен риск развития аллергического ринита. Выявлено, что у больных аллергическим ринитом, носителей генотипа rs901865*СС гена HRH1, использование H1-антигистаминных препаратов более эффективно, по сравнению с пациентами с генотипами rs901865*СT и rs901865*TT [Chu J.T., 2019]. В целом, полученные нами результаты и литературные данные подтверждают, что аллельные варианты гена HRH1 могут вносить вклад в риск развития БА у детей.
Ген гистаминового рецептора 2 типа HRH2. Выполнено исследование полиморфного варианта rs2067474 (c.-525-493G>A) гена HRH2, кодирующего гистаминовый рецептор HRH2 (5q35.2). HRH2 активно экспрессируется в В- и Т-лимфоцитах, дендритных, гладкомышечных клетках, а также в тканях головного мозга и сердца. При исследовании мышей, нокаутированных по гистидиндекарбоксилазе (HDC-/-), установлено, что недостаток гистамина может усиливать тканеспецифичное подавление экспрессии HRH2. Рецепторы HRH2 активно участвуют в продукции цитокинов Th1-типа, пролиферации Т-клеток и синтезе антител [Micallef S. et al., 2016, Thangam E.B. et al., 2018]. При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов нами не выявлено статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов данного локуса между группами больных БА и соответствующими по этническому происхождению группами контроля. Частота редкого аллеля rs2067474*A в контрольных группах детей русского, татарского, башкирского этнического происхождения составила 4,67%, 3,66% и 6,94%, соответственно.
По данным литературы, полиморфные варианты гена HRH2 ассоциированы с риском развития заболеваний многофакторной природы. Установлена ассоциация полиморфного локуса rs2241562 гена HRH2 с развитием сердечной недостаточности [Leary P.J., 2018]. Обнаружена ассоциация полиморфного варианта rs2067474 гена HRH2 с развитием атрофии слизистой оболочки желудка [Alonso N., 2015], а генотипа rs2067474*GG гена HRH2 — с риском развития рака желудка [Arisawa T., 2012]. Опубликованные данные свидетельствуют о роли полиморфных вариантов гена HRH2 в патогенезе различных многофакторных заболеваний, однако, по результатам проведенного нами исследования не обнаружено статистически значимых ассоциаций полиморфного локуса rs2067474 гена HRH2 с развитием и течением БА у детей.
Ген гистаминового рецептора 3 типа HRH3. В исследуемых группах больных БА и здоровых индивидов проведено генотипирование и последующий анализ ассоциации полиморфного варианта rs3787429 (c.996G>C) гена HRH3 (20q13.33) с развитием и течением БА. Рецепторы, кодируемые геном HRH3, являются пресинаптическими ауторецепторами гистаминовых нейронов и гетерорецепторами, отвечающими на нейротрансмиттеры, экспрессируются преимущественно в ЦНС и периферических нервах [Micallef S. et al., 2016]. Установлено, что нокаут гена HRH3 может приводить к усилению тяжести протекания нейровоспалительных заболеваний и усиливать экспрессию IFNγ-индуцируемого белка 10 (IP-10), хемокинов MIP2 и CXCR3 в Т-клетках [Thangam E.B. et al., 2018].
При исследовании полиморфного локуса rs3787429 гена HRH3 обнаружено, что менее распространенный аллель rs3787429*T встречался в контрольной группе детей русской этнической принадлежности с частотой 39,33%, у татар – 36,14%, у башкир – 41,67%. Не выявлено статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs3787429 между детьми, больными БА, и контрольными группами различной этнической принадлежности (p>0,05).
По литературным данным, обнаружена ассоциация полиморфного локуса rs6062144, расположенного в межгенной области вблизи гена HRH3, с БА [Ferreira M.A. et al., 2009]. He H.G. с соавт. выявлена ассоциация аллеля rs3787429*T гена HRH3 с пониженным риском развития хронической сердечной недостаточности у пациентов из Китая [He G.H. et al., 2016]. Установлена ассоциация полиморфного варианта rs752380770 гена HRH3 c повышенным риском развития мигрени у индивидов из Мехико [Millán-Guerrero R.O. et al., 2011].
Ген гистаминового рецептора 4 типа HRH4. Проведено исследование полиморфного варианта rs11665084 гена HRH4, расположенного на длинном плече 18-й хромосомы в области q11.2. HRH4 экспрессируется в различных клетках иммунной системы, участвует в хемотаксисе эозинофилов, тучных клеток и моноцит-производных дендритных клеток, контролирует высвобождение интерлейкина IL-16 из лимфоцитов человека. В настоящее время pецепторы HRH4 предполагаются в качестве потенциальной терапевтической мишени для лечения таких воспалительных заболеваний, как БА, атопический дерматит, воспалительные заболевания кишечника и др. [Micallef S. et al., 2016]. Показано, что стимуляция HRH4 приводит к усилению иммунного ответа, выработке цитокинов (IL-4, IL-5, IL-13, IL-1, IL-10 и IL-6) [Jemima E.A. et al., 2014]. Gu с соавт. выявлена ассоциация полиморфных вариантов rs77485247 и rs77041280 гена HRH4 со сниженной эффективностью использования препаратов блокаторов H1-гистаминовых рецепторов и повышенным риском возникновения побочных реакций у пациентов с аллергическим ринитом [Gu J. et al., 2017].
В данном исследовании установлено, что менее распространенным является аллель rs11665084*T, встречающийся в контрольной группе детей русской этнической принадлежности с частотой 10,0%, у татар – 12,05%, у башкир – 19,44%. Не обнаружено статистически значимых ассоциаций полиморфного локуса rs11665084 гена HRH4 с развитием и течением БА у детей.
По литературным данным, генотип rs11665084*СС гена HRH4 ассоциирован c более низким показателем максимального эффекта в ответ на использование гистамина по сравнению с исходным уровнем (Emax) у детей афроамериканского происхождения [Jones B.L. et al., 2016]. Установлена ассоциация полиморфных локусов rs527790, rs487202 и rs17187619 гена HRH4 с развитием инфекционно-зависимой БА у индивидов европейского происхождения [Simon T. et al., 2012].
У больных БА и в контрольной группе проведен анализ межгенных взаимодействий исследованных полиморфных локусов генов гистаминовых рецепторов HRH1, HRH2, HRH3, HRH4 в детерминации риска развития данного заболевания. Для выбора моделей использован алгоритм полного поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные сочетания генотипов в отношении риска развития БА, и алгоритм принудительного поиска (Forced search algorithm), при котором полиморфные локусы генов для исследования сочетаний генотипов выбирались вручную. Для каждой модели межгенных взаимодействий сравнивали частоты встречаемости генотипов взаимодействующих генов в выборках больных и контроля.
Выявлена статистически значимая модель из трех ДНК-локусов: генов HRH1 (rs901865), HRH3 (rs3787429) и HRH4 (rs11665084), взаимодействие которых лежит в основе предрасположенности к развитию БА у татар (p<0,0001). Тестируемая сбалансированная точность (Bal. Acc.) данной модели составила 0,65, чувствительность (Se) – 0,49, специфичность (Sp) – 0,82, воспроизводимость результата (CV Consistency) – 10/10. К сочетаниям повышенного риска развития БА были отнесены девять различных комбинации генотипов, из которых наиболее значимой оказалась: rs901865*CT/rs3787429*CT/rs11665084*CC (p=0,02, OR=4,35, CI95% 1,21–15,56).
Таким образом, в рамках данной работы проведено исследование полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме гистамина (HRH1, HRH2, HRH3, HRH4) и b2-агонистов (ARG1, ARG2), у больных БА и в контрольной группе индивидов, проживающих в Республике Башкортостан. Результаты проведенного исследования раскрывают определенные аспекты молекулярного патогенеза БА и свидетельствуют о вовлеченности полиморфных вариантов генов ARG1, ARG2, HRH1, HRH3, HRH4 в развитии бронхиальной астмы. Установлена модель ген-генных взаимодействий (HRH1-HRH3-HRH4), ассоциированная с развитием данного заболевания.

Наследственные спастические параплегии (НСП) – это генетически и клинически гетерогенная группа дегенеративных заболеваний нервной системы, обусловленных дистальным поражением длинных аксонов кортикоспинального тракта [Fink, 1997]. Клинически НСП проявляются спастичностью мышц нижних конечностей. Спастические параличи могут сочетаться с различными дополнительными симптомами - атрофией зрительных нервов, глухотой, атаксией, полинейропатией, эпилепсией, нарушением когнитивных функций и др. В зависимости от того, является ли основной симптом единственным или сочетается с другими неврологическими или экстраневральными симптомами, выделяют неосложнённые («чистые») или осложненные формы заболевания [Hazan, 1999]. Чрезвычайная клиническая гетерогенность НСП связана с разнообразными патогенетическими процессами, возникающими в нейронах: дефектами формирования мембранных органоидов, молекулярного транспорта, нарушением процессов миелинизиции, функций митохондрий, за которые ответственны мутации в различных генах. В настоящее время известно более 79 генов, связанных с различными типами наследования (http://www.neuromuscular.wustl.edu). Наиболее частыми причинами НСП являются мутации в генах, кодирующих белки внутриклеточного транспорта, а также белки локализации и формирования мембранных органоидов. В частности, мутации в генах спастина (SPAST), атластина (ATL1) и белка REEP1 обнаруживаются у АД НСП больных соответственно в 40% [Fonknechten et al., 2000], 10% [Namekawa et al., 2006] и 2,4% - 6,5% случаев [Zuchner et al., 2006; Hewamadduma et al., 2009].
В рамках настоящего проекта в семье пациента с аутосомно-доминантной спастической параплегией проведено секвенирование экзома по технологии NGS (“Next Generation Sequensing”). Данная семья была отобрана для исследования из имеющегося в лаборатории банка ДНК пациентов с НСП и их близких родственников (на сегодняшний день - 63-х неродственных семей), проживающих на территории Республики Башкортостан. Пациент и его ближайшие родственники были осмотрены сотрудниками кафедры неврологии с курсами нейрохирургии и медицинской генетики Башкирского государственного медицинского университета. Ранее у данного пациента в четырех указанных выше генах патогенные варианты нуклеотидных последовательностей, являющиеся причиной развития заболевания, выявлены не были, хотя нельзя было полностью исключить наличие мутаций в этих генах, поскольку их поиск частично был проведен прямым секвенированием, частично - методом SSCP-анализа, информативность которого составляет, примерно, 70%.
Полное секвенирование экзома проведено на секвенаторе MiSeq, Illumina. Биоинформатический анализ результатов NGS осуществлен с помощью набора утилит SAMtools, при этом в качестве референсной использована последовательность генома человека версии hg19 (Genome Reference Consortium Human Build 37). Далее проведен анализ полученных вариантов, представленных в файлах Variant Call Format. Обнаруженные варианты аннотированы с использованием средств программного пакета ANNOVAR (http://annovar.openbioinformatics.org), позволяющих сравнивать однонуклеотидные замены, а также инсерции и делеции, полученные в результате секвенирования, с рядом специализированных баз данных. Таким образом, предсказательная значимость выявленных изменений аннотирована с помощью in silico программ (MetaSVM, MetalR, PolyPhen-2, PhyloP, ClinVar) из dbNSFP v.3.0a. Также для аннотирования вариантов использованы инструменты SnpEff (http://snpeff.sourceforge.net), CADD (http://cadd.gs.washington.edu), SIFT (http://sift.bii.a-star.edu.sg), для получения дополнительной болезнь-специфичной информации - исследовательская платформа DisGeNET. Частоты вариантов оценены с использованием баз данных проекта «1000 Геномов», (http://www.1000genomes.org), базы данных проекта по секвенированию экзома (Exome Sequencing Project, ESP6500 (http://esp.gs.washington.edu/drupal/)), базы данных коалиции исследователей из различных крупномасштабных проектов секвенирования (Exome Aggregation Consortium, ExAC (http://exac.broadinstitute.org/)). Каждому варианту было сопоставлено до пяти значений частот, и для последующего анализа были отобраны варианты с частотой не более 0,05%. Также вариантам были сопоставлены идентификаторы баз данных dbSNP, доступ к которым осуществлен также с помощью ANNOVAR с использованием скриптов annotate_variation.pl, table_annovar.pl. Функциональные аннотации и частоты анализировались в комплексе, вместе с анализом имеющейся к данному моменту информации по исследуемому заболеванию. При анализе результатов в первую очередь рассматривались варианты, относящиеся к экзонам (кроме синонимичных замен), сайтам сплайсинга, а также некодирующим РНК, 5’- и 3’-нетранслируемой области. Поскольку в исследуемой семье прослеживается аутосомно-доминантный тип наследования НСП, для дальнейшего этапа исследования были отобраны гетерозиготные варианты.
В результате проведенного исследования у пациента (51.0) татарской этнической принадлежности с аутосомно-доминантной НСП был идентифицирован в гетерозиготном состоянии миссенс-вариант с.1246С>T (p.Arg416Cys) в 12-м экзоне гена атластина (ATL1), подтвержденный методом севенирования по Сэнгеру.
Выявленный вариант нуклеотидной последовательности зарегистрирован в контрольных выборках gnomAD, «1000G», ESP6500 и ExAc с частотой 0,000008128. Согласно данным предсказательных программ, нуклеотидный вариант с.1246С>T (p.Arg416Cys) расценивается как патогенная мутация.
Эта мутация может быть идентифицирована методом ПДРФ-анализа с использованием эндонуклеаз NgoMIV, Cac8I, NaeI и MwoI, для которых исчезает существующий в норме сайт рестрикции. Этим методом, с использованием рестриктазы MwoI (рис.3), мы провели поиск мутации с.1246С>T (p.Arg416Cys) у других членов семьи пациента с данной мутацией, в других неродственных семьях с НСП с неустановленной генетической причиной заболевания (35 семей), а также в контрольных выборках здоровых индивидов (150 чел.).
В семье обследуемого пациента нуклеотидная замена с.1246С>T в гене ATL1 была выявлена нами также у его больного сына, и не обнаружена у здоровой дочери.
В результате скрининга на наличие данной мутации в группе других, неродственных, пациентов с НСП мутация с.1246С>T была выявлена еще у двоих – у пациента русской этнической принадлежности (16.0) и пациентки метисного происхождения (мордва/ татарка) (41.0). К сожалению, другие родственники этих пациентов не были доступны для анализа. В контрольных популяционных выборках здоровых индивидов данная мутация не обнаружена.
В первоначально обследованной семье (51.0) был проведен анализ клинической картины у больных НСП членов. Пробанд, 1967 года рождения, с 10-12-летнего возраста отмечал затруднения при быстрой ходьбе и беге, связывал эти жалобы с особенностью строения стоп («плоские»). В конце второго - начале третьего десятилетия жизни пациента окружающие начали замечать изменение его походки: «шаркает ногами». Позднее, ближе к 40 годам, сам пациент стал отчетливо ощущать скованность в мышцах ног, приводящую к изменению походки и утомляемости при длительной ходьбе. При объективном осмотре больного выявлено повышение мышечного тонуса, преимущественно в мышцах – сгибателях голеней и стоп по спастическому типу до 3 баллов по шкале Ашворта, снижение мышечной силы до 4 баллов в проксимальных отделах ног. «Полые» стопы. Сухожильные рефлексы в ногах повышены, отмечаются клонусы обеих стоп и патологические стопные знаки сгибательного и разгибательного типов. Ходит самостоятельно, походка изменена по типу «лыжника». У сына пробанда 1990 года рождения отмечается подобное изменение походки, повышение мышечного тонуса в ногах до 1 балла, а также сухожильных рефлексов с ног, клонусы обеих стоп и патологические стопные знаки.
Ранее нуклеотидная замена с.1246С>T (p.Arg416Cys) была описана Orlacchio et al. (2011) и Magariello et al. (2012) как патогенная мутация, обусловливающая НСП формы SPG3A. Клиническая картина НСП у пациентов, описанных в этих работах, несколько различается. Так, Orlacchio et al. (2011) идентифицировали эту мутацию в южноафриканской семье с АД НСП с поздним началом, осложненной умственной отсталостью. Magariello et al. (2012) такую же мутацию выявили у пациентки с НСП, у которой заболевание было впервые диагностировано в возрасте 40 лет, однако, его первые признаки в виде трудностей при беге, судорог нижних конечностей и поясничных болей сама пациентка отмечала с более раннего возраста – после полового созревания. Заболевание у данной пациентки соответствовало неосложненной НСП, в частности, когнитивных нарушений у нее выявлено не было. Таким образом, можно отметить, что у наших пациентов с мутацией с.1246С>T (p.Arg416Cys) в гене ATL1 клиническая картина заболевания в значительной степени соответствует таковой, описанной в работе [Magariello et al.,2012], и в целом – форме НСП SPG3A, при которой заболевание чаще всего характеризуется ранним началом и неосложненным типом течения. В общей выборке из 63 неродственных пациентов с НСП, жителей Республики Башкортостан, частота мутации с.1246С>T (p.Arg416Cys) в гене ATL1 составила 4,7%, дополнив общую картину по спектру и частоте патогенных вариантов, приводящих к развитию НСП у пациентов обследуемого региона.
Проводимые научные исследования молекулярных основ патогенеза частых, тяжелых многофакторных и моногенных (олигогенных) заболеваний направлены на разработку и совершенствование способов их ранней диагностики и новейших терапевтических подходов, в целом, способствующих снижению заболеваемости данными патологиями и связанной с ними смертности.
Сотрудники ИБГ УФИЦ РАН активно сотрудничают с СпбГУ по проекту «Российские геномы» и принимают участие в создании биобанка популяций России. Кроме того, ИБГ УФИЦ РАН сотрудничает с ведущими зарубежными учеными и участвует в 4-х крупных международных консорциумах Евросоюза: Консорциум GABRIEL «Междисциплинарное исследование по идентификации генетических и средовых факторов бронхиальной астмы в Европейском Сообществе», координатор - профессор W.Cookson, Имперский колледж Лондона (Великобритания). Консорциум BCAC «Консорциум по изучению рака молочной железы», координатор -Doerk T., доктор естественных наук, Медицинская школа Ганновера (Германия). Консорциум GEFOS «Консорциум по изучению генетических факторов остеопороза», координатор – проф. Uitterlinden A., доктор Rivadeneira F., Медицинский центр ERASMUS МС (Роттердам, Нидерланды). Консорциум MEDIGENE «Генетические и экологические факторы синдрома инсулинорезистентности и его долгосрочных осложнений в иммигрантских популяциях Средиземноморья». Координатор – Университет Монпелье (Франция).
В рамках многолетнего международного сотрудничества проводятся совместные исследования с Эстонским биоцентром по изучению популяций Евразии на основании анализа данных полногеномных анализов ассоциаций и полногеномного секвенирования. Продолжается тесное сотрудничество с Ганноверской медицинской школой по изучению генов предрасположенности к раку молочной железы, с Университетом г. Монпелье во Франции по изучению генетических и средовых факторов метаболического синдрома.
В рамках проекта подготовлены и опубликованы 11 статей, 2 статьи поданы в журналы.