Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы.
Основные эволюционные тенденции в организации нервной системы беспозвоночных животных проявляются в концентрации нервных элементов, их ганглионизации и дифференциации (Беклемишев, 1964; Martín-Durán, Hejnol, 2019). Именно эти процессы приводят к трансформации диффузной нервной сети и возникновению сложных нервных систем, что наблюдаются у представителей далёких в филогенетическом отношении групп (Martín-Durán et al., 2018). Важнейшим этапом на пути формирования сложной нервной системы является ее разделение на периферический и центральный отделы, а именно возникновение центральной нервной системы (ЦНС). Этот процесс наблюдается у представителей плоских червей (Platyhelminthes), для которых характерен относительно простой уровень организации нервной системы в пределах Bilateria.
Трематоды (Digenea) – широко распространенные плоские черви группы Neodermata, большинство из которых являются эндопаразитами позвоночных животных. Для жизненного цикла трематод характерна смена амфимиктического и партеногенетических поколений, он включает морфологически очень разные стадии, которые обладают специализированной локомоторной и поведенческой активностью. При развитии мирацидиев, дочерних спороцист, редий и церкарий, трематоды проходят собственные этапы эмбриогенеза, которые приводят к возникновению морфологически очень отличающихся форм. Более того, эти формы занимают различные экологические ниши и по-разному взаимодействуют с окружающей средой. Несмотря на широкую распространенность трематод, многие аспекты их жизненных циклов, филогенетических взаимоотношений и тонкой морфологии до сих пор неизвестны. Морфологические и функциональные особенности организации нервной системы трематод играют одну из ключевых ролей в процессе трансмиссии этих паразитов. Выявление таких особенностей является необходимым условием для понимания основных эволюционных тенденций в организации нервных систем как в пределах Neodermata, так и для реконструкции путей эволюции относительно простых нервных систем, в том числе, при переходе к облигатно-паразитическому образу жизни. Несмотря на это, нервные системы представителей Digenea почти не изучены на ультраструктурном уровне, особенно принимая во внимание общее разнообразие трематод.
Современные исследования в области нейробиологии и эволюции нервных систем Metazoa фокусируются, в основном, на анализе роли конкретных генетических маркеров, определяющих ход нейрогенеза (напр., Sebé-Pedrós et al., 2018; Thiel et al., 2018; Martín-Durán, Hejnol, 2019; Thiel et al., 2021; Gąsiorowski et al., 2021). Такой подход стал возможным в результате накопления геномных и транскриптомных данных, а также визуализации процессов нейрогенеза с помощью методов in situ гибридизации (напр., Kerbl et al., 2016; Martín-Durán et al., 2018). Подобные методы широко применимы для исследования модельных объектов, поскольку их микроанатомия и физиология были детально описаны ранее. При всем многообразии беспозвоночных животных, экстраполяция имеющихся данных на эволюцию нервных систем в разных группах Metazoa становится невозможной при отсутствии сведений об анатомическом строении и цитологических особенностях тканей животных, не являющихся модельными объектами. В связи с этим, ультраструктурные исследования крайне актуальны, поскольку дают основу для дальнейшего глубокого анализа межклеточных взаимодействий и генетической регуляции нейрогенеза с применением современных молекулярных методов биологии развития.

Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность.
Целью проекта является выявление и сравнение ультраструктурных особенностей и общих закономерностей организации нервной системы трематод на разных стадиях их сложного жизненного цикла.
Основной задачей является выявление сходства и различий в организации нервной системы трематод как для разных стадий жизненного цикла в пределах одного вида, так и при сопоставлении результатов, полученных для разных видов.
Для решения основной задачи необходимо выполнить следующие частные задачи:
1. Выявление особенностей тонкого строения центральной нервной системы (ЦНС) спороцист, редий, церкарий и марит выбранных видов. Основные усилия будут сконцентрированы на описании ультраструктуры ганглиев, нервных стволов, синаптических контактов и разных типов нейронов (формы сомы, тонкой организации ядер, цитоплазматических включений, синтетического аппарата);
2. Реконструкция ЦНС спороцист, редий, церкарий и марит выбранных видов и выявление ко-локализации нервных стволов, коннектив и комиссур с поверхностными нервными окончаниями;
3. Реконструкция внешней морфологии и тонкого строения поверхностного сенсорного аппарата выбранных объектов.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.
В рамках проекта впервые будут получены ультраструктурные данные о строении ЦНС большинства последовательных стадий жизненных циклов (спороцист, редий, церкарий и марит) трех видов трематод, которые ранее не были изучены с этой стороны. Предлагаемые подходы позволят отследить ключевые трансформации нервной системы в течение сложного жизненного цикла и морфо-функциональную связь других органов и тканей (тегумента, экскреторной и мышечной систем) с нервной системой. Новые ультраструктурные данные могут пролить свет на существующие дискуссионные вопросы о природе глие-подобных клеток трематод. Будет проведена реконструкция ЦНС с использованием современных методов визуализации серотонин- и пептидергических элементов нервной системы. Уникальным результатом данной работы будет являться комплексное исследование нервной системы, включая сенсорный аппарат. Будет описана внешняя морфология и тонкое строение сенсилл, что не только выявит их морфологическое разнообразие, но и позволит предположить их функциональную роль. Поскольку нервная система является основным посредником при взаимодействии с окружающей средой, изучение сенсорного аппарата имеет не только фундаментальное, но и потенциальное практическое значение в области биомедицины. Анализ новых результатов и привлечение литературных данных, полученных ранее для объектов сем. Schistosomatidae, позволит выявить основные отличия и общие закономерности в организации нервных систем трематод трех крупных эволюционных ветвей: Plagiorchiida (Microphalloidea + Allocreadioidea), Echinostomida (Echinostomatoidea) и Strigeida (Schistosomatoidea).
Обоснования достижимости частных задач:
1. Выявление особенностей тонкого строения центральной нервной системы (ЦНС) спороцист, редий, церкарий и
марит выбранных видов. Данная задача является наиболее трудоемкой, поскольку изготовление серийных тонких срезов и их анализ занимаетмного времени. Отдельной проблемой для выполнения этой задачи могли бы стать трудности пробоподготовки, однако авторы проекта ранее уже разработали оптимальные протоколы для фиксаций выбранных объектов и убедились в воспроизводимости и качестве получаемых результатов. В связи с этим, основное время для выполнения задачи 1 будет занимать собственно ультратомия и анализ полученных электронограмм. Руководитель предлагаемого проекта имеет достаточный для этого опыт владения методами ТЭМ и анализа полученных результатов. Так, в 2019 году Денисова С.А. защитила магистерскую диссертацию на тему «Микроанатомия стилетных церкарий», посвященную ультраструктуре стилетных личинок пяти видов трематод н/сем. Plagiorchioidea и н/сем. Microphalloidea. Кроме того, имеющийся у руководителя опыт владения методами ТЭМ послужил причиной включения Денисовой С.А. в качестве исполнителя грантов РФФИ 20-04-01031-а «Полиморфизм у морских мшанок: молекулярные и морфологические аспекты», РНФ 21-74-00055 «Закономерности восстановления и роль нервной системы в регенерации аннелид», РФФИ 20-34-70158 Стабильность «Эпителио-мезенхимные взаимодействия in vivo на модели регенерации нереидных полихет: комплексный анализ морфопроцессов, контролируемых сигнальным путем FGF». Исполнители проекта также имеют опыт работы с ТЭМ и анализа электронограмм, поэтому решение поставленной задачи видится нам достижимым и реализуемым в рамках срока проекта.
2. Реконструкция ЦНС спороцист, редий, церкарий и марит выбранных видов и выявление ко-локализации нервных стволов, коннектив и комиссур с поверхностными нервными окончаниями. Данная задача уже была реализована нами для церкарии C.parvicaudata (Denisova, Shchenkov, 2020a) и для некоторых других объектов, поэтому решение этой задачи также достижимо в рамках срока проекта (поскольку мы имеем хорошее представление о трудозатратах на эту часть работы). Все участники коллектива обладают необходимыми навыками для исследования образцов с помощью окраски мечеными антителами и конфокальной микроскопии. Реконструкции локализации нейромедиаторов будут выполняться в виде схем и зоологических рисунков. По результатам окраски антителами к тубулину, сканограмм тегумента и импрегнации нитратом серебра, будет реконструирована хетотаксия выбранных объектов. Ранее С.В. Щенковым и соавторами было описано более 10 новых видов стилетных церкарий, для каждого вида была описана и хетотаксия, что иллюстрирует навыки анализа поверхностного расположения сенсилл. В предлагаемом проекте к схемам хетотаксии выбранных объектов будет добавлено и расположение элементов ЦНС, что позволит выявить ко-локализацию нервных стволов и комиссур с поверхностными рядами и группами сенсилл.
3. Реконструкция внешней морфологии и тонкого строения поверхностного сенсорного аппарата выбранных объектов. Эта задача также была реализована нами ранее для церкарии C.parvicaudata (Denisova, Shchenkov, 2020a,b) и для некоторых других церкарий. СЭМ является одним из наиболее простых методов и подходов, который позволяет охарактеризовать внешнюю морфологию и поверхность тела выбранных объектов, включая расположенные в пластинке тегумента ресничные сенсиллы. Учитывая консервативность в локализации сенсилл, возможно и на ультраструктурном уровне найти конкретное нервное окончание (по месту расположения, соседним органам и тканям, размеру, форме нервного окончания). Таким образом, возможно получение уникального результата, объединяющего как характер расположения сенсорного аппарата и его ко-локализацию с подлежащими нервами ЦНС, так и саму морфологию и цитологические особенности конкретной сенсиллы. Все участники коллектива в равной степени обладают навыками работы с методами СЭМ. Сопоставление внешней морфологии сенсилл по данным СЭМ с данными, полученными в ходе выполнения задачи 1, обосновывают достижимость задачи 3.
Основная задача: выявление сходства и различий в организации нервной системы трематод как для разных стадий жизненного цикла в пределах одного вида, так и при сопоставлении результатов, полученных для разных видов. Поскольку авторы проекта имеют достаточный опыт работы с рутинными методами, перечисленными в задачах 1, 2 и 3, решение частных задач приведет к появлению новых данных, синтез которых позволит сравнить ультраструктурные и общие морфологические особенности строения нервных систем выбранных видов. Поскольку работа участников коллектива и ранее была направлена на анализ эволюционных и филогенетических взаимоотношений, морфологических особенностей и путей реализации жизненных циклов трематод, новый сравнительный анализ полученных результатов видится достижимым в рамках сроков проекта. Для точной видовой идентификации стадий в пределах одного жизненного цикла нами обязательно будут получены баркодовые последовательности ДНК выбранных объектов. Обширный опыт в этой области имеется у Щенкова С.В. и Лебеденкова В.В., что гарантирует быстрое выполнение условия идентификации. Имеющийся у авторов проекта задел уже содержит необходимую для интенсивного начала выполнения проекта часть подготовленного к изучению материала по всем интересующим стадиям трех видов. В случае же недостатка материала по маритам, нами будет дополнительно выполнено экспериментальное выращивание марит двух видов. Экспериментальная постановка жизненных циклов уже неоднократно реализовывалась коллективом совместно, поэтому выполнимость данной работы не вызывает сомнений.
Все необходимое оборудование для получения данных с использованием ТЭМ, СЭМ, конфокальной микроскопии и молекулярной филогенетики предоставляется ресурсным центром СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Сбор материала, содержание лабораторной культуры и пробоподготовка доступны за счет технического оснащения лабораторий кафедры Зоологии беспозвоночных, включающего: стереомикроскопы Leica M205C и микроскопы Leica DM1000, вытяжные шкафы и термостаты, холодильные и морозильные камеры. В распоряжении коллектива также имеется часть необходимых реактивов (наборы для выделения и амплификации ДНК, фосфатный и какодилатный буферы, глутаровый альдегид, тетраоксид осмия, соли для контрастирования ультратонких срезов, эпоксидные смолы, параформальдегид, первичные антитела к серотонину и тубулину, вторичные антитела) и расходных материалов (пластиковые пробирки, пипетки, медные сеточки и бленды для изготовления тонких срезов).

Современное состояние исследований по данной проблеме.
Плоские черви являются очень разнообразной группой беспозвоночных животных. Долгое время их рассматривали как наиболее примитивных представителей Bilateria (Hanström, 1928; Reisinger, 1925, 1971; Martín-Durán, Hejnol, 2019). Хотя в настоящее время традиционные представления о филогенетическом положении и родственных связях Platyhelminthes были пересмотрены (Jondelius et al., 2002; Kocot et al., 2016; Wallberg et al, 2007; Larsson, Jondelius, 2008; Egger et al., 2015), это не отразилось на актуальности исследования нервной системы представителей этой группы. Именно разнообразие морфологических особенностей, жизненных циклов и биологии плоских червей дает возможность для сравнительного анализа и выявления общих закономерностей в организации нервных систем беспозвоночных животных (Böckerman et al., 1994; Gustafsson, 1992; Moraczewski et al., 1977; Quiroga et al., 2015; Sukhdeo et al., 1988).
В целом нервная система изученных к настоящему времени плоских червей соответствует определению «ортогона» в широком смысле слова (Richter et al., 2010; Bailly et al., 2013). Согласно многочисленным данным, ортогональная организация нервной системы значительно варьирует у представителей разных таксонов (Котикова, 1991; Reuter et al., 1998; Gustafsson, 1992; Halton, Gustafsson, 1996). Долгое время для визуализации их нервной системы использовались методики выявления фермента ацетилхолинэстеразы, а также было показано наличие классических нейрональных веществ: ацетилхолина, катехоламинов, серотонина, нейропептидов, ГАМК, глутамата, оксида азота (Котикова, 1969; Halton, Gustafsson, 1996; Теренина, Густафссон, 2014). Нейроны плоских червей проявляют высокую секреторную активность, обеспечивая трансдукцию нейротрансмиттеров по синаптическим и несинаптическим путям и реализуя нейроэндокринную функцию (Gustafsson, Wikgren, 1981c; Reuter, Gustafsson, 1989; Gustafsson, 1990, 1992; Reuter, 1990, 1991).
Среди плоских червей свободноживущие турбеллярии являются наиболее распространенным объектом для исследований тонкого строения нервной системы, а многие особенности организации их ЦНС экстраполируют и на других Platyhelminthes (Halton, Gustafsson, 1996). В то же время, детальные цитоморфологические данные о строении нервной системы представителей паразитического таксона Neodermata были получены для сравнительно небольшого количества видов, в первую очередь, цестод (напр., Biserova, 2008; Biserova et al., 2000, 2010). В этом отношении трематоды изучены в значительно меньшей степени. Ультраструктурные исследования церебральных ганглиев некоторых турбеллярий и цестод позволили выделить главные пути усложнения их ЦНС. Они включают дифференциацию и компартментализацию нейропиля церебрального ганглия (в том числе, при участии мышечных отростков), отсутствие тел нейронов в нейропиле, формирование кортикального слоя ганглия телами нейронов, дифференцировку нейронов, формирование оболочек вокруг ганглия (за счет внеклеточного матрикса или глие-подобных клеток) (Keenan et al., 1981; Morita, Best, 1966; Biserova et al., 2000; Ferrero et al., 1985; Morris et al., 2007; Shaw, 1982; Böckerman et al., 1994; Biserova, 1991; Biserova et al., 1996; Gustafsson, Wikgren, 1981). Максимальное проявление дифференцировки кортикальной зоны церебрального ганглия было показано на примере примитивных ассоциативных центров, выявленных у некоторых поликлад (Polyclada, Turbellaria) (Quiroga et al., 2015) и сходных с грибовидными телами аннелид, моллюсков и членистоногих.
Для трематод характерен сложный жизненный цикл, включающий смену амфимиктического и партеногенетических поколений (Galaktionov, Dobrovolkij, 2003). Основные исследования функций их нервной системы связаны с выявлением поведенческих и локомоторных паттернов (Прокофьев, Галактионов, 2009; Selbach, Poulin, 2018), с анализом распределения чувствительных нервных окончаний (Richard, 1971; Манафов, 2010; Denisova, Shchenkov, 2020a), а также с физиологическими и биохимическими особенностями взаимодействия с тканями хозяина (напр., Теренина, Густафссон, 2014). Большинство исследований, на которых базируются современные представления об анатомии нервной системы трематод, связаны с выявлением локализации холинэстераз в теле метацеркарий и марит, т.е. гермафродитного поколения. Подобный подход позволил выяснить, что общий план организации их нервной системы близок к традиционным представлениям об ортогональном строении. Тем не менее, в работах, освещающих организацию нервной системы на разных стадиях жизненного цикла, была показана ее широкая вариабельность, специфичность и функциональная дифференцировка (Котикова, 1969; Gianutsos, Bennett, 1977; Niewiadomska et al., 1996; Tolstenkov et al., 2011, 2012; Теренина, Густафссон, 2014). Широкий спектр видовых различий был выявлен в количестве и распределении катехоламинергических, серотонинергических и пептидергических нейронов у церкарий, метацеркарий и марит трематод различного систематического положения (Bennett , Gianutsos, 1977, Niewiadomska et al., 1996, Tolstenkov et al., 2011, 2012; Теренина, Густафссон, 2014). Была показана связь катехоламинов с подавлением или возбуждением моторных функций у марит S. mansoni и F. hepatica (Holmes, Fairweather, 1984; Maule et al., 1989). Биогенные амины нервной ткани трематод функционально связывают с двигательной активностью (Halton, Maule, 2004), а также с физиологическими адаптациями к температурным изменениям окружающей среды (Теренина, Густафссон, 2014). Для нейропептидов предполагается функция обеспечения нервно-мышечных взаимодействий и связь с сенсорными органами (Halton, Maule, 2004; Малютина и др., 2013). Наименьшее перекрывание в локализации перечисленных медиаторов в нервной системе наблюдается именно для серотонин- и пептидергических элементов (Halton, Gustafsson, 1996). Существуют и морфологические различия: серотонинергические нейроны крупнее остальных, они часто спарены или расположены симметрично и локализованы в основном в центральной нервной системе (Halton, Gustafsson, 1996). При этом наблюдается явный недостаток ультраструктурных данных, которые позволили бы определить цитологические различия нейронов и выявить не только их функциональные, но и морфологические типы.
В связи со сложностью проведения экспериментальной постановки жизненных циклов и получения материала из природных очагов инфекции, наличие нескольких стадий, обитающих в различных хозяевах, накладывает ограничения на морфологические и эволюционные исследования трематод. Для подавляющего большинства видов Digenea данные о строении нервной системы получены лишь для отдельных стадий жизненного цикла. Кроме того, не установлена систематическая принадлежность большого количества личинок, неизвестны и жизненные циклы многих видов (напр., Shchenkov et al., 2020). Это обуславливает серьёзный недостаток сравнительно-морфологических данных о строении нервной и других систем органов как для разных стадий в пределах одного жизненного цикла, так и между одноимёнными стадиями у разных видов трематод.
При общем биоразнообразии Digenea (Olson et al., 2003), представители разных таксонов изучены очень неравномерно: основное внимание уделяли гельминтам человека, сельскохозяйственных и промысловых животных. Так, подробные ультраструктурные исследования нервной системы были проведены на маритах р. Fasciola (Sukhdeo et al., 1988, 1994), Opisthorchis viverrini (Leksomboon et al., 2012) и Aporocotyle simplex (Poddubnaya, Gibson, 2019), а также церкариях F. hepatica (Dixon, Mercer, 1965), Schistosoma mansoni (Wilson, 1970; Cousin, Dorsey, 1991; Dorsey et al., 2002). Наиболее полные данные о строении нервной системы, ее физиологии и цитоморфологии на всех стадиях жизненного цикла получены только для S. mansoni – возбудителя шистосоматоза человека (Wilson, 1970; Cousin, Dorsey, 1991; Dorsey et al., 2002; Haas, 2003; Collins et al., 2011). Этот модельный объект является представителем стригеатной эволюционной ветви трематод и обладает узкоспециализированным жизненным циклом (Galaktionov, Dobrovolskij, 2003). Это обстоятельство накладывает существенные ограничения на экстраполяцию полученных данных, что мешает пониманию общих закономерностей в организации нервной системы трематод вообще.
К сожалению, имеющиеся в литературе данные об организации нервной системы представителей двух других групп трематод, Echinostomida и Plagiorchiida, весьма немногочисленны и разрознены. Ранее авторами предлагаемого проекта были получены первые ультраструктурные данные об организации ЦНС и сенсилл церкарии Cercaria parvicaudata (Plagiorchiida, н/сем. Microphalloidea) (Denisova, Shchenkov, 2020b). В нервной системе этой церкарии было выявлено наличие кортекса ганглия с глие-подобной оболочкой, миелино-подобных структур в нервных стволах, четырех типов синаптических контактов, включая аксо-соматические синапсы. Для полного сравнительного анализа этих результатов необходимы новые данные о тонкой организации ЦНС церкарий разного систематического положения. Среди Echinostomatoidea наиболее подробно изучена тонкая морфология F. hepatica (Dixon, Mercer, 1965; Sukhdeo et al., 1988, 1994). Согласно ультраструктурным данным, для разных стадий жизненного цикла этого вида характерна вариабельность в организации ганглиев, а также наличие глие-подобных элементов, происхождение которых не было установлено.
Имеющиеся к настоящему времени результаты показывают, что тонкое строение ганглиев исследованных трематод имеет видоспецифичные особенности. Они касаются наличия или отсутствия сомы нейронов в области нейропиля, разной степени дифференцировки кортекса ганглия, активности ядер нейронов, организации синаптических контактов, а также самой морфологии нервных клеток (Sukhdeo et al., 1988, 1994; Cousin, Dorsey, 1991; Denisova, Shchenkov, 2020b).
Особый интерес вызывает обнаружение глие-подобных клеток у плоских червей. Для трематод было показано наличие «поддерживающих» клеток, гистологически ассоциированных с нервной системой (Sukhdeo et al., 1988; Sukhdeo, Sukhdeo, 1994; Dorsey et al., 2002; Leksomboon et al., 2012; Poddubnaya, Gibson, 2019; Denisova, Shchenkov, 2020b). Такие глие-подобные клетки были обнаружены также в ЦНС некоторых турбеллярий (Böckerman et al., 1994; Reuter, Gustafsson, 1995), цестод (Biserova, 2008; Biserova et al., 2000, 2010) и аспидогастрей (Rohde, 1970b, 1971c). Эти клетки могут формировать оболочки вокруг ганглиев (Reuter, Gustafsson, 1995), миелино-подобные оболочки аксонов (Biserova et al., 2010; Denisova, Shchenkov, 2020b) и морфологически сходны с глиальными клетками других беспозвоночных (Radojcic, Pentreath, 1979; Sukhdeo et al., 1988; Biserova et al., 2010). Природа глие-подобных структур однозначно не установлена и является предметом дискуссии, наличие же настоящей глии у плоских червей отвергается (Hartenstein, 2016). Однако использование флуоресцентной метки для ядерного маркера астроцитов позвоночных S100b выявило наличие этого белка в нервной системе цестод (Biserova et al., 2010). В формировании миелино-подобных оболочек цестод могут быть задействованы клетки экскреторных каналов (Biserova, Korneva, 2006; Biserova et al., 2010). Данные, полученные авторами предлагаемого проекта (Denisova, Shchenkov, 2020b), показывают сходную природу глие-подобных клеток и у некоторых трематод. Кроме того, поддерживающую и изолирующую функцию в их нервной системе могут выполнять также отростки мышечных клеток (Poddubnaya, Gibson, 2019; Denisova, Shchenkov, 2020b). Эти особенности морфологии представителей Neodermata свидетельствуют об их широкой тканевой пластичности, а исследования ультраструктуры нервной системы трематод на разных стадиях жизненного цикла могут пролить свет на происхождение и развитие их глие-подобных структур.
Отдельного внимания заслуживает сенсорный аппарат трематод. Ресничные сенсиллы в разное время были обнаружены в апикальной папилле мирацидиев, на поверхности тела спороцист, церкарий и марит различных трематод (напр., Dunn et al., 1987; Bogea, Caira, 2001 a, b; Žďárská, Nebesářová, 2003; Antonelli et al., 2014; Denisova, Shchenkov, 2020a). Предполагают, что единичные сенсорные рецепторы выполняют функцию танго- и реорецепторов, а полицилиарные сенсиллы вовлечены в реакции хемотаксиса (Dunn et al., 1987). Были описаны также нересничные механорецепторные сенсиллы, которые обладают развитыми корешковыми структурами (Žďárská, Nebesářová, 2003). Кроме связанных с тегументом ресничных и нересничных сенсорных образований, были обнаружены внутренние «ламеллярные» рецепторы трематод (Wilson, 1970; Brooker, 1972; Dunn et al.,1987), характерные для некоторых личинок других представителей Neodermata (Xylander, 1984). Стоит отметить, что обозначенные типы сенсилл были детально исследованы на ультраструктурном уровне и реконструированы только у марит и мирацидиев нескольких видов. У некоторых представителей кроме сенсилл имеются глаза рабдомного или цилиарного типов. При этом фотореакции были обнаружены даже у тех видов трематод, у которых фоторецепторы на данный момент не были найдены (Прокофьев, Галактионов, 2009).
Расположение сенсорных рецепторов на поверхности тела – хетотаксия – является важным таксономическим признаком (Гинецинская, Добровольский, 1963). С введением в практику метода импрегнации нитратом серебра накопилось множество данных по хетотаксии церкарий трематод различного систематического положения. В процессе сравнительного анализа была разработана номенклатура сенсорных рецепторов, которая позволила выделить несколько типов хетотаксии, свойственных представителям таксонов Strigeoidea, Echinostomatoidea, Plagiorchioidea, Allocreadioidea и Microphalloidea (Richard, 1971; Bayssade-Dufour et al., 1993). Предполагается, что группы поверхностных сенсорных рецепторов ко-локализуются с подлежащими нервными стволами и комиссурами (Richard, 1971). Это предположение впоследствии было проверено лишь в нескольких работах (Grabda-Kazubska, Moczoń, 1981, 1990; Denisova, Shchenkov, 2020a).
Исследования хетотаксии позволили выделить одну из главных тенденций в эволюции сенсорного аппарата трематод – процесс «цефализации», который выражается в количественном преобладании сенсилл на переднем конце тела (Bayssade-Dufour et al., 1993). Эта особенность прослеживается, в первую очередь, на стадии церкарий и характерна для н/сем. Microphalloidea (Bayssade-Dufour et al., 1993; Манафов, 2010; Denisova, Shchenkov, 2020a). Остается не ясным, как, при формировании специфичных типов хетотаксии, отдельные группы сенсилл ко-локализуются с нервными стволами и комиссурами, и возможно ли говорить о гомологичных группах сенсилл у представителей разных таксонов (Манафов, 2010). К сожалению, метод импрегнации AgNO3 не всегда даёт однозначные результаты, поскольку выявляет любые десмосомы в пластинке тегумента, в том числе протоки желез, что может приводить к ошибочной интерпретации результатов. Например, многие аргентофильные структуры, наблюдаемые при импрегнации нитратом серебра, не обнаруживаются на сканограммах поверхности тегумента (Bogea, Caira, 2001a), поэтому для анализа хетотаксии следует использовать комплекс методов (Denisova, Shchenkov, 2020a). При этом ультраструктурные исследования необходимы для выявления морфо-функционального разнообразия сенсилл, их связи с элементами ЦНС, а также для реконструкции корешкового аппарата.

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта.
Мы остановили свой выбор на трёх видах трематод, которые широко распространены в паразитофауне Северо-Запада России.
1) Спороцисты, церкарии и мариты Cercaria parvicaudata (сем. Renicolidae) – вида из очень специализированного н/сем.Microphalloidea. Спороцисты этого вида (судя по нашим предварительным молекулярно-филогенетическим данным, вида Renicola roscovita) развиваются в морских гастроподах Littorina littorea, которые заселяют литораль Белого моря и доступны для сбора в районе УНБ «Беломорская» СПбГУ (Кандалакшский залив, Белое море). Внутри спороцист развиваются эмбрионы стилетных церкарий. Именно для стилетных церкарий трематод н/сем. Microphalloidea очень характерны процессы централизации ЦНС и «цефализации» сенсорного аппарата. Церкарии заражают второго промежуточного хозяина – двустворчатых моллюсков р. Mytilus, в которых инцистируются с образованием метацеркарий. Метацеркарии сем. Renicolidae заражают чаек Larus argentatus, поедающих мидий. Половозрелые мариты, продуцирующие яйца с мирацидиями, развиваются в почечных канальцах окончательного хозяина. В распоряжении авторов проекта имеются молекулярные данные (последовательности 28S рДНК и coxI), которые позволяют идентифицировать Cercaria parvicaudata с широко распространенным на Белом море видом марит Renicola roscovita (предварительно нами была осуществлена фиксация этих марит для ТЭМ, СЭМ и конфокальной микроскопии, качество фиксированного материала также проверено). Необходимо дальнейшее подтверждение этих данных, что позволить использовать марит данного вида для анализа преобразований нервной системы в пределах одного жизненного цикла.
2) Спороцисты, церкарии и мариты р. Podocotyle (сем. Opecoelidae). В последнее время возрос интерес к морфологическим и филогенетическим исследованиям сем. Opecoelidae из н/сем. Allocreadioidea, поскольку среди его представителей нередко встречаются слабо изученные глубоководные формы (Sokolov et al., 2019, 2020). Спороцисты р. Podocotyle массово встречаются в морских гастроподах р. Littorina, которые заселяют литораль Белого моря и в обилии доступны для сбора в районе УНБ «Беломорская» СПбГУ. Внутри спороцист развиваются церкарии, которые затем покидают организм первого промежуточного хозяина. Эти церкарии характеризуются наличием стилета и хвоста, модифицированного в небольшую присоску, с помощью которой личинки прикрепляются к субстрату в ожидании встречи со вторым промежуточным хозяином – амфиподами р. Gammarus. Подобная стратегия «ожидания» реализуется за счет характерного для этих церкарий поведения, включающего реакции гео-, рео-, фото- и хемотаксисов (Прокофьев, Галактионов, 2009). Зараженных метацеркариями гаммарид поедают рыбы сем. Pleuronectidae, Gadidae и Cottidae, в кишечнике которых развиваются половозрелые мариты. В распоряжении авторов имеются обширные молекулярно-филогенетические данные по различным представителям сем. Opecoelidae из Белого моря, что позволит нам хорошо ориентироваться в видовой принадлежности изучаемых животных.
3) Редии, церкарии и мариты Psilotrema simillimum (сем. Psilostomatidae) – представителя «эхиностоматной» ветви трематод. Отличает этот вид от предыдущих объектов наличие в жизненном цикле редий, которые паразитируют в пресноводных гастроподах Bithynia tentaculata. Эти зараженные моллюски в обилии встречаются в р. Кристателлька (Старый Петергоф, Санкт-Петербург). Внутри редий развиваются церкарии, которые покидают организм первого промежуточного хозяина и после короткого времени активного плавания инцистируются на поверхности водной растительности, раковинах моллюсков и других подводных субстратах. Таким образом, в жизненном цикле этого вида вместо метацеркарий имеется стадия адолескарии, которая развивается в половозрелых марит в пищеварительном тракте водоплавающих птиц, поедающих моллюсков и водную растительность. Жизненный цикл P. simillimum полностью адаптирован нами к лабораторным условиям. Нами неоднократно была реализована экспериментальная постановка жизненных циклов (для получения половозрелых марит в качестве дефинитивного хозяина используются инкубированные цыплята Gallus gallus), а также продолжительное культивирование зараженных моллюсков вне зависимости от сезона года. В этих условиях ранее были получены и проанализированы транскриптомы редий, церкарий и марит P. simillimum (Nesterenko et al., 2020, 2022) – в данной работе принимали участие Денисова С.А. и Щенков С.В.
Для успешной и своевременной реализации предлагаемого проекта мы планируем работать со следующими стадиями жизненного цикла: дочерними спороцистами или редиями, церкариями и маритами выбранных видов. В первую очередь, это связано с доступностью выбранных стадий, а также с наличием у авторов проекта опыта работы с ними. Сложность работы с мирацидиями и метацеркариями связана с трудоемким экспериментальным заражением промежуточных хозяев. Кроме того, для этих стадий характерно наличие дополнительных поверхностных оболочек (яйцевой скорлупки, цисты), обработка которых подразумевает дополнительные модификации пробоподготовки. Авторы видят возможным получение данных на стадиях метацеркарий, адолескарий и мирацидиев для общего сравнительно-морфологического анализа только в случае успешного получения результатов по выбранным стадиям жизненного цикла (спороцисты, редии, церкарии, мариты) на ранних сроках реализации проекта.
Редий, спороцист и церкарий выбранных видов мы планируем получить из зараженных моллюсков р. Littorina и B. tentaculata. Для этого будет осуществлен сбор моллюсков в окрестностях УНБ «Беломорская» СПбГУ (Кандалакшский залив, Белое море) и р. Кристателлька (Старый Петергоф, Санкт-Петербург). Моллюски будут исследованы на наличие паразитов целевых видов (с помощью определения церкарий при эмиссии), заражённые особи будут отобраны для содержания в лабораторной культуре. Для получения спороцист и редий будет осуществлено вскрытие заражённых гастропод.
Мариты Podocotyle atomon будут собраны при вскрытии камбал и тресковых рыб, пойманных в окрестностях УНБ «Беломорская» СПбГУ. Точная видовая идентификация паразитов будет дополнительно обеспечена с помощью получения и анализа сиквенсов баркодовых регионов генов coxI и 28S рДНК. В распоряжении авторов проекта уже имеются фиксации и готовые эпоксидные блоки для ультратомии марит Podocotyle atomon и Renicola roscovita (проводится их видовая идентификация с имеющимися стадиями жизненного цикла Podocotyle sp. и C. parvicaudata с использованием сиквенсов coxI и 28S рДНК), и ранее экспериментально выращенных марит P.simillimum. Если данного материала окажется недостаточно, то мариты C. parvicaudata и P. simillimum будут дополнительно выращены в ходе экспериментального заражения инкубированных цыплят Gallus gallus (на базе вивария СПбГУ).
Методы исследования перечислены в соответствии с поставленными задачами:
Задача 1. Основным методом для выявления особенностей тонкого строения ЦНС выбранных видов является трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ). Фиксация материала и первичная пробоподготовка будут проведены на базе УНБ «Беломорская» СПбГУ и лабораторий кафедры Зоологии беспозвоночных СПбГУ. Покровы выбранных объектов представлены синцитиальной пластинкой тегумента, что затрудняет проникновение фиксирующих жидкостей, а сами объекты обитают в средах разной осмотической концентрации. Эти факторы влияют на качество фиксированного материала и его пригодность для получения электронограмм. В связи с этим, кроме стандартного протокола, включающего фиксацию глутаровым альдегидом и пост-фиксацию тетроксидом осмия, будет использован вариант с предварительной обработкой материала OsO4, что позволит повысить проницаемость тегумента и внутренних тканей для фиксаторов и замещающих жидкостей. Будет использован метод фиксации путем замораживания объектов под высоким давлением (криофиксация), который позволяет, во-первых, избежать резких колебаний осмолярности растворов и, во-вторых, оптимизирует процесс замещения воды в тканях. Криофиксация и последующее криозамещение воды будут проведены на автоматических станциях Leica EM HPF-100 и Leica EM AFS2 (ресурсный центр СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»). Подготовленные эпоксидные блоки с объектами будут использованы для изготовления серий ультратонких срезов (65-70 нм) в разных проекциях с помощью ультратома Leica EM UC7. Ультратомия и получение электронограмм с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEOL JEM-1400 будут проведены на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Уникальной возможностью является получение трехмерных реконструкций ультраструктуры объектов с использованием сканирующего электронного микроскопа Volumescope2 по методу серийного сканирования поверхности блока (Serial Block Face SEM, SBF SEM, SBEM), который также доступен на базе научного парка СПбГУ.
Задача 2. Реконструкция ЦНС выбранных видов и выявление ко-локализации нервных стволов, коннектив и комиссур с поверхностными нервными окончаниями будут проведены с помощью методов конфокальной микроскопии. Спороцисты, редии, церкарии и мариты будут зафиксированы в 4% растворе параформальдегида для иммуноцитохимического исследования. Будет проведена стандартная пробоподготовка с использованием меченых антител к серотонину, тубулину и FMRF-амиду и исследование полученных препаратов с помощью сканирующего конфокального микроскопа с мультифотонным возбуждением Leica TCS SP5 MP (ресурсный центр СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»). Это даст возможность реконструкции общей морфологии нервной системы на разных стадиях жизненного цикла, а также поможет проследить связь и ко-локализацию элементов ЦНС и сенсорных окончаний. Данные методики также были ранее отработаны авторами на разных объектах (напр., Denisova, Shchenkov, 2020a).
Задача 3. Для реконструкции внешней морфологии сенсорного аппарата выбранных объектов будут использованы методы сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Для этого спороцисты, редии, церкарии и мариты будут зафиксированы в 2,5% глутаровом альдегиде. Будет проведена стандартная пробоподготовка объектов, сушка в критической точке при помощи Leica EM CPD300 и напыление платиной или золотом с помощью Jeol JEE-420D. Полученные образцы будут исследованы с помощью сканирующего электронного микроскопа Tescan MIRA3 LMU, который позволяет получать сканограммы высокого разрешения и также располагается на площадке ресурсного центра СПбГУ. Реконструкция тонкого строения сенсилл выбранных объектов будет проведена при анализе электронограмм, полученных в ходе выполнения Задачи 1.
Основная задача. Выбранный нами спектр объектов позволит провести сравнительный анализ морфологии нервной системы в пределах нескольких крупных филогенетических групп трематод. Анализ новых результатов и привлечение литературных данных, полученных для представителей сем. Schistosomatidae, позволит выявить основные отличия и общие закономерности в организации нервных систем трематод трех эволюционных ветвей: Plagiorchiida (Microphalloidea + Allocreadioidea), Echinostomida (Echinostomatoidea) и Strigeida. Кроме того, такой подход к выбору объектов также позволит выявить предполагаемую связь между особенностями строения ЦНС и стратегиями поискового поведения у церкарий трех морфологических групп: ксифидиоцеркарий Microphalloidea (и сходных с ними у Allocreadioidea), эхиностоматных (Echinostomatoidea) и фуркоцеркных личинок (Strigeida).

Общий план работы на весь срок выполнения проекта и ожидаемые результаты.
2023 г.:
1. Сбор моллюсков L. littorea и L. obtusata, зараженных C.parvicaudata и Podocotyle sp., соответственно, в районе УНБ СПбГУ «Беломорская». Содержание лабораторной культуры моллюсков, получение церкарий путем эмиссии и спороцист путем вскрытия гастропод. Сбор и содержание зараженных метацеркариями C.parvicaudata моллюсков M. edulis для использования при экспериментальном заражении (при необходимости). Сбор марит P.atomon путем вскрытия камбал и тресковых рыб на УНБ СПбГУ «Беломорская». Сбор моллюсков B. tentaculata, зараженных P. simillimum, в р. Кристателлька (Старый Петергоф). Содержание лабораторной культуры моллюсков, получение активно плавающих церкарий путем эмиссии и редий путем вскрытия гастропод. Получение марит P. simillimum и C. parvicaudata путем экспериментального заражения Gallus gallus (при необходимости).
2. Уточнение видовой идентификации отдельных стадий жизненного цикла: выделение ДНК, амплификация и секвенирование генов 28S рДНК, coxI с использованием оборудования ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Анализ полученных сиквенсов.
3. Химическая фиксация и криофиксация, первичная пробоподготовка для исследования с помощью электронной микроскопии. Получение электронограмм с помощью оборудования Leica EM UC7, JEOL JEM-1400, Volumescope2 (научный парк ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»).
4. Пробоподготовка для СЭМ и получение сканограмм с помощью оборудования Leica EM CPD300, Jeol JEE-420D, Tescan MIRA3 LMU (научный парк ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»).
5. Пробоподготовка для конфокальной микроскопии с использованием меченых антител к серотонину, тубулину, FMRF-амиду, получение результатов с помощью оборудования Leica TCS SP5 MP (научный парк ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий»).
6. Анализ полученных результатов. Выявление цитологических особенностей строения ганглиев, нейронов, синаптических контактов и сенсилл выбранных объектов. Сравнительный анализ организации серотонин- и пептидергических элементов нервной системы спороцист и редий, церкарий и марит выбранных видов. Подготовка и публикация статьи. Подготовка промежуточного отчета за первый год реализации проекта.
2024 г.:
1. Дополнительный сбор материала для исследования в случае его недостатка. Содержание лабораторной культуры зараженных моллюсков. Фиксация и первичная пробоподготовка дополнительного материала.
2. Пробоподготовка для ТЭМ и получение электронограмм с помощью оборудования Leica EM UC7, JEOL JEM-1400, Volumescope2.
3. Пробоподготовка для СЭМ и получение сканограмм с помощью оборудования Leica EM CPD300, Jeol JEE-420D, Tescan MIRA3 LMU.
4. Пробоподготовка для конфокальной микроскопии с использованием меченых антител к серотонину, тубулину, FMRF-амиду, получение результатов с помощью оборудования Leica TCS SP5 MP.
5. Анализ полученных результатов. Реконструкция нервной системы и сенсорного аппарата выбранных объектов. Подготовка и публикация двух статей. Подготовка итогового отчета.

Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту, наличие опыта совместной реализации проектов.
К моменту подачи заявки предлагаемого проекта, авторы содержат в лабораторных условиях зараженных моллюсков B.tentaculata. В распоряжении авторов проекта также имеются фиксации (в глутаровом альдегиде, параформальдегиде, спирте) спороцист C.parvicaudata и Podocotyle sp., редий P. simillimum и церкарий всех трех объектов, а также подготовленные эпоксидные блоки для ультратомии перечисленных объектов. Ранее руководителем проекта были подобраны оптимальные условия протоколов пробоподготовки объектов исследования для ТЭМ, а именно:
- метод фиксации с предварительным осмированием объектов для улучшения проницаемости тегумента для фиксаторов и замещающих жидкостей;
- метод криофиксации и криозамещения образцов с помощью оборудования ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Результаты применения этого метода были представлены на научном семинаре «Крио-фиксация и крио-замещение – современные методы пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии» с участием представителей компании Leica Microsystems (https://researchpark.spbu.ru/176-anonsy-meropriyatij/2974-news-sem-14-02-20).
В 2020 году была проведена реконструкция нервной системы C. parvicaudata с помощью методов конфокальной микроскопии, выявлена ко-локализация сенсилл с подлежащими нервными стволами и комиссурами и охарактеризована внешняя морфология пяти типов поверхностных сенсорных структур (Denisova, Shchenkov, 2020a). Ультраструктурное исследование выявило наличие в нервной системе C.parvicaudata четырех типов синаптических контактов и глие-подобных элементов, формирующих подобие миелиновых оболочек аксонов (Denisova, Shchenkov, 2020b). В течение 2020-2021 года авторами проекта были получены первые электронограммы и сканограммы спороцист и церкарий Podocotyle sp., спороцист C.parvicaudata, церкарий и редий P. simillimum, а также частично реконструирована их нервная система с использованием конфокальной микроскопии. В распоряжении авторов имеются фиксации и готовые эпоксидные блоки для ультратомии марит Podocotyle atomon, Renicola roscovita (проводится их видовая идентификация с имеющимися стадиями жизненного цикла Podocotyle sp. и C. parvicaudata с использованием последовательностей coxI и 28S рДНК) и ранее экспериментально выращенных марит P.simillimum. Неоднократно была реализована экспериментальная постановка жизненных циклов, а также продолжительное культивирование зараженных моллюсков вне зависимости от сезона. В этих условиях с участием авторов проекта ранее были получены и проанализированы транскриптомы редий, церкарий и марит P. simillimum (Nesterenko et al., 2020, 2022).
В случае успешного получения результатов по выбранным стадиям жизненного цикла на ранних сроках реализации проекта авторы видят возможным включение в сравнительный анализ новых данных для других видов трематод, например редий и церкарий Cryptocotyle lingua, Himasthla elongata, Sphaeridiotrema pseudoglobulus, которые являются массовыми в тех же гастроподах, что и объекты исследования предлагаемого проекта. Подобный материал, а также электронограммы церкарий сем. Pleurogenidae, Prosthogonimidae и Lecithodendriidae уже имеются у авторов проекта.
Все необходимое оборудование для получения данных с использованием ТЭМ, СЭМ, конфокальной микроскопии и молекулярной филогенетики предоставляется ресурсным центром СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Получение и первичная обработка материала доступны на базе лабораторий кафедры Зоологии беспозвоночных СПбГУ, в том числе, лабораторного корпуса (Старый Петергоф, Санкт-Петербург) и учебно-научной базы «Беломорская» (респ. Карелия). В распоряжении коллектива также имеется часть необходимых реактивов и расходных материалов. Авторы предлагаемого проекта имеют богатый опыт совместной работы, включающей сбор и определение живого материала, культивирование зараженных трематодами моллюсков в лабораторных условиях, экспериментальной постановки жизненных циклов трематод, фиксирования, пробоподготовки и исследования объектов с помощью методов ТЭМ, СЭМ, конфокальной микроскопии, классической гистологии и молекулярной филогенетики. Опыт Денисовой С.А. и Щенкова С.В. отражен в результатах совместных публикаций, посвященных разным аспектам эволюции и биоразнообразия трематод (Щенков и др., 2019; Shchenkov et al., 2020; Nesterenko et al., 2020, 2022; Denisova, Shchenkov, 2020a,b; Shchenkov, Sokolov, Denisova, 2021; Shchenkov et al., 2022), а также морфологическим и ультраструктурным особенностям морских мшанок (Shunatova et al., 2021 a,b). Этот опыт послужил причиной включения Денисовой С.А. и Щенкова С.В. в качестве исполнителей гранта РФФИ 20-04-01031-а «Полиморфизм у морских мшанок: молекулярные и морфологические аспекты» (срок реализации проекта - до 31.12.2022). Все авторы предлагаемого проекта являются выпускниками кафедры Зоологии беспозвоночных СПбГУ, где долгое время работали (в том числе, совместно) под непосредственным научным руководством ведущего специалиста в области биологии трематод, к.б.н. Добровольского А.А.
В 2019 году Денисова С.А. защитила магистерскую диссертацию на тему «Микроанатомия стилетных церкарий» (удостоена премии Санкт-Петербургского Общества Естествоиспытателей), посвященную тонкой морфологии стилетных личинок пяти видов трематод н/сем. Plagiorchioidea и н/сем. Microphalloidea. В данной работе были выполнены ультраструктурные исследования покровов, железистого аппарата, нервной и других систем органов ксифидиоцеркарий. Полученные данные позволили развить идею о морфо-функциональной пластичности тканей трематод, что также повлияло на определение цели предлагаемого проекта.
Также коллективом авторов с участием руководителя и исполнителей проекта:
- был проведен молекулярно-филогенетический анализ родства трематод из сем. Gymnophallidae, сем. Microphallidae, были выявлены морфологические особенности их марит;
- получены транскриптомы редий, церкарий и марит трематод сем. Psilostomatidae, проанализирована дифференциальная экспрессия их генов, проведен филостратиграфический анализ;
- проведен сравнительный анализ морфологии, биоразнообразия и таксономической принадлежности стилетных церкарий н/сем. Microphalloidea. Был пересмотрен состав групп Cercaria virgulae и Cercariae microcotylae, выявлены основные пути эволюции их мукоидного аппарата;
- получены новые морфологические данные о строении гетероморфных зооидов (ризоидов и авикуляриев) морских мшанок Dendrobeania fruticosa (в рамках проекта РФФИ 20-04-01031-а «Полиморфизм у морских мшанок: молекулярные и морфологические аспекты»).
Перечень публикаций, относящихся к тематике проекта:
1. Shchenkov SV, Denisova SA, Nesterenko MA, Lebedenkov VV, Kharytonau DE. Morphological description and phylogenetic position of xiphidiate cercaria of Prosthogonimus pellucidus (Trematoda: Digenea). Invertebrate Zoology, 2022. Vol.19(4), 425–432. Scopus. doi:10.15298/invertzool.19.4.06
2. Shchenkov S, Sokolov S, Tsushko K, Denisova S. Is Gymnophallus Odhner, 1900 (Trematoda: Gymnophallidae) polyphyletic? A new hypothesis based on phylogenetic position of Gymnophallus deliciosus (Olsson, 1893). Parasitology Research, 2022. WOS CC. doi: 10.1007/s00436-022-07552-1
3. Nesterenko M, Shchenkov S, Denisova S, Starunov V. The digenean complex life cycle: phylostratigraphy analysis of the molecular signatures. Biological Communications, 2022. Vol.67(2). Scopus. doi: 10.21638/spbu03.2022.201
4. Shchenkov S, Sokolov S, Denisova S. Phylogenetic position of Atriophallophorus minutus (Trematoda: Microphallidae), the type-species of the genus Atriophallophorus Deblock & Rosé, 1964, based on partial 28S rDNA gene sequence. Parasitology International, 2021. Vol.87:102534. WOS CC. doi: 10.1016/j.parint.2021.102534
5. Nesterenko MA, Starunov VV, Shchenkov SV, Maslova AR, Denisova SA, Granovich AI, Dobrovolskij AA, Khalturin KV. Molecular signatures of the rediae, cercariae and adult stages in the complex life-cycles of parasitic flatworms (Digenea: Psilostomatidae). Parasites & Vectors, 2020. Vol.13 (559), 1-21. WOS CC. doi: 10.1186/s13071-020-04424-4
6. Denisova SA, Shchenkov SV. Fine structure of the nervous system of Cercaria parvicaudata Stunkard & Shaw, 1931 (Digenea, Renicolidae). Journal of Morphology, 2020. Vol. 281 (7). WOS CC. doi: 10.1002/jmor.21137
7. Denisova SA, Shchenkov SV. New data on the nervous system of Cercaria parvicaudata Stunkard & Shaw, 1931 (Trematoda: Renicolidae): revisiting old hypotheses. Journal of Helminthology, 2020. Vol. 94 (E52). WOS CC. doi: 10.1017/S0022149X1900035X
8. Shchenkov SV, Denisova SA, Kremnev GA, Dobrovolskij AA. Five new morphological types of virgulate and microcotylous xiphidiocercariae based on morphological and molecular phylogenetic analyses. Journal of Helminthology, 2020. Vol. 94 (E94). WOS CC. doi:10.1017/S0022149X19000853
9. Щенков СВ, Денисова СА, Смирнова АД, Шунатова НН. Мукоидные железы церкарий. Invertebrate Zoology, 2019. Vol. 16 (4), pp.377–392. Scopus. doi:10.15298/invertzool.16.4.05 [Shchenkov SV, Denisova SA, Smirnova AD, Shchunatova NN. Mucoid glands of cercariae. Invertebrate Zoology, 2019. Vol. 16 (4), pp.377–392. Scopus. doi:10.15298/invertzool.16.4.05]