4.3.7.1. Научная проблема, на решение которой направлен проект.
Основной общей научной проблемой, решаемой в Проекте, является создание научной платформы для направленного молекулярного дизайна новых многокомпонентных лекарственных систем (носителя, действующего вещества и растворителя), все компоненты которых вносят свой вклад лекарственное действие системы. Для этой цели будет разработан мультидисциплинарный подход (включающий в себя компьютерное моделирование, химический синтез и эксперимент), позволяющий оценивать свойства этих многокомпонентных систем (состоящих в данном Проекте из новых пептидных дендримеров с циклическими боковыми группами, фуллеренов/фуллеренолов и специальных растворителей, также содержащих циклические фрагменты), каждая компонента которых имеет собственные полезные для лечения данного заболевания человека или/и животных свойства (в данном Проекте это антиамилоидные или/и антираковые свойства).
4.3.7.2. Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы.
Большинство лекарственных средств являются плохо растворимыми, токсичными и недостаточно биодоступными, что создает препятствия, ограничивающие перспективы их применения в терапии. Обычные методы доставки не позволяют достичь необходимой концентрации лекарственных препаратов в клетках-мишенях, а увеличение дозы часто приводит к многочисленным побочным эффектам. Фуллерены и их производные могут используются для создания лекарственных препаратов, в том числе антираковых. Небольшой размер, позволяет им оказывать эффективное биологическое действие на клетки-мишени. Существенной проблемой для большинства этих и других углеродных наночастиц при использовании их в биомедицинских целях является агрегация, которая ухудшает транспортные свойства и приводит к увеличению токсичности, а также может изменить тип действия этих наночастиц на биологические объекты.
Применение пептидных дендримеров для решения проблем агрегации и доставки фуллеренов, имеющих ярко выраженные антираковые и антиамилоидные свойства, является многообещающим подходом. Дендримеры позволяют не только доставить молекулы лекарств в клетки-мишени и органы, но и сохранить их целостность в процессе доставки, и защитить здоровые клетки от токсического действия лекарств, что способствует снижению общего количества лекарственного препарата, необходимого для достижения лечебного эффекта. Таким образом, дендримеры являются перспективными носителями для доставки антираковых препаратов и других лекарственных средств и позволяют использовать различные способы связывания вещества, подходящие для гидрофобных, гидрофильных, катионных и анионных препаратов. Наши исследования in vitro [Bioorganic chemistry, 2020, 95, 103504] также дают основания полагать, что некоторые пептидные дендримеры сами могут быть селективными антираковыми препаратами.
Болезнь Альцгеймера (БА) известна более ста лет и считается самым распространенным нейродегенеративным заболеванием во всем мире. Заболеваемость увеличивается пропорционально старению общества, и наиболее велика среди лиц старше 75 лет. Предполагается, что нынешнее число (45 миллионов человек), страдающих БА, к 2050 году увеличится в три раза. Это необратимое заболевание, характеризующееся ухудшением памяти и снижением когнитивных функций, является наиболее распространенной формой деменции. Наличие амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков является одним из основных признаков течения болезни. В настоящее время терапия для лечения болезни Альцгеймера носит, в основном, симптоматический характер и купирует клинические проявления заболевания в течение короткого периода времени. Доступные методы лечения не устраняют первичные причины патологии и не способны предотвратить потерю нейронов и атрофию головного мозга, которые приводят к когнитивным нарушениям. Поэтому поиск и разработка новых стратегий, направленных на снижение прогрессирующего течения болезни, является актуальным. Одной из них является уменьшение количества токсичных амилоидных бляшек для замедления прогрессирования БА. В этом направлении в последние два года были достигнуты некоторые успехи, однако, оказалось, что предложенные препараты приводят к воспалению мозга и сильным кровотечениям примерно в 1/3 случаев, что существенно ограничивает область их практического применения.
Другими перспективными молекулами, способными предотвратить агрегацию амилоидных фибрилл, являются дендримерные макромолекулы. Чаще всего для этого использовались полиамидоаминовые (PAMAM) и полипропилениминовые (PPI)) дендримеры. Однако, несмотря на ряд положительных результатов, в литературе отсутствует систематический подход к изучению механизмов влияния дендримеров на амилоидные фибриллы. Обычно, в исследованиях использовались только один-два сходных дендримера. Несмотря на имеющийся потенциал (биосовместимость и низкую токсичность) пептидные дендримеры малоизучены в качестве антиамилоидных систем. Также преимуществом пептидных дендримеров является не только возможность варьировать число генераций и тип концевых групп дендримера, но и подбирать аминокислотный состав внутренних сегментов для наиболее эффективного разрушения амилоидных фибрилл. Для дополнительного диспергирования фуллеренов и фуллеренолов в водной среде можно использовать растворители, которые с одной стороны хорошо смешиваются с водой, а с другой имеют циклические фрагменты. Одним из таких растворителей является N-метил пирролидон (NMP), который мы также будем использовать в нашем проекте.
В работе планируется компьютерная генерация новых пептидных дендримеров, содержащих циклические фрагменты, и исследование методом молекулярной динамики (in silico) свойств этих дендримеров и их комплексов с фуллеренами и фуллеренолами, в различных растворителях, в том числе в растворителях, имеющих циклические фрагменты. Также планируется исследования взаимодействие этих дендримеров, фуллеренов и фуллеренолов и их дендример-фуллереновых/. фуллереноловых комплексов с амилоидными протофибрилами. Параллельно планируется проведение реального химического синтеза и экспериментальное исследование наиболее подходящих для целей Проекта систем.

4.3.7.3. Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб.
Конкретной научной задачей, решаемой в Проекте, является генерация и выявление с помощью мультидисциплинарного подхода (включающего в себя компьютерное моделирование, химический синтез и экспериментадльные исследования) новых наиболее перспективных многокомпонентных систем (состоящих из новых пептидных дендримеров, содержащих циклические фрагменты или/и фуллеренов/фуллеренолов, и специальных растворителей, также содержащих циклические фрагменты), каждая компонента которых имеет собственные антиамилоидные или/и антираковые свойства).

4.3.7.4. Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости
решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.
Новизна данного проекта заключается в том, что в нем впервые будут сгенерированы и синтезированы новые пептидные дендримеры, их комплексы с фуллеренами/фуллеренолами и «дендримеро-фуллерено-циклические» и «дендримеро-фуллереноло-циклические» системы, которые являются перспективными для создания новых антиамилоидных и антираковых препаратов с синергетическим действием всех составляющих их компонент. Нами будет проведено комплексное исследование этих структур с помощью компьютерного моделирования (in silico) и реальных экспериментальных исследований.
Достижимость поставленных целей подтверждается нашими недавними успешными исследованиями в рамках сходных мультидисциплинарных проектов по изучению новых линейно-дендронных гибридных систем РФФИ-DFG 2020-53-12036 и проекта РНФ 2023-13-00144 по исследованию комплексов дендример-фуллереновых систем на основе ранее синтезированных нами лизиновых и пептидных дендримеров (в рамках предыдущего РНФ 2019-13-00087) с фуллеренами и фуллеренолами. Отличие данного Проекта от проекта РНФ 2023-13-00144 заключается в том, что в нем будут сгенерированы, синтезированы и изучены а) новые пептидные дендримеры с аминокислотными остатками Phe, Tyr и Trp, содержащими циклические боковые группы; б) в растворителях или и со-растворителях, также содержащих молекулы с циклическими группами; в) в рассматриваемых системах будет изучен синергетический эффект от одновременного присутствия молекул со сходными циклическими фрагментами, (в дендримерах, фуллеренах/фуллеренолах и растворителе), проявляющими антираковые и антиамилоидные свойства

4.3.7.5. Современное состояние исследований
A. Дендримеры
Дендримеры представляют собой монодисперсные полимерные структуры, которые могут быть использованы как многофункциональные платформы для разработки различных наносистем с множеством приложений [1]. Они являются новым классом регулярно ветвящихся полимерных молекул, имеющих сферически симметричную структуру и большое количество концевых групп доступных для функционализации. Возможность контролировать их структуру, размеры и архитектуру во время синтеза является одним из основных отличий от других наноразмерных молекул [2]. На сегодняшний день синтезировано более 200 видов дендримеров, которые могут быть сгруппированы в различные семейства в зависимости от их химической структуры, в том числе поли(амидоаминные) (PAMAM), поли(пропилениминные) (PPI), поли(L-лизиновые) (PLL), поликарбосилановые (PCS), фосфоросодержащие дендримеры и т.д.
C момента синтеза первых дендримеров, в конце 1970-х – начале 1980-х годов, было предсказано их биомедицинское использование, в том числе в качестве лекарственных препаратов (см., например, Denkewalter для PLL дендримеров [3] и Tomalia для PAMAM дендримеров [4]). В середине 1990-х было показано, что дендримеры могут быть использованы в качестве множественных антигенных пептидов (multiple antigen peptides (MAPs)), сенсорных функциональных агентов, а также при терапии СПИДа [5,6].
Дендримеры, используемые в наномедицине [7–10], обладают улучшенной растворимостью в воде, фармакодинамикой (сила и длительность воздействия), фармакокинетикой (время циркуляции, всасывание, распределение в тканях и органах) [11–15], высокой способностью проникать сквозь клеточные мембраны и транспортировать лекарственные препараты, которые могут быть физически адсорбированы на дендримере или химически пришиты к нему (обычно к его терминальным группам или центру) [16]. Инкапсуляция низкомолекулярных лекарственных препаратов и генетического материала в различные дендримеры (PAMAM, PPI и PLL) позволяет эффективно доставлять эти молекулы в различные органы и клетки, включая доставку в мозг через гематоэнцефалический барьер [17–20]. Дендримеры также могут быть использованы как антибактериальные и антивирусные агенты [21], для конъюгации олигонуклеотидов, и контрастной визуализации, а также в фотодинамической терапии, фармацевтике, иммунологии и т.д. [22,23].
Дендримеры являются одними из перспективных агентов для лечения нарушений центральной нервной системы [24]. Дендримеры показали себя перспективными в качестве антиамилоидных систем, проявляют противовоспалительные свойства, способствуют клеточному поглощению некоторыми типами клеток и являются потенциальными инструментами для диагностики заболеваний [25,26].
При использовании дендримеров важными моментами являются токсикологические аспекты их действия, которые требуют тщательной клинической оценки [27]. Цитотоксичность является одним из факторов, ограничивающих применение дендримеров в биомедицине и приводящих к необходимости разработки различных стратегий по ее снижению [9]. Так, например, положительный заряд периферии PAMAM или PPI дендримеров, определяющий их цитотоксичность, можно уменьшить путем пегилирования, гидроксилирования и ацетилирования терминальных групп, а также с помощью модификации биоактивными молекулами, в частности, отдельными аминокислотными остатками или олигопептидами [19].
Пептидные дендримеры, состоящие из аминокислотных остатков, отличаются от других синтетических дендримеров относительно низкой цитотоксичностью и хорошей биосовместимостью. В ряде фармакологических исследований [28–32] отмечается, что преимуществом лизиновых и многих лизиносодержащих пептидных дендримеров является их безопасность вследствие биоразлагаемости, низкой цитотоксичности и синергетического эффекта, обусловленного действием самого дендримера, поскольку пептидная дендримерная матрица обладает противомикробной [33–37] и антиангиогенной активностью [17,38,39]. Дендримерные лизиновые носители могут быть полезны в лечении раковых заболеваний [40], заболеваний сердечно-сосудистой и опорно-двигательной системы, воспалений, диабета, отравления фосфорорганическими веществами, а также могут применяться в качестве вакцин [41]. Недавно был одобрен медицинский препарат VivaGel BV производимый компанией Starpharma против бактериального вагиноза на основе модифицированного лизинового дендримера. Также появились первые работы, в которых представлены перспективы применения комплексов пептидных дендримеров с миРНК-пептидами в качестве антивирусных препаратов, предназначенных для ингаляционного лечения пациентов с COVID-19 [21]. Кроме того, недавно было показано, что такие проблемы, как высокая стоимость синтеза лизиновых и других пептидных дендримеров и необходимость перехода к их крупномасштабному производству не будут препятствовать будущему широкому использованию этих дендримеров [42]. Отметим, что другие разветвленные пептидные макромолекулы, такие как дендриграфты и гиперразветвленные полимеры, также имеют хорошие перспективы для использования в качестве антивирусных и антибактериальных препаратов [43].
Важно отметить участие коллектива Проекта в цитологических исследованиях пептидных дендримеров третьего поколения [44,45]. Было продемонстрировано, что данные пептидные лизинсодержащие дендримеры, синтезированные при участии авторов Проекта, имеют высокую избирательную токсичность по отношению к раковым клеткам, являясь малотоксичными по отношению к нормальным клеткам [44]. Было также показано, что пептидные дендримеры могут служить перспективными наноносителями для лекарств противоопухолевой терапии, обеспечивая синергетический эффект действия самого дендримера и переносимого им лекарственного препарата или генетического материала по отношению к раковым клеткам, и снижая при этом воздействие носителя и переносимых им препаратов на здоровые клетки [45]

B. Использование дендримеров для лечения нейродегенеративных заболеваний
Существует группа нейрогенеративных заболеваний, для которых характерно возникновение амилоидных фибрилл. Среди них есть неврологические расстройства, такие как болезнь Альцгеймера и прионные болезни. Болезнь Альцгеймера (БА) впервые была описана в 1907 году, с тех пор она считается наиболее распространенным нейродегенеративным заболеванием во всем мире и основной причиной деменции [46]. БА представляет собой прогрессирующую хроническую патологию, характеризующуюся когнитивными нарушениями, поведенческими нарушениями, потерей памяти и функциональной способности выполнять повседневные задачи [47]. Заболеваемость увеличивается пропорционально старению общества и наиболее распространена среди лиц старше 75 лет. Предполагается, что нынешнее число (45 миллионов человек), страдающих этим заболеванием, к 2050 году увеличится в три раза [48].
Патогенез БА полностью не ясен, но связан с двумя основными патологическими особенностями: отложением внеклеточных амилоидных бляшек и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков (НФК) [49]. Основным компонентом амилоидных бляшек является бета-амилоидный (β-амилоидный или Aβ) пептид, состоящий, обычно, из 40-42 аминокислот [50], тогда как преобладающим элементом НФК является тау-белок (p-Tau) [51]. Образование Aβ пептида и последующая агрегация в амилоидных (сенильных) бляшках является начальным этапом в развитии БА и определяет последующее отложение тау-белка в НФК. Эти бляшки представляют собой внеклеточные поражения, которые, в основном, состоят из β-амилоида. Aβ представляет собой пептид, состоящий из 40 или 42 аминокислот (Aβ(1-40) и Aβ(1-42), соответственно), который получается из белка-предшественника амилоида (amyloid precursor protein (APP)) [52]. Aβ(1-42) пептид, является основным пептидом, образующим фибриллы диаметром от 6-10 нм, хотя Aβ(1-40) также обнаруживается в амилоидных отложениях [53,54]. Однако, наиболее токсичны не сами фибриллы, а олигомеры фибрилл, состоящие из небольшого числа плоских димеров Aβ пептида, уложенных в стопку. Большая часть современных знаний о Aβ пептиде и его конформациях основана на анализе Aβ фибрилл и других агрегатов, которые были сформированы из синтетического или рекомбинантно экспрессированного Aβ пептида в условиях in vitro. Однако, в недавней работе [55] амилоидные Aβ фибриллы были выделены из сосудистых оболочек (мозговых оболочек) головного мозга при БА и проанализированы их структурные особенности. В отличие Aβ фибрилл, образованных in vitro, они обладали правосторонней скрученной морфологией с хорошо разрешенными перекрестами. Прогрессирующая самоагрегация Aβ пептида способствует образованию более крупных олигомеров, протофибрилл, фибрилл и нерастворимых амилоидных бляшек, которые являются основными отличительными чертами мозга пациентов с БА [56].
Классическая терапия БА направлена на замедление прогрессирующего снижения когнитивных функций и функциональных способностей, таких как память. Однако, доступная в настоящее время терапия носит лишь симптоматический характер и купирует клинические проявления заболевания в течение короткого периода времени. Эти методы лечения не устраняют первичные причины патологии и не способны предотвратить потерю нейронов и атрофию головного мозга, которые приводят к когнитивным нарушениям. Поэтому необходима разработка новых стратегий, направленных на модификацию патологического течения болезни. Уменьшение количества токсичных амилоидных бляшек важных терапевтических стратегий для замедления прогрессирования БА. В последние два года были одобрены два первых препарата на основе моноклональных антител для замедления прогрессирования болезни Альцгеймера (БА): Aduhelm, которое уменьшает бляшки, но не замедляет значимо прогрессирование БА [https://www.ncoa.org/article/what-you-need-to-know-about-aduhelm]; и Legebmi, которое уменьшает бляшки и замедляет прогрессирование БА примерно на 30% [https://theconversation.com/what-the-fdas-accelerated-approval-of-a-new-alzheimers-drug-could-mean-for-those-with-the-disease-5-questions-answered-about-lecanemab-197460]. Однако, у них есть серьезные побочные эффекты, такие как воспаление мозга и мозговые кровотечения, возникающие также примерно у 30% больных, получающих эти препараты, что нивелирует преимущества, получаемые при их использовании. К тому же стоимость лечения составляет порядка 30-40 тысяч долларов в год.
Экспериментальные исследования показали, что процесс агрегации Aβ может ингибрироваться короткими пептидами [57,58], небольшими природными органическими молекулами, выделяемыми из растений (такими как куркумин [59], ресвератрол [60] и др.), наночастицами (такие как углеродные нанотрубки, фуллерены [61–63], графены [64], нанолисты WS2 [65]).
С использованием дендримерных макромолекул было изучено несколько механизмов для уменьшения количества токсичных амилоидных бляшек, включая, как ингибирование процесса Aβ агрегации, так и деградацию существующих фибрилл.
В работе [66] были синтезированы и исследованы цистеинсодержащие дендримеры с KLVFF пептидом первого поколения. Было показано, что соединение KLVFF пептида с дендримерным каркасом усиливает его ингибирующее действие на агрегацию Aβ 42, а также способствует разрушению существующих фибрилл и уменьшению амилоидных отложений. Предыдущие исследования процесса агрегации Aβ определили критическую область, которая участвует в формировании амилоидных фибрилл [67,68]. Гидрофобное ядро KLVFF (Aβ(16–20)) имеет решающее значение для образования стопок плоскими димерами Aβ пептида. Было также показано, что KLVFF связывается с гомологичной последовательностью в Aβ и предотвращает его агрегацию в амилоидные фибриллы [69,70]. Эта KLVFF последовательность послужила ведущим соединением для разработки ингибирующих агентов, направленных на предотвращение Aβ агрегации in vivo [71,72]. Было также показано, что KLVFF уменьшает амилоидные отложения [73].
Полиамидоаминные (PAMAM) дендримеры трех различных поколений (G3, G4 и G5) были исследованы для применения в качестве антиамилоидных средств. PAMAM дендримеры препятствовали отложению Aβ(1-28), а также способствовали дезагрегации существующих фибрилл в аморфные структуры, причем величина эффекта увеличивалась в зависимости от концентрации и была пропорциональна генерации дендримера. PAMAM дендримеры наибольших поколений оказались наиболее эффективными в нарушении процесса агрегации амилоидов [74]. Кроме того, функционализированные PAMAM дендримеры были исследованы в качестве средства для уменьшения накопления сенильных бляшек. PAMAM G0, присоединенные к спиральному β-пептиду KLVFFAE или фолдамерам, распознавали Aβ олигомеры, предотвращая их агрегацию. Комплексы фолдамер-дендример также продемонстрировали защитные свойства против Aβ токсичности [75].
Полипропилениминные (PPI) G4 и G5 дендримеры, модифицированные терминальными мальтозными группами, уменьшали агрегацию Aβ 40 пептида в зависимости от поколения. PPI G5 предотвращали амилоидную токсичность за счет образования аморфных структур, тогда как конъюгаты G4 уменьшали отложение пептидов, не затрагивая предварительно сформированные фибриллы [76]. В работе [77] было показано, что эффективность применения PPI дендримеров для уменьшения агрегации пептидов зависит от pH, поскольку при низком значении pH достигается наибольшая степень протонирования как аминогрупп дендримера, так и гистидиновых остатков пептида. При высоких концентрациях (4µmol/L) PPI дендримеров процесс амилоидогенеза полностью ингибировался, а при низких концентрациях дендримеров процесс агрегации амилоида зависел от рН. Так, PPI в концентрации 1 мкмоль/л может либо усиливать, либо препятствовать образованию фибрилл в зависимости от рН. При рН=4.9 PPI дендримеры сильнее взаимодействовали с Aβ(1-28) пептидом и прерывали процесс фибрилизации, уменьшая амилоидные агрегаты.
Олигомерные формы Aβ пептида считаются наиболее нейротоксичными при патологическом течении БА. Фосфорсодержащие дендримеры были предложены в качестве мощных инструментов для контроля фибриллообразования промежуточных олигомеров и предотвращения последующей токсичности при БА. В частности, катионные фосфорсодержащие дендримеры (CPD) G3 и G4 снижали цитотоксичность Aβ(1-28) в клеточной линии N2a [78,79]. Было показано, что фосфорсодержащие дендримеры G3 и G4 могут взаимодействовать с тау-белком и способствуют его сборке в аморфные структуры, тем самым уменьшая его агрегацию во внутриклеточных нейрофибриллярных клубках. Оба дендримера изменяли длину фибриллярных структур, и, кроме того, производные G3 также влияли на количество фибриллярных агрегатов. При применении CPD в достаточно высокой концентрации (1 μM и 10 μM) они полностью ингибировали процесс агрегации. Самая низкая концентрация дендримеров (0,01 μM) вызывала ускорение образования фибрилл. Разница в поведении между CPD G3 и CPD G4 наблюдалась при концентрации 0,1 μM. В случае CPD G3 эта концентрация практически не вызывала эффекта, а в случае CPD G4 ускоряла процесс фибрилляции [78]. Очевидно, что необходим оптимальный баланс между размером дендримера, количеством поверхностных функциональных групп и концентрацией для того, чтобы дендримеры проявили наивысшую эффективность против образования амилоидных фибрилл.
В качестве потенциальных молекул, способных оказывать влияние на фибрилизацию Aβ-пептидов были рассмотрены поли-L-лизиновые (PLL) дендримеры третьего (G3) и пятого (G5) поколения. Исследование проводилось как с помощью молекулярно-динамического моделирования, так и экспериментально в условиях in vitro и in vivo [80]. Важно отметить, что в этой работе принимал участие один из участников данного Проекта (И.М. Неелов). В этой работе была оценена их способность снижать токсичность амилоидного пептида Aβ(1-42) в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y. Результаты показали, что PLL G3 и G5 ингибировали агрегацию амилоидов, в отличие от гиперразветвленного лизинсодержащего полимера, который способствовал увеличению агрегации. Было показано, что PLL G3 может защищать клетки от цитотоксичности вызванной Aβ(1-42) [80]. Авторы отмечают, что в зависимости от концентрации и генерации дендримеров их эффективность в качестве антиамилоидных систем может быть различной, поэтому необходимы дальнейшие исследования.
Несмотря на имеющийся потенциал пептидных дендримеров, они малоизучены в качестве антиамилоидных систем. Планируемые для исследования в Проекте пептидные дендримерные структуры являются новыми и ранее не исследовались для этих целей. Учитывая огромный прогресс в создании и исследовании новых пептидных дендримеров различной архитектуры за последние 5 лет (в том числе при непосредственном участии руководителя и исполнителей данного Проекта), а также в существенно возросших возможностях компьютерного моделирования, можно ожидать, что в рамках данного Проекта будут получены прорывные результаты для создания эффективного антиамилоидного агента на основе новых пептидных дендримеров и/или дендриграфтов и их комплексов и/или конъюгатов с низкомолекулярными антиамилоидными агентами (например, фуллеренами и олигопептидами, проявляющими антиамилоидную активность). По сравнению с недавно предложенными для этой цели мононоклональными антителами Aducanumab и Lecanemab [81,82] они будут существенно менее токсичными, более дешевыми и поэтому гораздо более доступными и пригодными для массового применения для замедления течения и, возможно, для будущего лечения болезни Альцгемера. Также в качестве антиамилоидных средств были исследованы конъюгаты дендримеров с антиамилоидными пептидами [83,84].
Дополнительно хотелось бы отметить, что фуллерен и его производные обладают замечательной антиамилоидной активностью [62]. В частности, недавно было обнаружено, что фуллерен C60 значительно ингибирует агрегацию Aβ(1–40) in vitro с высокой специфичностью в отношении узнавания KLVFF мотива Aβ-пептида [61]. Также было описано ингибирующее действие гидратированной С60 молекулы (фуллеренола) на амилоидогенную активность Aβ(25–35) [63].
Ранее в литературе также обсуждались комплексы полимеров с фуллеренами [85-88], но, практически не было работ по исследованию комплексов дендримеров с фуллеренами (кроме [86]), хотя дендримеры и особенно пептидные дендримеры идеально приспособлены для образования таких комплексов.

C. Фуллерены и фуллереновые производные для биомедицинских приложений

С момента своего открытия фуллерены стали одними из самых узнаваемых молекул. “Прекрасная молекула”, описанная Харольдом У. Крото, украсила обложки многих учебников и даже появилась на киноэкране. Физические и химические свойства фуллеренов вызвали большой интерес в научном сообществе в связи с обширными возможностями для разработки новых направлений научных исследований. Трудности использования фуллеренов для биомедицинских приложений, как правило, вызваны проблемами, связанными с их растворимостью и/или агрегацией. Для решения этих проблем использовались различные производные фуллерена.
Вскоре после открытия фуллеренов начались исследования возможности их применения в разработке лекарственных препаратов [89,90]. Так, 4,4’-бис{[2-(2-карбоксиэтилукарбониламиноэтилфенил}-(3’Н-циклопропа[1,9(1,-Сво)[5,6 фуллерен] способен блокировать гидрофобную полость протеазы ВИЧ. С тех пор число работ, посвященных изучению биологической активности фуллерена, выросло многократно: в настоящее время ежегодно публикуются тысячи статей по этой тематике.
Биологическая активность фуллеренов, как и соединений любого другого класса, определяется физическими, химическими и топологическими свойствами молекул. Одним из наиболее важных физических свойств молекул фуллерена является их способность превращать молекулы триплетного кислорода в различные активные формы кислорода. К основным химическим свойствам относятся ненасыщенная природа молекул фуллерена, что делает их активными ловушками свободных радикалов. Кроме того, молекулы фуллерена могут образовывать ковалентные связи и супрамолекулярные конъюгаты с молекулами разных типов, в том числе с полимерами. Еще одним критически важным свойством молекулы фуллерена, отличающим ее от большинства других органических соединений, является наличие внутренней полости, в которую можно поместить отдельные атомы или группы атомов. Эндоэдральные фуллерены могут оказаться очень полезными при разработке контрастных агентов для различных видов томографии.
Учитывая огромное количество работ, посвященных фуллеренам и их производным, мы сфокусируемся на свойствах фуллеренов и их производных, которые, по нашему мнению, могу быть улучшены с помощью дендримерного наноконтейнера или давать синергетический эффект.
Свойства фуллеренового каркаса (например, липофильность) могут играть решающую роль во взаимодействии фуллерена и его производных с биологическими объектами in vitro и in vivo (например, см. обзор [91]). Производные фуллеренов обладают антивирусными [92-94], антимикробными и бактерицидными действиями [95,96]. Например, карбоксифуллерен - в концентрации 10 мкмоль/л ингибирует вирус Dengue-2 при освещении, т.е. по фотохимическому механизму, включающему образование синглетного кислорода или других активных форм кислорода. Более того, соединение обладает и темновым противовирусным действием – в концентрации 40 мкмоль/л оно практически полностью подавляет репликацию [93]. Однако, важно отметить, что мембранотропные свойства молекул фуллерена проявляются только при низкой степени их агрегации.
Фотодинамическая терапия является одной из возможных областей использования фуллеренов. Преимуществами данного метода терапии являются нехирургический и минимально инвазивный подход, который используется при лечении доброкачественных и злокачественных опухолей [97]. Фуллерены С60 и С70, а также их производные способствуют увеличению концентрации активных форм кислорода в клетках. В биологических системах эти вещества являются окислителями [98] и индуцируют апоптоз [99]. Поэтому они могут быть использованы в качестве соединений-лидеров при разработке противовирусных и противоопухолевых лекарственных препаратов [100-102].
Достаточно широко исследовались и фотодинамические свойства фуллерена С70. Сравнение фотодинамической активности фуллеренов С60 и С70, инкапсулированных в липосомы, которые были приготовлены из димиристоилфосфатидилхолина, в отношении клеток HeLa показало, что активность С70 в пять раз превышала активность С60. Это различие было объяснено улучшенным спектром поглощения первого [103].
Важно отметить, что исследованный нами ранее лизиновый дендример Lys-2Lys показал высокую селективную активность в отношении клеток HeLa. Активность коньюгатов данного дендримера с фуллеренами С60 и С70 и их производными может существенно увеличиться за счет их совместного действия, что может привести к появлению синергетического эффекта. Поэтому синтез и исследование данных макромолекул является одной из важнейших задач данного Проекта.
Известно, что агрегация фуллеренов/фуллеренолов приводит к ослаблению их фотосенсибилизирующих свойств. Однако, только агрегация, экранирующая сам фуллереновый каркас приводит к ослаблению этих свойств. Агрегация же всей сополимерной субъединицы может и не сказываться на фотосенсибилизирующей способности данного соединения при условии, что вблизи фуллеренового каркаса имеется достаточное количество кислорода, а сам фуллерен доступен для квантов света.
Например, показано, [104] что сополимер фуллерена и акриламида может образовывать частицы со средним диаметром порядка 46 нм. Образование “наношаров” не влияет на фотодинамическую активность фуллерена, указывая на то, что агрегация не вызывает экранирования фуллеренового каркаса и связана с полимерной системой. Модификация фуллерена С60 полисахаридом пуллулан приводит к образованию эффективного фотодинамического противоопухолевого средства [105,106].
Еще одним перспективным направлением использования производных фуллерена является разработка противоопухолевого средства для химиотерапии на основе фуллеренола, содержащего внутри атом гадолиния (т.е. эндометаллофуллеренол (ЭМФ) с атомом Gd). Так, в экспериментах на мышах показана высокая противоопухолевая активность Gd@C82(OH)22 в дозе 10-7 моль/кг [107]. Частицы [Gd@C82(OH)22]n имели диаметр ~ 22 нм в физиологическом растворе. При проведении тестов in vitro и in vivo установлено, что, будучи практически нетоксичными, эти частицы подавляют рост опухоли, препятствуя инвазии опухоли в нормальную мышечную ткань. Иными словами, наночастицы Gd@C82(OH)22 не убивают клетки опухоли непосредственно; это резко контрастирует с действием обычных противоопухолевых препаратов. Механизм противоопухолевого действия в настоящее время неясен. Согласно результатам недавно проведенных исследований, фактическое действие наночастиц Gd@C82(OH)22 может включать повышение иммунитета (подробнее см. в работе [108]). Ряд других интересных свойств наночастиц Gd@C82(OH)22 описан в работе [109]. Высказано также предположение, что, если бы в руках онкологов были производные фуллерена с подходящим образом модифицированной поверхностью, их мечта разработать сильнодействующее малотоксичное противораковое средство могла бы стать явью [107].
Производные ЭМФ, например, с атомом Gd являются, также перспективными макромолекулярными контрастными агентами для магнитно-резонансной томографии (МРТ) [110,111]. Другими славами, на основе Gd@C82(OH)n могут быть созданы тераностические препараты, которые будут обладать как диагностическими, так и терапевтическими свойствами. Углеродный каркас этих молекул защищает атом металла (или группу атомов) от внешнего окружения. Поэтому инкапсулированные атомы металла не взаимодействуют с биологическим окружением, не участвуют в биохимических реакциях в организме и, следовательно, не проявляют токсичность [112].
Как уже отмечалось выше, изучение биологической активности фуллеренов и их производных осложняется их высокой склонностью к ассоциации, образованию агрегатов даже для водорастворимых производных фуллеренов за счет гидрофобных частей молекулы. В то же время хорошо известно, что как физико-химические, так и биологические свойства фуллеренов могут существенно влиять на развитие и выраженность биологического ответа [113]. Одним из следствий агрегации является принципиально разное взаимодействие с биологическими структурами отдельных молекул и образованных из них наночастиц вследствие не только различия в свойствах, но и просто вследствие разных размеров. Молекулярные размеры фуллерена вполне биологичны. Например, молекула фуллерена С60 имеет размер 1 нм, что весьма привлекательно с точки зрения биологии. Но это справедливо лишь для отдельных молекул, поскольку в агрегированном состоянии они представляют собой уже наночастицы. Так, небольшие размеры молекулы фуллерена позволяют ей встроиться в молекулу сывороточного альбумина человека (HSA), имеющую размер 8.0 х 3.8 нм [114,115]. Однако совершенно иначе ведут себя наночастицы – наночастицы С60 (nano- С60), которые в водной суспензии адсорбируют молекулы НSА на своей поверхности, при этом молекула белка меняет свою конформацию [116]. Это вызвано тем, что размеры агрегатов намного больше размеров отдельного фуллерена: в частицах фуллерита (кристаллическое состояние фуллерена) от 200 до 1000 нм и более [117] и от 50 до 600 нм в коллоидных дисперсиях [118].
Настоящий Проект направлен на решение проблемы агрегации фуллеренов: планируется использовать дендримерную капсулу (наноконтейнер), которая будет препятствовать образованию фуллереновых агрегатов.
Для того чтобы достичь приемлемой для биологических исследований растворимости производных фуллерена в воде, необходимо ввести в него гидрофильные группы [119]. Одним из возможных решений является синтез производных фуллерена дендримерного типа [120].
Производные фуллерена, не обладающие цитотоксичностью и поглощающиеся клетками, были применены в качестве носителя для противоракового средства паклитаксела и подавляли рост клеток линии MCF-7 рака молочной железы человека [121]. Для обеспечения целенаправленной доставки противоопухолевого препарата доцетаксела (DTX) был создан дендримероподобный переносчик на основе фуллерена С60-PEI-FAc, представлявший собой дендример с внешним слоем из молекул фолиевой кислоты (FAc). Система доставки лекарства была получена введением в корону молекулы доцетаксела. На культивированных раковых клетках РС3 in vitro была показана высокая эффективность проникновения этой системы через клеточные мембраны, усиление апоптоза и повышение противоопухолевого действия. Аналогичное повышение активности по сравнению с немодифицированным DTX было показано в экспериментах in vivo [122].
В исследовании конъюгатов пептидных дендримеров с фуллереном, которое запланировано в данном Проекте, ожидается образование кластеров меньшего размера вплоть до отдельных макромолекул. Это связано с тем, что в водном растворе используемые нами лизиновые и лизинсодержащие дендримеры являются положительно заряженными макроионами, поэтому их электростатическое взаимодействие будет препятствовать агрегации фуллеренов и фуллеренолов.
Также планируется исследование возможности создания комплексов, состоящих из сополимерного пептидного дендримера, в котором внутренняя часть менее гидрофильна за счет использования незаряженных аминокислотных вставок (например, аминокислотных остатков глицина), чем последние генерации (например, с незаряженными разветвленными лизиновыми аминокислотными остатками или линейными гидрофобными остатками). Тогда внутренняя область дендримера будет являться ловушкой для фуллеренов или фуллеренолов. Отметим, что даже у фуллеренолов с 24-40 гидроксилированными группами часть поверхности остается гидрофобной, что приводят к их агрегации. При этом дендримерные комплексы с фуллереном или его производными будут обладать размерами 3-10 нм в диаметре, что сохранит их биологическую привлекательность, в том числе высокую проникающую способность, особенно, в раковые клетки с помощью хорошо известного EPR (enhanced penetration & retention) эффекта.
Важно отметить, что несмотря наличия некоторого числа исследований конъюгатов дендримеров с фуллеренами [120-122], исследований комплексов дендримеров с фуллеренами (или фуллереновыми производными) для биомедицинских приложений, вообще, и для антиамилоидных и антираковых приложений, в частности, в литературе почти нет (кроме одной, ранее упоминавшейся, статьи [86]).

Литература
1. Svenson, S. Dendrimers as Versatile Platform in Drug Delivery Applications. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009, 71, 445–462, doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ejpb.2008.09.023.
2. Santos, A.; Veiga, F.; Figueiras, A. Dendrimers as Pharmaceutical Excipients: Synthesis, Properties, Toxicity and Biomedical Applications. Mater. 2020, 13.
3. Denkewalter, R. G.; Kolc, J.; Lukasavage, W.J. Macromolecular Highly Branched Homogeneous Compound Based on Lysine Units 1981.
4. Tomalia, D.A.; Baker, H.; Dewald, J.; Hall, M.; Kallos, G.; Martin, S.; Roeck, J.; Ryder, J.; Smith, P. A New Class of Polymers: Starburst-Dendritic Macromolecules. Polym J 1985, 17, 117–132, doi:10.1295/polymj.17.117.
5. Telwatte, S.; Moore, K.; Johnson, A.; Tyssen, D.; Sterjovski, J.; Aldunate, M.; Gorry, P.R.; Ramsland, P.A.; Lewis, G.R.; Paull, J.R.A.; et al. Virucidal Activity of the Dendrimer Microbicide SPL7013 against HIV-1. Antiviral Res. 2011, 90, 195–199, doi:10.1016/j.antiviral.2011.03.186.
6. Relaño-Rodríguez, I.; Juárez-Sánchez, R.; Pavicic, C.; Muñoz, E.; Muñoz-Fernández, M.Á. Polyanionic Carbosilane Dendrimers as a New Adjuvant in Combination with Latency Reversal Agents for HIV Treatment. J. Nanobiotechnology 2019, 17, 69, doi:10.1186/s12951-019-0500-4.
7. Majoros, I.; Baker, J.J.R. Dendrimer-Based Nanomedicine; Majoros, I.J., Baker, J.R., Eds.; Pan Stanford Publishing, 2008; ISBN 9789814241045.
8. Grinstaff, M.W. Dendritic Macromers for Hydrogel Formation: Tailored Materials for Ophthalmic, Orthopedic, and Biotech Applications. J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2008, 46, 383–400, doi:10.1002/pola.22525.
9. Chis, A.A.; Dobrea, C.; Morgovan, C.; Arseniu, A.M.; Rus, L.L.; Butuca, A.; Juncan, A.M.; Totan, M.; Vonica-Tincu, A.L.; Cormos, G.; et al. Applications and Limitations of Dendrimers in Biomedicine. Molecules 2020, 25, 3982, doi:10.3390/molecules25173982.
10. Boas, U.; Christensen, J.B.; Heegaard, P.M.H.; Peng, L. Dendrimers in Medicine and Biotechnology; The Royal Society of Chemistry, 2006; ISBN 978-0-85404-852-6.
11. Allen, T.M.; Cullis, P.R. Drug Delivery Systems: Entering the Mainstream. Science (80-. ). 2004, 303, 1818–1822, doi:10.1126/science.1095833.
12. Sosnik, A.; Carcaboso, A.; Chiappetta, D. Polymeric Nanocarriers: New Endeavors for the Optimization of the Technological Aspects of Drugs. Recent Patents Biomed. Eng. 2008, 1, 43–59, doi:10.2174/1874764710801010043.
13. Tyshenko, M.G. Medical Nanotechnology Using Genetic Material and the Need for Precaution in Design and Risk Assessments. Int. J. Nanotechnol. 2008, 5, 116–123, doi:10.1504/IJNT.2008.016551.
14. Veldhoen, S.; Laufer, S.; Restle, T. Recent Developments in Peptide-Based Nucleic Acid Delivery. Int. J. Mol. Sci. 2008, 9, 1276–1320, doi:10.3390/ijms9071276.
15. Cheng, Y.; Xu, T. The Effect of Dendrimers on the Pharmacodynamic and Pharmacokinetic Behaviors of Non-Covalently or Covalently Attached Drugs. Eur. J. Med. Chem. 2008, 43, 2291–2297, doi:10.1016/j.ejmech.2007.12.021.
16. Yellepeddi, V.K.; Kumar, A.; Palakurthi, S. Surface Modified Poly(Amido)Amine Dendrimers as Diverse Nanomolecules for Biomedical Applications. Expert Opin. Drug Deliv. 2009, 6, 835–850, doi:10.1517/17425240903061251.
17. Gorain, B.; Choudhury, H.; Pandey, M.; Mohd Amin, M.C.I.; Singh, B.; Gupta, U.; Kesharwani, P. Dendrimers as Effective Carriers for the Treatment of Brain Tumor. In Nanotechnology-Based Targeted Drug Delivery Systems for Brain Tumors; Elsevier, 2018; pp. 267–305.
18. Liu, M.; Fréchet, J.M.J. Designing Dendrimers for Drug Delivery. Pharm. Sci. Technolo. Today 1999, 2, 393–401, doi:https://doi.org/10.1016/S1461-5347(99)00203-5.
19. Kharwade, R.; More, S.; Warokar, A.; Agrawal, P.; Mahajan, N. Starburst Pamam Dendrimers: Synthetic Approaches, Surface Modifications, and Biomedical Applications. Arab. J. Chem. 2020, 13, 6009–6039, doi:10.1016/j.arabjc.2020.05.002.
20. Esfand, R.; Tomalia, D.A. Poly(Amidoamine) (PAMAM) Dendrimers: From Biomimicry to Drug Delivery and Biomedical Applications. Drug Discov. Today 2001, 6, 427–436, doi:http://dx.doi.org/10.1016/S1359-6446(01)01757-3.
21. Filipczak, N.; Yalamarty, S.S.K.; Li, X.; Parveen, F.; Torchilin, V. Developments in Treatment Methodologies Using Dendrimers for Infectious Diseases. Molecules 2021, 26, 3304, doi:10.3390/molecules26113304.
22. Ely, T.O.; Sharma, M.; Lesniak, W.; Klippenstein, D.L.; Foster, B.A.; Balogh, L.P. Dendrimer Nanocomposites as Multifunctional X-Ray Contrast Agents. MRS Proc. 2007, 1064, 1064-PP06-18, doi:10.1557/PROC-1064-PP06-18.
23. Khan, M.K.; Nigavekar, S.S.; Minc, L.D.; Kariapper, M.S.T.; Nair, B.M.; Lesniak, W.G.; Balogh, L.P. In Vivo Biodistribution of Dendrimers and Dendrimer Nanocomposites — Implications for Cancer Imaging and Therapy. Technol. Cancer Res. Treat. 2005, 4, 603–613, doi:10.1177/153303460500400604.
24. Maysinger, D.; Zhang, Q.; Kakkar, A. Dendrimers as Modulators of Brain Cells. Molecules 2020, 25, 4489, doi:10.3390/molecules25194489.
25. Muntimadugu, E.; Dhommati, R.; Jain, A.; Challa, V.G.S.; Shaheen, M.; Khan, W. Intranasal Delivery of Nanoparticle Encapsulated Tarenflurbil: A Potential Brain Targeting Strategy for Alzheimer’s Disease. Eur. J. Pharm. Sci. 2016, 92, 224–234, doi:10.1016/j.ejps.2016.05.012.
26. Sorokina, S.A.; Shifrina, Z.B. Dendrimers as Antiamyloid Agents. Pharmaceutics 2022, 14, 760, doi:10.3390/pharmaceutics14040760.
27. Duncan, R.; Izzo, L. Dendrimer Biocompatibility and Toxicity. Adv. Drug Deliv. Rev. 2005, 57, 2215–2237, doi:10.1016/J.ADDR.2005.09.019.
28. Sadler, K.; Tam, J.P.; Kristen Sadler; Tam, J.P.; K. Sadler; Tam, J.P. Peptide Dendrimers: Applications and Synthesis. Rev. Mol. Biotechnol. 2002, 90, 195–229, doi:10.1016/S1389-0352(01)00061-7.
29. Singh, S.K.; Sharma, V.K. Dendrimers: A Class of Polymer in the Nanotechnology for Drug Delivery. In Nanomedicine for Drug Delivery and Therapeutics; John Wiley & Sons, Inc.: Hoboken, NJ, USA, 2013; pp. 373–409 ISBN 9781118414095.
30. Martinho, N.; Silva, L.C.; Florindo, H.F.; Brocchini, S.; Zloh, M.; Barata, T.S. Rational Design of Novel, Fluorescent, Tagged Glutamic Acid Dendrimers with Different Terminal Groups and in Silico Analysis of Their Properties. Int. J. Nanomedicine 2017, 12, 7053–7073, doi:10.2147/IJN.S135475.
31. Hsu, H.; Bugno, J.; Lee, S.; Hong, S. Dendrimer‐based Nanocarriers: A Versatile Platform for Drug Delivery. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology 2017, 9, 1–21, doi:10.1002/wnan.1409.
32. Palmerston Mendes, L.; Pan, J.; Torchilin, V. Dendrimers as Nanocarriers for Nucleic Acid and Drug Delivery in Cancer Therapy. Molecules 2017, 22, 1401, doi:10.3390/molecules22091401.
33. Kuang, T.; Fu, D.; Chang, L.; Yang, Z.; Chen, Z.; Jin, L.; Chen, F.; Peng, X. Recent Progress in Dendrimer-Based Gene Delivery Systems. Curr. Org. Chem. 2016, 20, 1820–1826, doi:10.2174/1385272820666151123235059.
34. Pompilio, A.; Geminiani, C.; Mantini, P.; Siriwardena, T.N.; Di Bonaventura, I.; Reymond, J.L.; Di Bonaventura, G. Peptide Dendrimers as “Lead Compounds” for the Treatment of Chronic Lung Infections by Pseudomonas Aeruginosa in Cystic Fibrosis Patients: In Vitro and in Vivo Studies. Infect. Drug Resist. 2018, Volume 11, 1767–1782, doi:10.2147/IDR.S168868.
35. Ben Jeddou, F.; Falconnet, L.; Luscher, A.; Siriwardena, T.; Reymond, J.-L.; van Delden, C.; Köhler, T. Adaptive and Mutational Responses to Peptide Dendrimer Antimicrobials in Pseudomonas Aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 2020, 64, doi:10.1128/AAC.02040-19.
36. Kawano, Y.; Jordan, O.; Hanawa, T.; Borchard, G.; Patrulea, V. Are Antimicrobial Peptide Dendrimers an Escape from ESKAPE? Adv. Wound Care 2020, 9, 378–395, doi:10.1089/wound.2019.1113.
37. Cañas-Arranz, R.; de León, P.; Forner, M.; Defaus, S.; Bustos, M.J.; Torres, E.; Andreu, D.; Blanco, E.; Sobrino, F. Immunogenicity of a Dendrimer B2T Peptide Harboring a T-Cell Epitope From FMDV Non-Structural Protein 3D. Front. Vet. Sci. 2020, 7, doi:10.3389/fvets.2020.00498.
38. Crespo, L.; Sanclimens, G.; Pons, M.; Giralt, E.; Royo, M.; Albericio, F. Peptide and Amide Bond-Containing Dendrimers. Chem. Rev. 2005, 105, 1663–1681, doi:10.1021/cr030449l.
39. Johansson, E.M.V.; Crusz, S.A.; Kolomiets, E.; Buts, L.; Kadam, R.U.; Cacciarini, M.; Bartels, K.-M.; Diggle, S.P.; Cámara, M.; Williams, P.; et al. Inhibition and Dispersion of Pseudomonas Aeruginosa Biofilms by Glycopeptide Dendrimers Targeting the Fucose-Specific Lectin LecB. Chem. Biol. 2008, 15, 1249–1257, doi:10.1016/j.chembiol.2008.10.009.
40. Cooper, B.M.; Iegre, J.; O’ Donovan, D.H.; Ölwegård Halvarsson, M.; Spring, D.R. Peptides as a Platform for Targeted Therapeutics for Cancer: Peptide–Drug Conjugates (PDCs). Chem. Soc. Rev. 2021, 50, 1480–1494, doi:10.1039/D0CS00556H.
41. Hegde, N.; Velingkar, V.; Prabhakar, B. An Update on Design and Pharmacology of Dendritic Poly(l-Lysine). Int. J. Pept. Res. Ther. 2019, 25, 1539–1562, doi:10.1007/s10989-018-9798-2.
42. Chen, S.; Huang, S.; Li, Y.; Zhou, C. Recent Advances in Epsilon-Poly-L-Lysine and L-Lysine-Based Dendrimer Synthesis, Modification, and Biomedical Applications. Front. Chem. 2021, 9, doi:10.3389/fchem.2021.659304.
43. Thompson, M.; Scholz, C. Highly Branched Polymers Based on Poly(Amino Acid)s for Biomedical Application. Nanomaterials 2021, 11, 1119, doi:10.3390/nano11051119.
44. Gorzkiewicz, M.; Konopka, M.; Janaszewska, A.; Tarasenko, I.I.; Sheveleva, N.N.; Gajek, A.; Neelov, I.M.; Klajnert-Maculewicz, B. Application of New Lysine-Based Peptide Dendrimers D3K2 and D3G2 for Gene Delivery: Specific Cytotoxicity to Cancer Cells and Transfection in Vitro. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103504, doi:10.1016/j.bioorg.2019.103504.
45. Gorzkiewicz, M.; Kopeć, O.; Janaszewska, A.; Konopka, M.; Pędziwiatr-Werbicka, E.; Tarasenko, I.I.; Bezrodnyi, V. V; Neelov, I.M.; Klajnert-Maculewicz, B. Poly(Lysine) Dendrimers Form Complexes with SiRNA and Provide Its Efficient Uptake by Myeloid Cells: Model Studies for Therapeutic Nucleic Acid Delivery. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 3138, doi:10.3390/ijms21093138.
46. Stelzmann, R.A.; Norman Schnitzlein, H.; Reed Murtagh, F. An English Translation of Alzheimer’s 1907 Paper, “Uber Eine Eigenartige Erkankung Der Hirnrinde.” Clin. Anat. 1995, 8, 429–431, doi:10.1002/ca.980080612.
47. Knopman, D.S.; Amieva, H.; Petersen, R.C.; Chételat, G.; Holtzman, D.M.; Hyman, B.T.; Nixon, R.A.; Jones, D.T. Alzheimer Disease. Nat. Rev. Dis. Prim. 2021, 7, 33, doi:10.1038/s41572-021-00269-y.
48. Lynch, C. World Alzheimer Report 2019: Attitudes to Dementia, a Global Survey. Alzheimer’s Dement. 2020, 16, doi:10.1002/alz.038255.
49. DeTure, M.A.; Dickson, D.W. The Neuropathological Diagnosis of Alzheimer’s Disease. Mol. Neurodegener. 2019, 14, 32, doi:10.1186/s13024-019-0333-5.
50. Tolar, M.; Hey, J.; Power, A.; Abushakra, S. Neurotoxic Soluble Amyloid Oligomers Drive Alzheimer’s Pathogenesis and Represent a Clinically Validated Target for Slowing Disease Progression. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 6355, doi:10.3390/ijms22126355.
51. Bejanin, A.; Schonhaut, D.R.; La Joie, R.; Kramer, J.H.; Baker, S.L.; Sosa, N.; Ayakta, N.; Cantwell, A.; Janabi, M.; Lauriola, M.; et al. Tau Pathology and Neurodegeneration Contribute to Cognitive Impairment in Alzheimer’s Disease. Brain 2017, 140, 3286–3300, doi:10.1093/brain/awx243.
52. Довидченко, Н.В.; Леонова, Е.И.; Галзитская, О.В. Механизмы Образования Амилоидных Фибрилл. Успехи биологической химии 2014, 54, 203–230.
53. O’Brien, R.J.; Wong, P.C. Amyloid Precursor Protein Processing and Alzheimer’s Disease. Annu. Rev. Neurosci. 2011, 34, 185–204, doi:10.1146/annurev-neuro-061010-113613.
54. Lane, C.A.; Hardy, J.; Schott, J.M. Alzheimer’s Disease. Eur. J. Neurol. 2018, 25, 59–70, doi:10.1111/ene.13439.
55. Kollmer, M.; Close, W.; Funk, L.; Rasmussen, J.; Bsoul, A.; Schierhorn, A.; Schmidt, M.; Sigurdson, C.J.; Jucker, M.; Fändrich, M. Cryo-EM Structure and Polymorphism of Aβ Amyloid Fibrils Purified from Alzheimer’s Brain Tissue. Nat. Commun. 2019, 10, 4760, doi:10.1038/s41467-019-12683-8.
56. Makin, S. The Amyloid Hypothesis on Trial. Nature 2018, 559, S4–S7, doi:10.1038/d41586-018-05719-4.
57. Chen, Z.; Krause, G.; Reif, B. Structure and Orientation of Peptide Inhibitors Bound to Beta-Amyloid Fibrils. J. Mol. Biol. 2005, 354, 760–776, doi:10.1016/j.jmb.2005.09.055.
58. Takahashi, T.; Mihara, H. Peptide and Protein Mimetics Inhibiting Amyloid β-Peptide Aggregation. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1309–1318, doi:10.1021/ar8000475.
59. Yang, F.; Lim, G.P.; Begum, A.N.; Ubeda, O.J.; Simmons, M.R.; Ambegaokar, S.S.; Chen, P.P.; Kayed, R.; Glabe, C.G.; Frautschy, S.A.; et al. Curcumin Inhibits Formation of Amyloid β Oligomers and Fibrils, Binds Plaques, and Reduces Amyloid in Vivo. J. Biol. Chem. 2005, 280, 5892–5901, doi:10.1074/jbc.M404751200.
60. Mishra, R.; Sellin, D.; Radovan, D.; Gohlke, A.; Winter, R. Inhibiting Islet Amyloid Polypeptide Fibril Formation by the Red Wine Compound Resveratrol. ChemBioChem 2009, 10, 445–449, doi:10.1002/cbic.200800762.
61. Kim, J.E.; Lee, M. Fullerene Inhibits β-Amyloid Peptide Aggregation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 303, 576–579, doi:10.1016/S0006-291X(03)00393-0.
62. Siposova, K.; Petrenko, V.I.; Ivankov, O.I.; Musatov, A.; Bulavin, L.A.; Avdeev, M. V.; Kyzyma, O.A. Fullerenes as an Effective Amyloid Fibrils Disaggregating Nanomaterial. ACS Appl. Mater. Interfaces 2020, 12, 32410–32419, doi:10.1021/acsami.0c07964.
63. Podolski, I.Y.; Podlubnaya, Z.A.; Kosenko, E.A.; Mugantseva, E.A.; Makarova, E.G.; Marsagishvili, L.G.; Shpagina, M.D.; Kaminsky, Y.G.; Andrievsky, G. V.; Klochkov, V.K. Effects of Hydrated Forms of C 60 Fullerene on Amyloid β -Peptide Fibrillization In Vitro and Performance of the Cognitive Task. J. Nanosci. Nanotechnol. 2007, 7, 1479–1485, doi:10.1166/jnn.2007.330.
64. Wang, X.; Weber, J.K.; Liu, L.; Dong, M.; Zhou, R.; Li, J. A Novel Form of β-Strand Assembly Observed in Aβ 33–42 Adsorbed onto Graphene. Nanoscale 2015, 7, 15341–15348, doi:10.1039/C5NR00555H.
65. Li, M.; Zhao, A.; Dong, K.; Li, W.; Ren, J.; Qu, X. Chemically Exfoliated WS2 Nanosheets Efficiently Inhibit Amyloid β-Peptide Aggregation and Can Be Used for Photothermal Treatment of Alzheimer’s Disease. Nano Res. 2015, 8, 3216–3227, doi:10.1007/s12274-015-0821-z.
66. Chafekar, S.M.; Malda, H.; Merkx, M.; Meijer, E.W.; Viertl, D.; Lashuel, H.A.; Baas, F.; Scheper, W. Branched KLVFF Tetramers Strongly Potentiate Inhibition of β-Amyloid Aggregation. ChemBioChem 2007, 8, 1857–1864, doi:10.1002/cbic.200700338.
67. Hilbich, C.; Kisters-Woike, B.; Reed, J.; Masters, C.L.; Beyreuther, K. Substitutions of Hydrophobic Amino Acids Reduce the Amyloidogenicity of Alzheimer’s Disease ΒA4 Peptides. J. Mol. Biol. 1992, 228, 460–473, doi:10.1016/0022-2836(92)90835-8.
68. Tjernberg, L.O.; Näslund, J.; Lindqvist, F.; Johansson, J.; Karlström, A.R.; Thyberg, J.; Terenius, L.; Nordstedt, C. Arrest of -Amyloid Fibril Formation by a Pentapeptide Ligand. J. Biol. Chem. 1996, 271, 8545–8548, doi:10.1074/jbc.271.15.8545.
69. Tjernberg, L.O.; Lilliehöök, C.; Callaway, D.J.E.; Näslund, J.; Hahne, S.; Thyberg, J.; Terenius, L.; Nordstedt, C. Controlling Amyloid β-Peptide Fibril Formation with Protease-Stable Ligands. J. Biol. Chem. 1997, 272, 12601–12605, doi:10.1074/jbc.272.19.12601.
70. Watanabe, K.; Nakamura, K.; Akikusa, S.; Okada, T.; Kodaka, M.; Konakahara, T.; Okuno, H. Inhibitors of Fibril Formation and Cytotoxicity of β-Amyloid Peptide Composed of KLVFF Recognition Element and Flexible Hydrophilic Disrupting Element. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290, 121–124, doi:10.1006/bbrc.2001.6191.
71. Lowe, T.L.; Strzelec, A.; Kiessling, L.L.; Murphy, R.M. Structure−Function Relationships for Inhibitors of β-Amyloid Toxicity Containing the Recognition Sequence KLVFF. Biochemistry 2001, 40, 7882–7889, doi:10.1021/bi002734u.
72. Zhang, G.; Leibowitz, M.J.; Sinko, P.J.; Stein, S. Multiple-Peptide Conjugates for Binding β-Amyloid Plaques of Alzheimer’s Disease. Bioconjug. Chem. 2003, 14, 86–92, doi:10.1021/bc025526i.
73. Chacón, M.A.; Barría, M.I.; Soto, C.; Inestrosa, N.C. β-Sheet Breaker Peptide Prevents Aβ-Induced Spatial Memory Impairments with Partial Reduction of Amyloid Deposits. Mol. Psychiatry 2004, 9, 953–961, doi:10.1038/sj.mp.4001516.
74. Klajnert, B.; Cortijo-Arellano, M.; Cladera, J.; Bryszewska, M. Influence of Dendrimer’s Structure on Its Activity against Amyloid Fibril Formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 345, 21–28, doi:10.1016/j.bbrc.2006.04.041.
75. Fülöp, L.; Mándity, I.M.; Juhász, G.; Szegedi, V.; Hetényi, A.; Wéber, E.; Bozsó, Z.; Simon, D.; Benkő, M.; Király, Z.; et al. A Foldamer-Dendrimer Conjugate Neutralizes Synaptotoxic β-Amyloid Oligomers. PLoS One 2012, 7, e39485, doi:10.1371/journal.pone.0039485.
76. Klementieva, O.; Benseny-Cases, N.; Gella, A.; Appelhans, D.; Voit, B.; Cladera, J. Dense Shell Glycodendrimers as Potential Nontoxic Anti-Amyloidogenic Agents in Alzheimer’s Disease. Amyloid–Dendrimer Aggregates Morphology and Cell Toxicity. Biomacromolecules 2011, 12, 3903–3909, doi:10.1021/bm2008636.
77. Klajnert, B.; Cladera, J.; Bryszewska, M. Molecular Interactions of Dendrimers with Amyloid Peptides: PH Dependence. Biomacromolecules 2006, 7, 2186–2191, doi:10.1021/bm060229s.
78. Wasiak, T.; Ionov, M.; Nieznanski, K.; Nieznanska, H.; Klementieva, O.; Granell, M.; Cladera, J.; Majoral, J.-P.; Caminade, A.M.; Klajnert, B. Phosphorus Dendrimers Affect Alzheimer’s (Aβ 1–28 ) Peptide and MAP-Tau Protein Aggregation. Mol. Pharm. 2012, 9, 458–469, doi:10.1021/mp2005627.
79. Wasiak, T.; Marcinkowska, M.; Pieszynski, I.; Zablocka, M.; Caminade, A.-M.; Majoral, J.-P.; Klajnert-Maculewicz, B. Cationic Phosphorus Dendrimers and Therapy for Alzheimer’s Disease. New J. Chem. 2015, 39, 4852–4859, doi:10.1039/C5NJ00309A.
80. Neelov, I.M.; Janaszewska, A.; Klajnert, B.; Bryszewska, M.; Makova, N.Z.; Hicks, D.; Pearson, H.A.; Vlasov, G.P.; Ilyash, M.Y.; Vasilev, D.S.; et al. Molecular Properties of Lysine Dendrimers and Their Interactions with Aβ-Peptides and Neuronal Cells. Curr. Med. Chem. 2012, 20, 134–143, doi:10.2174/0929867311302010013.
81. Walsh, S.; Merrick, R.; Milne, R.; Brayne, C. Aducanumab for Alzheimer’s Disease? BMJ 2021, n1682, doi:10.1136/bmj.n1682.
82. van Dyck, C.H.; Swanson, C.J.; Aisen, P.; Bateman, R.J.; Chen, C.; Gee, M.; Kanekiyo, M.; Li, D.; Reyderman, L.; Cohen, S.; et al. Lecanemab in Early Alzheimer’s Disease. N. Engl. J. Med. 2023, 388, 9–21, doi:10.1056/NEJMoa2212948.
83. Enache, T.A.; Chiorcea-Paquim, A.-M.; Oliveira-Brett, A.M. Amyloid Beta Peptide VHHQ, KLVFF, and IIGLMVGGVV Domains Involved in Fibrilization: AFM and Electrochemical Characterization. Anal. Chem. 2018, 90, 2285–2292, doi:10.1021/acs.analchem.7b04686.
84. Mamsa, S.S.A.; Meloni, B.P. Arginine and Arginine-Rich Peptides as Modulators of Protein Aggregation and Cytotoxicity Associated With Alzheimer’s Disease. Front. Mol. Neurosci. 2021, 14, doi:10.3389/fnmol.2021.759729.
85. Kujawski, M.; Rakesh, L.; Gala, K.; Jensen, A.; Fahlman, B.; Feng, Z.; Mohanty, D.K. Molecular Dynamics Simulation of Polyamidoamine Dendrimer-Fullerene Conjugates:Generations Zero Through Four. J. Nanosci. Nanotechnol. 2007, 7, 1670–1674, doi:10.1166/jnn.2007.452.
86. A. Kulchitsky, V.; Alexandrova, R.; Suziedelis, K.; G. Paschkevich, S.; I. Potkin, V. Perspectives of Fullerenes, Dendrimers, and Heterocyclic Compounds Application in Tumor Treatment. Recent Patents Nanomed. 2015, 4, 82–89, doi:10.2174/1877912305999150212114954.
87. Карпачева, Г.П. Фуллереносодержащие полимеры. Высокомолекулярные соединения. Серия С 2000, 42, 1974–1999.
88. Бадамшина, Э.Р.; Гафурова, М.П. Модификация свойств полимеров путем допирования фуллереном С60. Высокомолекулярные соединения. Серия Б 2008, 50, 1572–1584.
89. Friedman, S.H.; DeCamp, D.L.; Sijbesma, R.P.; Srdanov, G.; Wudl, F.; Kenyon, G.L. Inhibition of the HIV-1 protease by fullerene derivatives: model building studies and experimental verification. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 6506–6509.
90. Sijbesma, R.; Srdanov, G.; Wudl, F.; Castoro, J.A.; Wilkins, C.; Friedman, S.H.; DeCamp, D.L.; Kenyon, G.L. Synthesis of a fullerene derivative for the inhibition of HIV enzymes. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 6510–6512.
91. Penkova, A. V; Acquah, S.F.; Piotrovskiy, L.B.; Markelov, D.A.; Semisalova, A.S.; Kroto, H.W. Fullerene derivatives as nano-additives in polymer composites. Russ. Chem. Rev. 2017, 86, 530–566.
92. Dugan, L.L.; Turetsky, D.M.; Du, C.; Lobner, D.; Wheeler, M.; Almli, C.R.; Shen, C.K.-F.; Luh, T.-Y.; Choi, D.W.; Lin, T.-S. Carboxyfullerenes as neuroprotective agents. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 9434–9439.
93. Lin, Y.-L.; Lei, H.-Y.; Wen, Y.-Y.; Luh, T.-Y.; Chou, C.-K.; Liu, H.-S. Light-Independent Inactivation of Dengue-2 Virus by Carboxyfullerene C3 Isomer. Virology 2000, 275, 258–262.
94. Piotrovsky, L.B.; Kiselev, O.I. Fullerenes and Viruses. Fullerenes, Nanotub. Carbon Nanostructures 2005, 12, 397–403.
95. Bosi, S.; Da Ros, T.; Spalluto, G.; Prato, M. Fullerene derivatives: an attractive tool for biological applications. Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 913–923.
96. Tsao, N.; Luh, T.-Y.; Chou, C.-K.; Chang, T.-Y.; Wu, J.-J.; Liu, C.-C.; Lei, H.-Y. In vitro action of carboxyfullerene. J. Antimicrob. Chemother. 2002, 49, 641–649.
97. Mroz, P.; Tegos, G.P.; Gali, H.; Wharton, T.; Sarna, T.; Hamblin, M.R. Photodynamic therapy with fullerenes. Photochem. Photobiol. Sci. 2007, 6, 1139.
98. Horie, M.; Nishio, K.; Kato, H.; Shinohara, N.; Nakamura, A.; Fujita, K.; Kinugasa, S.; Endoh, S.; Yoshida, Y.; Hagihara, Y.; et al. In vitro evaluation of cellular influences induced by stable fullerene C70 medium dispersion: Induction of cellular oxidative stress. Chemosphere 2013, 93, 1182–1188.
99. Nishizawa, C.; Hashimoto, N.; Yokoo, S.; Funakoshi-Tago, M.; Kasahara, T.; Takahashi, K.; Nakamura, S.; Mashino, T. Pyrrolidinium-type fullerene derivative-induced apoptosis by the generation of reactive oxygen species in HL-60 cells. Free Radic. Res. 2009, 43, 1240–1247.
100. Chen, Z.; Mao, R.; Liu, Y. Fullerenes for Cancer Diagnosis and Therapy: Preparation, Biological and Clinical Perspectives. Curr. Drug Metab. 2012, 13, 1035–1045.
101. Dou, Z.; Xu, Y.; Sun, H.; Liu, Y. Synthesis of PEGylated fullerene–5-fluorouracil conjugates to enhance the antitumor effect of 5-fluorouracil. Nanoscale 2012, 4, 4624.
102. Cheng, L.; Wang, C.; Feng, L.; Yang, K.; Liu, Z. Functional Nanomaterials for Phototherapies of Cancer. Chem. Rev. 2014, 114, 10869–10939.
103. Doi, Y.; Ikeda, A.; Akiyama, M.; Nagano, M.; Shigematsu, T.; Ogawa, T.; Takeya, T.; Nagasaki, T. Intracellular Uptake and Photodynamic Activity of Water‐Soluble [60]‐ and [70]Fullerenes Incorporated in Liposomes. Chem. – A Eur. J. 2008, 14, 8892–8897.
104. Jiang, G.; Zheng, Q.; Yang, D. Synthesis of a water-soluble fullerene derivative nanoball and its biological activity. J. Appl. Polym. Sci. 2006, 99, 2874–2877.
105. Liu, J.; Tabata, Y. Photodynamic therapy of fullerene modified with pullulan on hepatoma cells. J. Drug Target. 2010, 18, 602–610.
106. Liu, J.; Tabata, Y. Photodynamic Antitumor Activity of Fullerene Modified with Poly(ethylene glycol) with Different Molecular Weights and Terminal Structures. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2011, 22, 297–312.
107. Chen, C.; Xing, G.; Wang, J.; Zhao, Y.; Li, B.; Tang, J.; Jia, G.; Wang, T.; Sun, J.; Xing, L.; et al. Multihydroxylated [Gd@C 82 (OH) 22] n Nanoparticles: Antineoplastic Activity of High Efficiency and Low Toxicity. Nano Lett. 2005, 5, 2050–2057.
108. Meng, J.; Liang, X.; Chen, X.; Zhao, Y. Biological characterizations of [Gd@C82(OH)22] n nanoparticles as fullerene derivatives for cancer therapy. Integr. Biol. 2013, 5, 43–47.
109. Liu, Y.; Jiao, F.; Qiu, Y.; Li, W.; Lao, F.; Zhou, G.; Sun, B.; Xing, G.; Dong, J.; Zhao, Y.; et al. The effect of Gd@C82(OH)22 nanoparticles on the release of Th1/Th2 cytokines and induction of TNF-α mediated cellular immunity. Biomaterials 2009, 30, 3934–3945.
110. Shu, C.-Y.; Ma, X.-Y.; Zhang, J.-F.; Corwin, F.D.; Sim, J.H.; Zhang, E.-Y.; Dorn, H.C.; Gibson, H.W.; Fatouros, P.P.; Wang, C.-R.; et al. Conjugation of a Water-Soluble Gadolinium Endohedral Fulleride with an Antibody as a Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent. Bioconjug. Chem. 2008, 19, 651–655.
111. Zhen, M.; Zheng, J.; Ye, L.; Li, S.; Jin, C.; Li, K.; Qiu, D.; Han, H.; Shu, C.; Yang, Y.; et al. Maximizing the Relaxivity of Gd-Complex by Synergistic Effect of HSA and Carboxylfullerene. ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 3724–3729.
112. Injac, R.; Prijatelj, M.; Strukelj, B. Fullerenol Nanoparticles: Toxicity and Antioxidant Activity. In; 2013; pp. 75–100.
113. Rebecca, M.; Hsing-Lin, W.; Jun, G.; Srinivas, I.; Gabriel, M.A.; Jennifer, M.; Andrew, S.P.; Yuping, B.; Chun-Chih, W.; Zhong, C.; et al. Impact of physicochemical properties of engineered fullerenes on key biological responses. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009, 234, 58–67.
114. Belgorodsky, B.; Fadeev, L.; Kolsenik, J.; Gozin, M. Formation of a Soluble Stable Complex between Pristine C60-Fullerene and a Native Blood Protein. ChemBioChem 2006, 7, 1783–1789.
115. Li, S.; Zhao, X.; Mo, Y.; Cummings, P.T.; Heller, W.T. Human serum albumin interactions with C60 fullerene studied by spectroscopy, small-angle neutron scattering, and molecular dynamics simulations. J. Nanoparticle Res. 2013, 15, 1769.
116. Deguchi, S.; Yamazaki, T.; Mukai, S.; Usami, R.; Horikoshi, K. Stabilization of C 60 Nanoparticles by Protein Adsorption and Its Implications for Toxicity Studies. Chem. Res. Toxicol. 2007, 20, 854–858.
117. Gharbi, N.; Pressac, M.; Hadchouel, M.; Szwarc, H.; Wilson, S.R.; Moussa, F. [60]Fullerene is a Powerful Antioxidant in Vivo with No Acute or Subacute Toxicity. Nano Lett. 2005, 5, 2578–2585.
118. Brant, J.A.; Labille, J.; Bottero, J.-Y.; Wiesner, M.R. Characterizing the Impact of Preparation Method on Fullerene Cluster Structure and Chemistry. Langmuir 2006, 22, 3878–3885.
119. Witte, P.; Beuerle, F.; Hartnagel, U.; Lebovitz, R.; Savouchkina, A.; Sali, S.; Guldi, D.; Chronakis, N.; Hirsch, A. Water solubility, antioxidant activity and cytochrome C binding of four families of exohedral adducts of C60 and C70. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 3599.
120. Dumpis, M.A.; Nikolayev, D.N.; Litasova, E. V; Iljin, V. V; Brusina, M.A.; Piotrovsky, L.B. Biological activity of fullerenes - reality and prospects. Rev. Clin. Pharmacol. Drug Ther. 2018, 16, 4–20.
121. Partha, R.; Mitchell, L.R.; Lyon, J.L.; Joshi, P.P.; Conyers, J.L. Buckysomes: Fullerene-Based Nanocarriers for Hydrophobic Molecule Delivery. ACS Nano 2008, 2, 1950–1958.
122. Shi, J.; Zhang, H.; Wang, L.; Li, L.; Wang, H.; Wang, Z.; Li, Z.; Chen, C.; Hou, L.; Zhang, C.; et al. PEI-derivatized fullerene drug delivery using folate as a homing device targeting to tumor. Biomaterials 2013, 34, 251–261.

4.3.7.6. Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок
выполнения проекта.
Структуры и комплексы, которые планируется генерировать (in silico)), синтезировать и исследовать экспериментально в различных растворителях:
1) Амфифильные пептидные дендримеры, содержащие положительно заряженные аминокислотные остатки Lys или/и Arg или/и Hisp и остатки с циклическими боковыми группами Phe или/и Tyr или/и Trp или/и His.
2)Фуллерены С60 или/и С70. Фуллеренолы С60(OH)n, где n=12 или/и 24 или/и 36.
3) Амилоидные фибриллы, состоящие из Aβ1-40 или/и Aβ1-42 амилоидных пептидов или их фрагментов (например, Aβ17-23 или/и Aβ13-23 или/и Aβ7-23 или/и Aβ1-28 или/и Aβ10-36 (элементы которых находятся в различных конформациях, определенных ранее экспериментально или с помощью компьютерного моделирования)).
4) Комплексы пептидных дендримеров с фуллеренами и фуллеренолами.
5) Комплексы пептидных дендримеров с фибриллами.
6) Комплексы фуллеренов и фуллеренолов с амилоидными фибриллами.
7)Растворители: вода, спирт, pyrrolidone, n-methyl pyrrolidone (NMP).

Предлагаемые методы и подходы
1.Молекулярно динамическое моделирование на полноатомных моделях.
В проекте планируется исследовать методами атомистического молекулярно-динамического (МД) моделирования способность новых пептидных дендримеров образовывать комплексы с фуллеренами и фуллеренолами как для доставки этих антиамилоидных и антираковых агентов в целевые клетки, так и для исследования совместного антиамилоидного действия в составе комплекса (дендример, фуллерен или фуллеренол и активный растворитель).
Для решения поставленных задач по моделированию взаимодействия дендримеров, фуллеренов или фуллеренолов и бета-амилоидных пептидов или фрагментов амилоидных фибрилл будут применены методы молекулярно-динамического (МД) моделирования c использованием полноатомных моделей. Применение метода МД и полноатомных моделей необходимо для детального описания специфических взаимодействий различных и особенно циклических групп дендримеров, фуллеренов и бета-амилоидными пептидов, а также циклических групп некоторых растворителей.
Для создания начальных конфигураций дендримеров будет использована методика многостадийной релаксации дендримера и всей системы, разработанная участниками Проекта. Согласно данной методике, модельный дендример собирается из дендримеров предыдущих поколений дивергентным методом с минимизацией энергии и расчетом последующих коротких траекторий методом МД на каждой стадии сборки. При этом минимизация на начальных стадиях моделирования ведется с наложенными дополнительными связями, препятствующими переходу каждой из пептидных связей из низкоэнергетической транс-конформации в долгоживущую метастабильную цис-конформацию.
Для моделирования амилоидных Aβ фибрилл будут использованы конформации как полученные синтетически [например, M. Schmidt, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106 (47), 19813-19818], так и недавно выделенные из сосудистых оболочек головного мозга при болезни Альцгеймера [M. Kollmer, et al. Nature communications, 2019, 10(1), 4760]. Все конформации фибрилл, которые будут использоваться в Проекте доступны в Protein Data Bank (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/).
Моделирование будет проводиться с использованием пакета GROMACS (пакет открытого доступа), показавшего высокую эффективность при работе на многопроцессорных компьютерах и GPU кластерах. Имеющихся в распоряжении ресурсов будет достаточно для получения траектории длиной 1-10 мкс, а при необходимости будут получены и более длинные траектории.

2. Химический синтез
2.1. Синтез пептидных дендримеров
Дендримерные макромолекулы на основе L-лизина будут получены методом контролируемого многоступенчатого пептидного синтеза, применяя дивергентную стратегию, согласно которой макромолекулы дендримера формируются путем последовательного наращивания сферических слоев. В этом проекте данная схема позволит осуществить модификацию как внутренних сегментов пептидными вставками, так и поверхностную функционализацию групп дендритных структур. Синтез будет осуществлен с помощью твердофазной методики синтеза пептидов, на полимерной матрице с использованием BOC-стратегии, основного ветвящего компонента N, N–ди(трет-бутилоксикарбонил)-лизина и конденсирующих агентов. В рамках этой методики можно использовать большой избыток реагентов, что позволит подтвердить эффективность сцепления реагирующих групп с помощью тестовой системы, тем самым обеспечивая полноту прохождения реакции, и позволит избежать дефектов в регулярной структуре дендримеров. Выделение и очистка полученных дендримеров после кислотного отщепления (TFMSA/TFA) целевой молекулы с полимерного носителя будет проводиться с помощью метода гель-проникающей хроматографии и метода диализа с использованием мембраны с отсекаемой массой. Структура дендримерных макромолекул будет подтверждена с помощью аминокислотного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ЯМР спектроскопии.

2.2. Синтез фуллеренов и их производных
Высокочистый фуллерен С60 предлагается получать по способу [Грушко Ю.С., Седов В.П., Колесник С.Г. Способ получения фуллерена С60: патент РФ № 2224714, заяв. 06.12.2001. Опубл. 27.02.2004], включающему обогащение исходного экстракта смеси фуллеренов фракционным концентрированием до 96±2% по фуллерену C60, хроматографическую очистку раствора полученного концентрата в ароматическом растворителе на активированном угле. Высокочистый фуллерен С70 предполагается получать по способу, включающему обогащение исходного экстракта по фуллерену C70, хроматографическую очистку активированным углем раствора полученного концентрата в ароматическом растворителе, выделение фуллерена C70 фракционной кристаллизацией и проведение вакуумной сублимационной термообработки [Седов В. П., Колесник С. Г. Способ получения фуллерена С70: патент РФ № 2455230, заяв. 13.08.2010. Опубл. 10.07.2012].
Для получения водорастворимых фуллеренолов С60(ОН)n и С70(ОН)n будет применен новый оригинальный двухстадийный способ [патент РФ №2558121, заяв. 04.04.2014. Опубл. 27.07.2015. Бюл. № 21]. На первой стадии будут получены низкогидроксилированные нерастворимые фуллеренолы путем взаимодействия концентрированного раствора фуллерена в о-ксилоле с водным раствором аммиака в присутствии катализатора межфазового переноса тетрабутиламмониевого гидроксида. На второй стадии полученные низкогидроксилированные нерастворимые фуллеренолы будут переведены в высокогидроксилированные фуллерены посредством смешивания с 6-15%-ным водным раствором пероксида водорода и нагревании в течение 4-5 часов при температуре 65°C. Разработанный способ показал свою эффективность при получения высокочистых (не содержащих примесей щелочного характера) водорастворимых гидроксилированных фуллеренолов.
2.3. Создания комплексов пептидных дендримеров с фуллеренами и фуллеренолами
Комплексы дендример-фуллерен будут получены путем смешения растворов компонент, приготовленных в одном органическом растворителе, и дальнейшего изменения термодинамического качества среды путем добавления воды (улучшая, таким образом, термодинамическое качество итогового смешанного растворителя для лизинового дендримера и ухудшая таковое для фуллерена). Возможность комплексообразования при использовании этой процедуры была предварительно подтверждена до подачи проекта и будет более детально изучена при вариации соотношений дендример/фуллерен, при использовании дендримеров различных генераций и видов фуллерена (С60, С70) и при различной доле воды в смешанном растворителе, что позволит получить информацию о влиянии этих факторов на комплексообразование и разработать стратегию получения комплекса с наилучшими характеристиками. Растворы отдельных компонент и комплексов будут изучены методами динамического рассеяния света, спектроскопии поглощения и ЯМР спектроскопии (путем лиофилизации и перерастворения в дейтерированном растворителе).
Создание комплексов дендример-фуллеренол будет проводится аналогичным методом.

3. Экспериментальные исследования
3.1 ЯМР
Дендримерые комплексы с фуллеренами/фуллеренолами будут исследованы методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Спектроскопия ЯМР является хорошо известным аналитическим методом для определения и подтверждения молекулярной структуры. Будут использованы одномерные и двумерные техники на ядрах 1Н и 13C.
Для получения одномерного протонного (углеродного) спектра будет использована последовательность, состоящая из одного 90°-импульса. Протонный 1H ЯМР спектр с химическими сдвигами и константами взаимодействия дает информацию о количестве протонов (интенсивность сигнала), типах химических групп, и о взаимодействии между группами (спин-спиновые мультиплеты). 13С ЯМР спектр несёт в себе информацию о количестве химически неэквивалентных атомов углерода, содержащихся в молекуле, и типе химических групп, к которой эти углероды принадлежат.
Поскольку дендримеры имеют сложную древовидную структуру, для их анализа необходимо использовать методы двумерной ЯМР гомоядерной (COSY, NOESY), так и гетероядерной (HSQC и HMBC) корреляционной спектроскопии. Методы COSY и NOESY широко используются для получения информации о внутримолекулярном взаимодействии протонов внутри молекулы через химические связи (COSY) и через пространство (NOESY). Это позволяет уточнить химическое строение исследуемой молекулы и ее конформации. Методики гетероядерной 1Н-13C спектроскопии позволяют установить взаимодействие протонов и углеродов, принадлежащих одной группе, (HSQC) и взаимодействующих через 2-4 связи (HMBC). Полученные данные ЯМР спектроскопии позволят получить детальную информацию о структуре исследуемых дендримеров и их комплексов.
Экспериментальные исследования ЯМР релаксации позволяют получить информацию о локальной ориентационной подвижности внутри макромолекулы и дают возможность количественно сравнить ее с данными моделирования. Значения T1 могут быть получены разными методами. Для измерения времени спин-решеточной релаксации будет применяться последовательность “инверсия-восстановление”, которая позволяет получать более точное значение.
Диффузионные ЯМР эксперименты позволяют разрешать различные соединения в смеси на основе их различных коэффициентов диффузии в зависимости от размера и формы молекул или их комплексов. Для измерения поступательной диффузии молекул будут использованы методики ЯМР спектроскопии с импульсным градиентом магнитного поля, в частности последовательность “спиновое эхо с градиентом”. Результаты диффузионных экспериментов позволят оценить размеры рассматриваемых систем и предположить их транспортные свойства.

3.2 Динамическое рассеяние света
Коэффициенты поступательной диффузии D изучаемых объектов в разбавленных растворах будут определяться методом динамического рассеяния света на установке «PhotoCor Complex» (фирма «Фотокор», Россия), снабженной коррелятором реального времени «PhotoCor-FC» (288 каналов) и одномодовым лазером (длина волны 0 = 654 нм). Обработка автокорреляционных функций интенсивности рассеянного света с помощью программы «DynaLS» методом обратного преобразования Лапласа позволяет получать функции распределения интенсивности рассеянного света по временам релаксации τ растворенных объектов в растворе. Из времен релаксации, определенных из положений максимумов указанных выше распределений, можно получить коэффициент диффузии исследованных объектов путем построения зависимости обратного времени релаксации 1/ от квадрата волнового вектора рассеяния, согласно выражению 1/ =Dq^2. Эти зависимости должны иметь линейный характер и проходить через начало координат, что однозначно свидетельствует о диффузионном характере наблюдаемого процесса. Коэффициент поступательной диффузии D0 определяется из экстраполяции концентрационной зависимости D(c) к бесконечному разбавлению. Из наклона этой зависимости, используя вириальное разложение, можно также получить A2 – второй вириальный коэффициент, характеризующий термодинамическое качество растворителя. Гидродинамический радиус Rh молекул или частиц можно оценить по формуле Эйнштейна-Стокса.

3.3. Цитологических исследований на линиях раковых клеток
Оценка безопасности приготовленных в рамках Проекта комплексов дендримеров с фуллеренами/фуллеренолами будет проведена с помощью метода определения дегидрогеназной активности митохондрий (МТТ-тест). МТТ-тест позволит проанализировать жизнедеятельность клеток, после воздействия на них дендримерных комплексов. В основе метода лежит способность живых клеток восстанавливать желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия в пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана, растворимые в ДМСО. Уменьшение оптической плотности опытных проб по сравнению с контрольными, должно быть статистически значимым для заключения о цитотоксическом действии вещества на клетки.
Методом проточной цитометрии будет проанализировано влияние комплекса на клеточный цикл, что позволит сделать вывод о наличии или отсутствии у них цитостатического эффекта. Данный метод дает возможность исследовать одиночные клетки в потоке и отличается высокой производительностью и точностью. В ходе анализа регистрируются сигналы светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки, учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) и внесённых в образец.

Общий план работы на весь срок
В рамках Проекта будет впервые осуществлена генерация (in silico) начальных конформаций, новых пептидных дендримеров, проведены молекулярно-динамические (МД) расчеты и исследованы свойства всех перечисленных в плане работы систем, содержащих в себе молекулы дендримера, фуллерена, фуллеренола, амилоидной протофибрилы и растворителя. Также будет проведен химический синтез новых пептидных дендримеров, экспериментальное исследование свойств этих дендримеров и их комплексов с фуллеренами и фуллеренолами в обычном и диспергирующем растворителе.

Первый год
1. Будет проведено исследование размеров, внутренней структуры и динамики пептидных дендримеров с заряженными и нейтральными аминокислотыми остатками с циклическими боковыми группами в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) и/или их смеси с водой. Будут сгенерированы (in silico) и синтезированы дендримеры с повторяющихся фрагментами (например, Lys2Phe или/и Lys2Tyr или/и Lys2Trp). МД моделирование и экспериментальные исследования будут проведены для всех сгенерированных и синтезированных дендримеров.
2. Будет проведено исследование поведения фуллеренов и фуллеренолов в различных растворителях (например, в пирролидоне и/или N-метил пирролидоне (NMP) или в их смеси с водой). Будут сгенерированы (in silico) и синтезированы фуллерены С60 или/и С70 и рассмотрена их агрегация в зависимости от типа или состава раствора.
3. Будет проведение исследование устойчивости структуры амилоидных протофибрил, состоящих из Aβ1-40 или Aβ1-42 амилоидных пептидов или их фрагментов (например, Aβ17-23 или/и Aβ13-23 или/и Aβ7-23 или/и Aβ1-28 или/и Aβ10-36 (которые находятся в различных начальных конформациях, определенных ранее экспериментально или с помощью компьютерного моделирования) в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) или в их смеси с водой).

Второй год
1. Будут проведены исследования возможности образования, размеров и структуры комплексов пептидных дендримеров (с заряженными и нейтральными аминокислотыми остатками с циклическими боковыми группами, (например, Lys2Phe или/и Lys2Tyr или/и Lys2Trp) с фуллеренами в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) или их смеси с водой..
2. Будут проведены исследования устойчивости амилоидной протофибрилы или/и возможности образования, комплексов пептидных дендримеров (с заряженными и нейтральными аминокислотыми остатками с циклическими боковыми группами (например, Lys2Phe или/и Lys2Tyr или/и Lys2Trp) с амилоидной протофибрилой, в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) или их смеси с водой.
3. Будут проведены исследования устойчивости амилоидной протофибрилы и возможности образования, комплексов фуллеренов с амилоидной протофибрилой, в различных растворителях (например, в пирролидоне (PRL) и/или N-метил пирролидоне (NMP) или их смеси с водой.

Третий год
1. Будут проведены исследования возможности образования, размеров и структуры комплексов пептидных дендримеров (с заряженными и нейтральными аминокислотыми остатками с циклическими боковыми группами, (например, Lys2Phe, Lys2Tyr и Lys2Trp) с фуллеренолами в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) или их смеси с водой.
2. Будут проведены исследования устойчивости амилоидной протофибрилы или/и возможности образования, комплексов пептидных дендримеров (с заряженными спейсерами и нейтральными циклическими концевыми группами (например, Phe, Tyr и Trp) с амилоидной протофибрилой, в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) или их смеси с водой.
3. Будут проведены исследования устойчивости амилоидной протофибрилы или/и возможности образования, комплексов фуллеренолов с амилоидной протофибрилой, в различных растворителях (например, в пирролидоне (PRL) и/или N-метил пирролидоне (NMP) или их смеси с водой.
4. Будут проведено исследование влияния действия фуллеренов и фуллеренолов на раковые клетки в комплексе с различными дендримерами (например, Lys2Phe, Lys2Tyr и Lys2Trp), а также при наличии или в отсутствии диспергирующего растворителя (NMP).

4.3.7.7. Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту (в
данном пункте заполняется текстовое описание задела, а размещение прочей
подтверждающей информации описано в п. 4.3.20).
1) Сгенерированы и промоделированы, а также синтезированы и экспериментально исследованы лизиновые дендримеры (с повторяющимся разветвленным фрагментом Lys) поколений G=1-5,
2) Сгенерированы и промоделированы, а также синтезированы и экспериментально исследованы пептидные дендримеры поколения G=2 с гидрофобными повторяющимися элементами Lys2Gly, Lys2Ala, Lys2Leu, элементами, содержащими положительно заряженные спейсеры Lys2Lys, Lys2Asg и Lys2Hisp (протонированный) и положительно заряженными лизиновыми терминальными группами.
3) Сгенерированы и промоделированы, а также синтезированы и экспериментально исследованы комплексы лизиновых и пептидных дендримеров с повторяющимися элементами Lys и Lys-2Gly с фуллеренами. Продемонстрировано образование устойчивых комплексов со всеми дендримерами и обоими типами фуллеренов (С60 и С70).
4) Сгенерированы, синтезированы и экспериментально исследованы комплексы пептидного дендримера (с повторяющимися элементами Lys-2Gly) с фуллеренолом С60(OH)n, (n=12, 24 и 36). Продемонстрировано образование устойчивых комплексов дендримера с фуллеренолом.

4.3.7.8. Детальный план работы на первый год выполнения проекта.
1. Исследование размеров, внутренней структуры и динамики пептидных дендримеров с заряженными и нейтральными аминокислотными остатками (например, с повторяющимся элементом Lys2Phe, Lys2Tyr и Lys2Trp) с циклическими боковыми группами в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) и/или их смеси с водой (Маркелов, Неелов)
2. Исследование поведения фуллеренов и фуллеренолов в различных растворителях (например, в пирролидоне и/или N-метил пирролидоне (NMP) или в их смеси с водой) (Безродный, Маркелов).
3. Исследование зависимости устойчивости и структуры амилоидных протофибрил, состоящих из Aβ1-40 или Aβ1-42 амилоидных пептидов или их фрагментов (например, Aβ17-23 или/и Aβ13-23 или/и Aβ7-23 или/и Aβ1-28 или/и Aβ10-36 (элементы которых находятся в различных конформациях, определенных ранее экспериментально или с помощью компьютерного моделирования) в различных растворителях (например, в спирте и/или N-метил пирролидоне (NMP) или в их смеси с водой) (Неелов, Безродный).

4.3.7.9. Ожидаемые научные и (или) научно-технические результаты (без перечисления указанных в пп. 4.3.11, 4.3.13, 4.3.14) и их научная новизна и значимость (например, оценка соответствия запланированных результатов мировому уровню исследований, возможность практического использования запланированных результатов).

В первый год
В течение 1-го года будут впервые промоделированы методом молекулярной динамики и синтезированы новые пептидные дендримеры с повторяющимися элементами Lys2Phe, Lys2Tyr и Lys2Trp, содержащими циклические боковые группы, и изучено их действие на амилоидные пептиды в обычном (спирт, вода) и диспергирующем растворителе (NMP).

Во второй год
Впервые будут промоделированы и исследованы экспериментально комплексы новых пептидных дендримеров Lys2Phe, Lys2Tyr и Lys2Trp с фуллеренами С60 и С70 и их совместное действие на амилоидные пептиды в обычном и диспергирующем растворителе.

В третий год
Впервые будут промоделированы и исследованы экспериментально комплексы новых пептидных дендримеров Lys2Phe, Lys2Tyr и Lys2Trp с фуллеренолами С60(OH)n, (n=12, или/и 24 или/и 36) или/и С70(OH)n, (n=12, или/и 24 или/и 36) и их совместное действие на амилоидные пептиды в обычном и диспергирующем растворителе. Также будут получены данные о действии фуллеренов и фуллеренолов и комплексов дендримеров Lys2Phe, Lys2Tyr и Lys2Trp с фуллеренами и фуллеренолами на раковые клетки при наличии/отсутствии диспергирующего растворителя.
Все эти исследования будут проводится впервые, поэтому они не только соответствуют мировому уровню, но и будут определять этот уровень. В случае получения положительных результатов в этих in vitro исследованиях, системы могут быть переданы заинтересованным организациям для дальнейшего исследования in vivo.

4.3.7.10. Планируемый объем дополнительно привлеченных средств из внешних
по отношению к СПбГУ источников за весь период выполнения проекта. Допустимо
размещение всех указанных сведений в файле типа «Заявка», прикрепленном в разделе
«Документы», в таком случае в данной графе указывается название файла.
Результаты, планируемые к публикации в научных периодических изданиях

1) Получен грант РНФ № 23-13-00144 ,2023-2025 гг, (Pure ID 100120567), рук. Маркелов Д.А.
Планируемый объем финансирования на 2025г - 7млн. руб.
2) Подана заявка РНФ № 24-13-00285, 2024-2026 гг, (Pure ID: 114604727) , рук. Неелов И.М..
Планируемый объем финансирования на 2025г - 2026 14 млн. руб.
3) Будет поданы заявки на грант РНФ для малых научные группы Шевелевой Н.Н. и Безродным В.В.
Планируемый объем финансирования одного гранта за 2 года 3 млн. руб.