1.Оптимизация условий выделения рекомбинатной нуклеазы CasY2.
В 2021 году мы начали изучение CRISPR-CasY2 системы из Вогелбактерий. Ген эффекторной нуклеазы CasY2 был заклонирован в плазмидный вектор для экспрессии в клетках E.coli. Работы по получению рекомбинантного белка CasY2 показали, что он выделяется из клеток-продуцентов в виде мономера, но в малом количестве. В 2022 году проводились работы по оптимизации условий получения белка.
Для повышения синтеза CasY2 в клетках продуцентах была создана новая плазмида, где ген CasY2 был кодо-оптимизирован (pET21_CasY2_newCO_MBP).
Плазмида pET21_CasY2_newCO_MBP была трансформирована компетентные клетки Rosetta E. сoli. Наработка биомассы и очистка белка производилась на основе протоколов, разработанных для белка CasY1. А именно 5 мл ночной культуры добавлялось к 500 мл среды LB с добавлением ампициллина и индуцировалось 1мМ IPTG по достижении оптической плотности 0.5 отн ед. После 16 часов индукции клетки центрифугировали на 4000g для получения клеточного осадка, который в дальнейшем растворялся в лизирующем буфере (50 mM Hepes-HCl pH=7.5, 500 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ бета-меркаптоэтанол) с добавлением лизоцима и проходил ульразвуковую соникацию. После центрифугирования в течение 70 мин на скорости 16000g лизисный раствор фильтровался и наносился на колонку HisTrap HP 1 mL (GE Healthcare) для проведения аффинной хроматографии. После необходимых промывок белок элюировался лизисным буфером с добавлением 300 мМ имидазола. Далее собранные фракции концентрировались до 600 мкл с помощью фильтра (с понижением концентрации NaCl). Полученный белок инкубировали с TEV протеазой ночь при температуре 10°С для отрезания MBP тага. Для дальнейшей очистки белок наносили на колонку Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную буфером 50 мМ Hepes-HCl pH=7.5, 500 мМ NaCl, 1 мМ DTT с добавлением 10% глицерина для проведения гельфильтрационной хроматографии. Результаты гель фильтрационной очистки CasY2 приведены на Рисунке 1 (см. Отчет)
В ходе дальнейших оптимизаций условий выделения не удалось получить большего количества выделяемого CasY2 в мономерной форме. Такми образом, хоть нам и удалось избавиться от агрегатных форм CasY2, получить CasY2 мономер в высокой концентрации оказалось невозможным. Результаты проверки ДНК разрезающей активности in vitro не выявили нуклеазной активности CasY2, причиной чего может являться низкая концентрация используемого в реакциях белка. Полученные данные говорят о невозможности производить дальнейшие исследования CasY2 in vitro.
2. Создание плазмиды, несущей ген CasY1 и последовательности направляющих РНК для экспрессии в клетках человека.
В результате предыдущих этапов работ мы показали, что CasY1 нуклеаза из Катанобактерий активна in vitro и поэтому, потенциально может быть использована для модификации генома эукариот. В 2022 году было решено проверить ее активность в клетках человека.
Для экспрессии компонентов системы CRISPR-CasY1 в клетках человека была создана плазмида, несущая ген CasY1 и последовательность, кодирующую направляющую РНК, под регуляцией эукариотических промоторов CMV и U6: U6 scautRNA CMV CasY1 GFP (Рис.2, см. Отчет).
Для экспрессии гена CasY1 был использован цитомегаловирусный CMV промотор. Для повышения эффективности трансляции гена нуклеазы в эукариотах и предотвращения возможности появления бактериальных редких кодонов в кодирующей последовательности, ген CasY1 был кодон-оптимизирован. На начало и конец гена нуклеазы поместили сигналы ядерной локализации (NLS, Nuclear Localization Signal, MAPKKKRKVGIHGVPAA с N-конца, KRPAATKKAGQAKKKK с C-конца). После NLS сигнала на C-конце гена нуклеазы был помещен HA-таг (Human influenza hemagglutinin tag) в трех повторах (YPYDVPDYA).
Для экспрессии направляющей РНК (scautRNA) был использован U6 промотор с дополнительным G нуклеотидом на 3’- конце для повышения эффективности транскрипции. Для возможности дальнейшей вставки различных спейсерных последовательностей на 5’-конец консервативной последовательности scautRNA, после U6 промотора были установлены два рестрикционных сайта BsmBI.
Для возможности проверки эффективности трансфекции созданного вектора в клетки человека и оценки эффективности продукции нуклеазы, после гена CasY1 помещали последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок GFP через линкерный пептид P2A.
Последовательность полученной плазмиды была подтверждена посредством рестрикционного анализа (Рис.3. см. Отчет) и секвенированием по Сэнгеру.
3.Проверка внутриклеточного синтеза нуклеазы CasY1 в клетках человека.
Плазмида U6 scoutRNA CMV CasY1 GFP была трансфицирована в клетки человека линии НЕК293Т с целью проверки внутриклеточного синтеза исследуемой нуклеазы. В качестве положительного контроля эксперимента одновременно была трансфицирована аналогичная плазмида U6 sgRNA CMV SpCas9 GFP, несущая компоненты широко изучаемой CRISPR-SpCas9 системы.
Клетки НЕК293Т культивировали в среде Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) на 37°C с 5% содержанием CO2. За сутки до трансфекции клетки рассеивали в 24-луночный планшет, трансфекция осуществлялась при помощи реагента Lipofectamin 2000. В каждую лунку добавляли смесь из 100 мкл Opti-MEM I Reduced Serum Media (OMEM), 1,5 мкл Lipofectamin 2000 и 500 нг трансфицируемой плазмиды. На второй день фиксировалось свечение GFP, что свидетельствовало о том, что плазмиды успешно попали в клетки и с них экспрессируются комплексы CasY1-P2A-GFP и SpCas9-P2A-GFP. Через 2,5 дня снимали клеточные лизаты для последующего Вестерн Блот (Western Blot) анализа, который позволил выяснить экспрессируется ли ген CasY1 в эукариотических клетках.
Для того, чтобы разделить белки из клеточного лизата по размерам, был проведен вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). Затем пробы были перенесены с ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану. Далее нитроцеллюлозная мембрана инкубировалась с первичными антителами, специфичными к HA-тагу, расположенному на С-конце CasY1. Использовались мышиные моноклональные антитела в разведении 1:1000. Далее мембрана инкубировалась со вторичными антителами, способными связываться с первичными антителами, а также с пероксидазой хрена, что позволяет усилить сигнал и визуализировать результаты Вестерн Блота. В качестве вторичных антител использовали анти-мышиный иммуноглобулин G (IgG) в разведении 1:20000. Далее в течение минуты инкубировали мембрану с ECL миксом из набора SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate. Сигнал детектировали с помощью ChemiDoc MP System (Bio-Rad) (Рис.4, см. Отчет).
Данные Вестерн Блот (Рис.4, см Отчет) демонстрируют, что нуклеаза CasY1 эффективно синтезируется в клетках человека. Также наблюдается высокий уровень экспрессии нуклеазы SpCas9, используемой в качестве положительного контроля, что говорит о том, что эксперимент прошел успешно. В отрицательном контроле нет полосы соответствующих размеров. Ген CasY1 экспрессируется с чуть меньшей эффективностью по сравнению с геном SpCas9, однако в количестве достаточном для обеспечения нуклеазной активности.
4. Проверка нуклеазной активности CasY1 в клетках человека.
Поскольку CasY1 нуклеаза на достаточном уровне синтезируется в эукариотических клетках, следующим шагом была проверка нуклеазной активности CRISPR-CasY1 системы в клетках человека, то есть проверка того, способен ли эффектор в комплексе с направляющей РНК вносить направленные двухцепочечные разрывы в геноме.
Для этого на основе плазмиды U6 scoutRNA CMV CasY1 GFP был создан ряд новых плазмид. В них со стороны 5’-конца последовательности, кодирующей scoutRNA, были интегрированы ДНК последовательности, комплементарные выбранным мишеням в геноме человека (спейсерные последовательности). Три таких мишени были подобраны на участке гена человека grin2b. Ранее данные мишени были проверены в экспериментах in vitro: они эффективно узнаются и разрезаются нуклеазой CasY1.
Создание плазмид осуществлялось посредством метода Golden Gate cloning. Данный метод основан на последовательной повторяющейся работе эндонуклеазы рестрикции типа IIS, в данном случае рестриктазы BsmBI, и лигазы Т4 фага. Проверка нуклеотидной последовательности плазмид осуществлялась секвенированием по Сэнгеру.
Полученные плазмиды трансфицировали в клетки HEK293T при помощи реагента Lipofectamin 2000. Через два дня наблюдали свечение GFP, что говорило о том, что гены нуклеаз успешно экспрессируются в клетках. На третий день получены клеточные лизаты и проведение с ними реакции с Т7 эндонуклеазой I для проверки нуклеазной активности CasY1.
Принцип Т7 эндонуклеазной реакции заключается в том, что предварительно амплифицированные с геномов популяции трансфицированных клеток фрагменты ДНК, содержащие инделы (вставки или делеции нуклеотидов), сначала нагревают до температуры плавления, чтобы между цепочками ДНК разорвались водородные связи, а затем остужают, чтобы они снова отожглись друг на друге. В результате чего образуются фрагменты ДНК, у которых на месте индела не совпадает нуклеотидная последовательность, появляются «пузыри». Т7 эндонуклеаза способна находить такие участки-«пузыри» и вносить в них двунитевые разрывы. Далее пробы наносят на 1,5% агарозный гель и с помощью электрофореза разделяют фрагменты ДНК.
После проведения Т7 реакции, не было обнаружено специфичных фрагментов разрезания ДНК, выделеных из клеток, трансфицированных плазмидами, несущими CRISPR-CasY1 систему. Полученные данные можно интерпретировать с разных позиций: возможно CasY1 нуклеаза не вносит двунитевые разрывы в геноме эукариот, либо вносит, но с низкой эффективностью, поэтому детектировать их с помощью использованного подхода невозможно.
По результатам данного этапа работ было решено сфокусироваться на исследование других возможных практических приложений CRISPR-Cas, а именно на создании системы репрессии генов на основе каталитически неактивных мутантов CasY1.
5. Получение каталитически неактивных форм эффектора CasY1.
Для получения каталитически неактивных форм эффектора CasY1 был проведен анализ его аминокислотной последовательности для выявления возможных функциональных доменов. Используя данные о каталитически неактивных мутантах для CRISPR-Cas12a (Liu, Jun-Jie et al. (2019)) были предложены замены в аминокислотной последовательности CasY1 в позициях D827 и E913 на аланин для создания “dead” форм (ДНК-связывающие, но не разрезающие версии белка). Гены мутантных форм dCasY D827A и dCasY E913A были были заклонированы в плазмиды pET21a под регуляцией Т7 промотора, на С-конец белков был помещен his tag и MBP tag для дальнейшей аффинной очистки. Полученные плазмиды pET21_dCasY D827A и pET21_dCasY E913A были трансформированы в компетентные клетки Rosetta E. сoli. 10 мл ночной культуры трансформированных бактерий разводили в 500 мл среды LB с добавлением ампициллина и растили клетки при температуре 37°С до достижения оптической плотности 0.6 отн.ед. Далее индуцировали экспрессию эффектора добавлением IPTG до концентрации 1 мМ, после чего клетки инкубировали при температуре 16°C в течение 16 часов. Затем клетки осаждали на скорости 4000g в течение 30 минут и замораживали при температуре -20 С. Клеточный осадок растворяли в 15 мл лизисного буфера (50 mM Hepes-HCl pH=7.5, 500 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ бета-меркаптоэтанол) с добавлением 15 мг лизоцима. Затем клетки проходили ультразвуковую соникацию и центрифугировались в течение часа на скорости 16000g. Супернатант фильтровался (диаметр поры фильтра 0.22 мкм) и наносился на на колонку HisTrap HP 1 mL (GE Healthcare) для проведения аффинной хроматографии. После промывки лизисным буфером с добавлением 20мМ имидазола белок эллюировали лизисным буфером с добавлением 300 мМ имидазола. Собранные фракции центрифугировали в концентраторах Amicon Ultra-4 centrifugal unit (Merc Millipore) с порами размером 100 кДа до объема 600 мкл. На данном этапе в пробы добавляли TEV протеазу и инкубировали ночь при температуре 10°С. Полученный образец наносили на гель фильтрационную колонку Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную буфером 50 мМ Hepes-HCl pH=7.5, 500 мМ NaCl, 1 мМ DTT с добавлением 10% глицерина.
Результаты гельфильтрационной очистки рекомбинантных мутантов dCasY D827A и dCasY E913A представлены на рисунках 5 и 6 (см. Отчет).
Оба мутанта удалось выделить в форме мономеров, о чем свидетельствуют характерные пики на 13-15 мл. Концентрации выделенных белков составили: для dCasY D827A - 0.5мг/мл, для dCasY E913A - 1мг/мл.
Далее необходимо было проверить, могут ли полученные мутантные формы dCasY D827A и dCasY E913A связывать ДНК, и осталась ли у них нуклеазаная активность.
6. Проверка наличия нуклеазной активности белков dCasY D827A и dCasY E913A.
Далее была проведена проверка способности мутантных форм dCasY D827A и dCasY E913A связываться с ДНК-мишенью посредством направляющей РНК (Рис. 8 и Рис. 9). Для проверки ДНК-связывающих способностей CasY1 в комплексе с направляющими РНК смешивался с ДНК мишенью in vitro используя соотношения Белок/РНК:ДНК 1:1, 1:3 и 1:10. (Таблица 1) ДНК мишени длиной 130 п. о. содержала флуоресцентную метку Cy3 на 5’ конце. Реакция проходила 30 мин при температуре 37С. Далее пробы были нанесены на 5% полиакриламидный гель и разгонялись в геле в электрофорезном аппарате, помещенном в лед. Электрофореграммы (Рис. 8 и Рис. 9, см. Отчет) демонстрируют изменение подвижности ДНК в комплексе с рибонуклеиновым комплексом эффектора.
Также была проведена проверка нуклеазной активности мутантных форм CasY1. С этой целью также была поставлена in vitro реакция разрезания ДНК с аналогичными соотношениями ДНК мишени к рибонуклеиновому комплексу (1:1, 1:3 и 1:10), пробы инкубировали в течение 30 мин при 37С. Далее реакция была разделена на равные части и пробы нанесены в нативный агарозный гель (Рис. 10, см. Отчет) а также в ПААГ при денатурирующих условиях (Рис. 11, см. Отчет). Денатурирующие условия были выбраны для того, чтобы продемонстрировать отсутствие никирования ДНК (Рис. 11, см. Отчет).
Электрофореграммы (Рис. 10 и Рис. 11, см. Отчет) демонстрируют отсутствие нуклеазной активности мутантных форм dCasY D827A и dCasY E913A. Эти белки не вносят направленных одноцепочечных и двуцепочечных разрывов ДНК мишени. При этом полученные эффекторные комплексы способны направленно узнавать ДНК мишень и эффективно связываться с ней.
Таким образом системы dCasY D827A и dCasY E913A потенциально могут быть использованы для направленной регуляции транскрипции и репрессии генов.
