Каждая клетка – это сложноорганизованная система, компоненты которой слаженно выполняют множество задач, при этом вся необходимая для жизни клетки информация хранится в ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота, основной компонент хромосом). В клетке имеется целая армия белков, которая защищает ДНК от повреждений, и специальные белки системы репарации, которые готовы сделать все возможное и невозможное, чтобы исправить возникшие неполадки. Повреждения могут быть вызваны факторами окружающей среды, такими как ультрафиолетовый свет и радиация, но они также могут быть связаны и с естественными процессами, такими как репликация, когда синтезируется новая копия молекулы ДНК перед делением клетки. На каждую клетку приходится до миллиона повреждений ДНК в день. Поэтому белки системы репарации всегда стоят на страже и готовы быстро реагировать на любые повреждения в ДНК.
Вот представьте теперь, что мы хотим направленно внести двухцепочечный разрыв в ДНК одноклеточного эмбриона. Надо сказать, что это самое страшное повреждение для клетки, которое может вызвать ее гибель. Для ликвидации таких повреждений клетка призывает на помощь системы репарации c помощью негомологичного соединения концов (NHEJ) или микрогомологичного соединения концов (MMEJ). Надо отметить, что они работают крайне быстро, потому что это вопрос жизни и смерти, но допускают ошибки и вносят мутации на месте повреждения. Именно этот способ клетки зашивать двухцепочечные разрывы подсказал ученым способ направленно вводить мутации в выбранные участки ДНК. Но для того, чтобы активировать системы NHEJ и MMEJ, нужно сначала внести двухцепочечный разрыв в хорошо охраняемую ДНК клетки. И тут на помощь ученым пришли микроорганизмы, которые поделились своим секретным инструментом для внесения двухцепочечных разрывов в любую молекулу ДНК. Этот инструмент называется CRISPR/Cas система, бактерии ее используют для борьбы с вирусами, которые на них нападают. Система работает очень просто: синтезируется небольшой фрагмент CRISPR-РНК, каждая буква которой будет комплементарна фрагменту ДНК, в которую мы хотим внести разрыв. Данная РНК связывается с белком-нуклеазой Сas9, умеющей вносить двухцепочечные разрывы в ДНК, и указывает ей то место, куда требуется внести этот разрыв. Узнается это место за счет спаривания комплементарных букв РНК и ДНК. Если эту конструкцию доставить, например, в одноклеточный эмбрион, то можно направленно внести разрыв в ДНК в нужном для исследования месте. Зная, как работают системы NHEJ и MMEJ, можно не волноваться, что клетка погибнет, они смогут ее спасти, хотя и ценой небольшой мутации. Но, ученым этого показалось мало, им захотелось не просто вносить мутации, но и вставлять другие гены, которые кодируют белки, например те, которые умеют светиться, такие как флуоресцентный белок GFP. Для этого нужно активировать другую систему репарации, опосредованную гомологичной рекомбинацией (HDR). Эта система работает медленно, и быстрые системы репарации NHEJ и MMEJ каждый раз ее опережают. Поэтому мы решили инактивировать ключевых участников этих систем - белки Ku70 и Polθ. Для этого мы направили на них другую нуклeазу - Cas13. Эта нуклеаза не трогает ДНК и специфично уничтожает молекулы РНК, поэтому с ее помощью, не нанося большого вреда клетке, мы сможем на какое-то время остановить производство белков Ku70 и Polθ. Это, в свою очередь, даст возможность сработать более медленной системе репарации HDR, которая умеет зашивать разрыв за счет аккуратного переписывания информации с имеющейся матрицы ДНК. Поэтому если мы внесем фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок GFP и несущий участки, по которым может идти рекомбинация, то можем добиться, чтобы нужный нам белок начал светиться в клетке. Для этих целей мы ввели приготовленные нами конструкции: CRISPR/Cas9 с направляющей РНК к выбранному нами гену exo1, матрицу ДНК GFP и CRISPR/Cas13 с направляющими РНК к мРНК, в которой зашифрована информация о Ku70 и Polθ, с помощью очень тонкой иголки в зиготу мыши. Не все зиготы выжили после такой инъекции, но с помощью флуоресцентного микроскопа мы увидели, как у небольшого количества выживших эмбрионов светятся зеленым отдельные клетки. Мы выделили из эмбрионов ДНК и показали с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции), что ген GFP действительно встроился в геном мыши. Эти результаты говорят о том, что наша задумка удалась, и инактивация белков Ku70 и Polθ действительно повышает вероятность гомологичной рекомбинации, что дает возможность получать генетически модифицированные организмы быстрее и с меньшими затратами. На следующем этапе по этой же технологии мы получили живых мышей, у которых в ген тирозиназы (tyr) была встроена последовательность GFP. Для этого мы подсадили мышам зиготы после инъекции наших генетических конструкций (CRISPR/Cas9 с направляющей РНК к гену tyr, матрицу ДНК GFP и CRISPR/Cas13 с направляющими РНК к мРНК, в которой зашифрована информация о Ku70 и Polθ). У рожденных мышей мы наблюдали различные варианты окраски шерсти, поскольку активность гена тирозиназы определяет темную окраску за счет синтеза меланина, а выключение гена - белую. На выделенной из мышиного хвоста ДНК мы показали с помощью ПЦР, что ген GFP действительно встроился в геном мыши, и дополнительно детектировали наличие флуоресценции под микроскопом.
Использование Cas нуклеаз II типа для направленного редактирования генома позволяет получать новые животные модели заболеваний человека, в частности, как модели с нокаутом генов, так и несущие различные гены человека. Нуклеаза Cas9, с которой началось широкое применение Cas белков, вносит двуцепочечные разрывы в ДНК-мишень, комплементарную направляющей РНК. Репарация этих разрывов c помощью негомологичного соединения концов (NHEJ) или микрогомологичного соединения концов (MMEJ) приводит к возникновению мутаций, которые могут нокаутировать целевой ген, но для вставки последовательностей ДНК необходимо активировать путь репарации, опосредованный гомологичной рекомбинацией (HDR). В нашей работе для активации HDR мы использовали мРНК-направленное ингибирование сразу двух ключевых факторов путей репарации NHEJ и MMEJ, белков Ku70 и Polθ, соответственно. Для этого мы использовали нуклеазу PguCas13b, которая вносит направленные разрывы в РНК, в комплексе с направляющими РНК, специфичными к мРНК генов Xrcc6 и PolQ, соответственно. Рекомбинантный белок PguCas13b, в настоящее время недоступный коммерчески, был наработан нами в бактерии E.coli. Смесь белков SpCas9 и PguCas13b с соответствующими направляющими РНК и фрагмента ДНК, кодирующего флуоресцентный белок GFP, была инъецирована в зиготы мышей. Эффективность ингибирования путей репарации NHEJ и MMEJ мы оценивали по соотношению количества выживших бластоцист, несущих вставку гена флуоресцентного белка GFP в последовательность гена exo1, к количеству бластоцист дикого типа, выживших после инъекции. Наличие вставки подтверждали с помощью как флуоресцентной микроскопии, так и ПЦР со специфичными к гену GFP праймерами с последующим секвенированием. Частота вставки в этом случае достигала 5%, поскольку относительно высокие концентрации PguCas13b оказались токсичными из-за коллатерального эффекта, а относительно низкие приводили к вставке с низкой эффективностью. Инъекция в зиготы только белка SpCas9 вместе с фрагментом ДНК, кодирующим флуоресцентный белок GFP, не давала выживших бластоцист, несущих вставку. Мы предположили, что низкая эффективность связана с высокой концентрацией нуклеазы PguCas13b и ее коллатеральной активностью, т.е. способности неспецифично вносить разрывы в любый РНК сразу после связывания с целевым фрагментом РНК. Чтобы убрать коллатеральный эффект нуклеазы и снизить вероятность уничтожения других РНК в клетке, мы разработали подход использования инактивированной dPguCas13b с однонуклеотидной заменой. Данная замена не повлияла на связывание нуклеазы PguCas13b с таргетной мишенью, но при этом нуклеаза не вносила разрыв в мРНК Xrcc6 и PolQ. На втором этапе выполнения проекта мы получали мышей с направленной интеграцией трансгена GFP в первый экзон гена tyr. Для этого мы разработали направляющую РНК (gRNA) CRISPR для нацеливания на последовательность перед старт кодоном первого экзона гена tyr. Для образования слитого с тирозиназой белка GFP, вектор нацеливания гомологичной рекомбинации с последовательностью гена GFP был фланкирован последовательностями гена tyr длиной около 1000 нуклеотидов. В том случае, если направленная вставка интегрирует последовательность GFP в область стартового кодона гена tyr и образуется слитый белок GFP-tyr. Шерсть 12 из 28 детенышей была полностью белой или черно-белой, что свидетельствует о инактивации тирозиназы. Наличие вставки последовательности гена GFP в ген тирозиназы (tyr) мы определяли как с помощью флуоресцентной микроскопии, так и генотипированием и фенотипированием мышей. Всего было получено 2 мыши, несущих вставку гена GFP в ген тирозиназы (tyr), из 28 проанализированных живых детенышей, что соответствует 7%.
В ходе выполнения проекта мы использовали современные методы молекулярной биологии и генной инженерии для получения и амплификации ДНК матриц и направляющих РНК, микробиологические и биохимические методы для наработки рекомбинантного белка PguCas13b в бактерии E.coli и его очистки, методики по выделению и культивированию зигот и эмбрионов мышей, разработанные нами способы микроиньекций в зиготы и двуклеточные эмбрионы, методы микрохирургии для проведения операций вазэктомирования самцов мышей и имплантации зигот в яйцевод самок мышей, флуоресцентной микроскопии для фенотипического анализа зигот фенотипического анализа бластоцист и ткани мышей.
Конструирование ДНК матриц для последующей вставки в гены exo1 и tyr проводили с использованием полимеразной цепной реакции для амплификации целевых участков геномной ДНК и гена, кодирующего флуоресцентный белок GFP. Подбор праймеров для амплификации проводили с помощью программы PerlPrimer (http://perlprimer.sourceforge.net/). Синтез праймеров осуществляла фирма ЗАО «Евроген», Россия. Для конструирования использовали набор методик, описанный в руководстве Сэмбрука с соавт. (Green and Sambrook, 2012). Все последовательности ДНК, полученные с помощью ПЦР, были секвенированы в РЦ «РМиКТ» СПбГУ.
Подбор праймеров для получения направляющих РНК для белков PguCas13b и SpCas9 проводили с помощью программы CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/). Транскрипцию in vitro проводили c использованием T7 РНК полимеразы (Invitrogen). Выделение и очистку РНК проводили с помощью набора MEGAclear™ Transcription Clean-Up (Fermentas).
Наработку рекомбинантного белка PguCas13b в бактерии E.coli, его последующую очистку и проверку активности проводили по методике, описанной в статье Гутенберга с соавторами (Gootenberg et al., 2018) Для проверки активности использовали направляющую РНК, специфичную к участку гена Polθ, а в качестве матрицы - фрагмент мРНК гена Polθ, полученный in vitro. Мы показали, что выделенный нами белок обладает не только специфической активностью по отношению к РНК мишени, комплементарной направляющей РНК, но и коллатеральной активностью, приводящей к неспецифическому расщеплению РНК в реакционной смеси.
Для проведения микроиньекций в зиготы мышей мы готовили смесь (sgРНК для exo1 +белок SpСas9+ ДНК матрица_GFP + PguСas13b белок_+ sgРНК для мРНК Ku70 и Polθ), активность которой также проверяли на контрольной матрице ДНК для белка Cas9 и РНК для белка PguCas13b. Мы показали, что белки SpCas9 и PguCas13b сохраняют свою активность в таких условиях, поэтому на следующем этапе мы подбирали концентрации белков, РНК и ДНК для успешного проведения микроинъекций в зиготы мышей.
Для получения оплодотворенных яйцеклеток вводили 7,5 единиц гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 46 часов 7,5 единиц хорионический гонадотропин человека (ХГч) половозрелым самкам мышей линии CBA/C57Black F1. Вымывание яйцеклеток из самок проводили через 11-12 часов после спаривания с самцами линии CBA/C57Black F1. Для вымывания использовали среду М2 (Sigma). Выделяли оплодотворенные зиготы по методике, описанной в протоколе (Ittner and Götz, 2007). Часть полученных зигот держали в замороженном виде. Заморозку и разморозку зигот проводили с помощью инновационного метода витрификации, разработанного японской компанией Kitazato. Ее значительным вкладом в данной сфере стала создание широко известного метода Cryotop®, используемого лидирующими лабораториями в области витрификации ооцитов и эмбрионов на всех стадиях развития. Использованный нами метод был описан в протоколе https://www.kitazato-dibimed.com/wp-content/uploads/VITRIFICATION-PROTOCOL.pdf
Микроинъекции в цитоплазму зигот проводили по традиционному методу, описанному в статье До с соавторами (Doe et al., 2018), а также с использованием нового прибора для электропорации отдельных зигот WPI MICRO-ePORE™. Запатентованная технология флаттер-электродов способствует небольшому, чистому и точному проникновению микроиглы через мембрану без разрыва или повреждения мембраны.
Мы варьировали концентрации белков SpCas9 и PguCas13b для повышения выживаемости зигот после микроинъекций. Мы впервые использовали сочетание белка Cas9 для внесения двунитевых разрывов и белка Cas13 для мРНК-направленного ингибирования сразу двух ключевых факторов путей репарации NHEJ и MMEJ. Флуоресцентный анализ эмбрионов проводили непосредственно после микроинъекций, на стадии 2-х клеток, 4-х клеток и стадии бластоцисты. Предварительные результаты показывают, что относительно высокие концентрации (5-20 нг/мкл) белка PguCas13b токсичны для зигот из-за коллатерального эффекта, тогда как использование более низких концентраций (2 нг/мкл) белка PguCas13b менее токсично. Ранее в 2018 было показано, что с помощью паралога LwaCas13a, несмотря на коллатеральный эффект, возможно с высокой эффективностью инактивировать таргетную мРНК в клетках млекопитающих (Abudayyeh et al., 2017) Однако наши данные коррелируют с данными, полученными в этом году на эмбрионах рыбы Danio rerio (Kushawah et al., 2020).
Анализ интенсивности флуоресценции эмбрионов на разных сроках после микроинъекции показал, что свечение наблюдается не во всех клетках эмбриона, при этом на разных стадиях интенсивность свечения отличается. Это может быть связано как с отличиями в экспрессии генов exo1 и tyr на разных стадиях развития эмбриона, так и с тем, что вставка гена GFP присутствует не во всех клетках эмбриона.
Для доказательства наличия вставки нам было необходимо разработать и опробировать методику выделения ДНК из бластоцист. Мы использовали метод (Scavizzi et al., 2015), что позволило нам использовать выделенную ДНК для постановки двух реакций ПЦР. В первом случае мы использовали праймеры, специфичные к последовательности гена GFP, а во втором - праймеры, специфичные к последовательностям гена exo1 и tyr, фланкирующим место вставки последовательности GFP. Наличие ПЦР продукта в первом случае говорит о вставке последовательности GFP в геном, тогда как наличие продукта большего размера во втором случае говорит о вставке этой последовательности в запланированный участок генома.
Анализ фенотипа бластоцист показал, что после проведенной инъекции у 203 зигот произошел лизис из-за токсичного эффекта PguCas13b в диапазоне концентраций от 5нг/мкл до 20нг/мкл. При концентрации PguCas13b 2/мкл выживаемость была выше, мы смогли отобрать 97 бластоцист и выявили наличие вставки последовательности GFP в 4 случаях из 97. Было проведено пилотное секвенирование последовательностей ПЦР продуктов для 4-х бластоцист, показавшее соответствие последовательности вставки гену GFP. Результаты анализа флуоресценции бластоцист (рис.1) и анализ ПЦР на наличие вставки GFP (рис.2) представлены во вложенном файле рис для гранта РФФИ.pdf.
В ходе выполнения работ, запланированных на первый год, участвовали студенты, аспиранты и молодые ученые:
1. Подготовка мышей доноров для получения оплодотворенных яйцеклеток. Подготовка самок-реципиентов для подсадки оплодотворенных яйцеклеток. (Фесенко Зоя Сергеевна и Маркина Алиса Александровна).
2. Проведение крио-консервации качественных зигот мышей с помощью метода витрификации (Хохлова Евгения Валерьевна, Куварзин Савелий Ростиславович).
3. Разработка и создание CRISPR направляющих РНК для генов exo1 и tyr, для совместной доставки в зиготы с белком Сas9. Разработка и создание ДНК матрицы, содержащей последовательность, кодирующего флуоресцентный белок GFP, которая фланкирована гомологичными плечами. Разработка и создание CRISPR направляющих РНК для двух мРНК Ku70 и Polθ, для совместной доставки в зиготы с белком Сas13. (Хохлова Евгения Валерьевна)
1. Доставка полученных конструкций (sgРНК для exo1 +белок Сas9+ ДНК матрица_GFP + Сas13 белок_+ sgРНК для мРНК Ku70 и Polθ ) и (sgРНК для tyr + белок Сas9+ ДНК матрица_GFP + Сas13 белок_+ sgРНК для мРНК Ku70 и Polθ ) в зиготы мышей, как с помощью микроинъекций, так и с помощью электропорации. (Хохлова Евгения Валерьевна, Куварзин Савелий Ростиславович)
2. Выделение ДНК из бластоцист и амплификация целевых фрагментов с помощью метода ПЦР. Подготовка образцов для секвенирования (Куварзин Савелий Ростиславович)
3. Подтверждение наличие/отсутствие GFP вставки на уровне ранних эмбрионов с помощью флуоресцентного микроскопа, а также секвенирования ДНК целевых фрагментов гена exo1 и tyr , выделенных из бластоцист.(Завьялов Владислав Андреевич)
4. Анализ сложных из-за возможной мозаичности хроматограмм с помощью компьютерных программы SYNTHEGO (https://ice.synthego.com). (Фесенко Зоя Сергеевна, Куварзин Савелий Ростиславович).
Для анализа экспрессии, локализации и функциональной динамики целевых белков in situ, а также животных моделей с направленным редактированием генома, важно разработать удобный, универсальный и эффективный метод точного введения экзогенных генов в геном, который легко визуализировать. Объединив технологию редактирования генома CRISPR / Cas9 с техникой микроинъекции в зиготы, нам удалось создать мышиную модель с белком тирозиназой сшитой с флуоресцентным белком GFP. В качестве мишени мы выбрали ген tyr, так как он кодирует ключевой фермент синтеза меланина. Нокаутирование гена tyr нарушает процесс синтеза меланина и приводит к альбинизму глаз и шерсти мышей.
Для получения мышей с направленной вставкой гена GFP в локус гена tyr мы направили репарацию индуцированного Сas9 двухцепочечного разрыва по пути HDR. Для этого мы одновременно ингибировали 2 пути репарации NHEJ и MMEJ за счет временного ингибирования их ключевых факторов -- белков Ku70 и Polθ, соответственно. Для этого мы впервые использовали мутантную нуклеазу dPguCas13b, в комплексе с направляющими РНК, специфичными к мРНК генов Xrcc6 и PolQ, соответственно. В связи с тем, что PguCas13b нуклеаза демонстрирует более эффективный коллатеральный эффект на эмбрионах мышей, по сравнению с исследованной ранее LwaCas13a (Abudayyeh et al., 2017), мы получили инактивированную форму dPguCas13b, которая способна связываться с целевой РНК, но не способна расщеплять ее. Для инактивации мы внесли точковую мутацию в положении K385А белка PguCas13b, что, как было показано ранее, блокирует нуклеазную активность, и наработали соответствующий рекомбинантный белок dPguCas13b в E.coli. Смесь белков SpCas9 и dPguCas13b и фрагмента ДНК, кодирующего флуоресцентный белок GFP, была инъецирована в зиготы мышей. Все эксперименты были выполнены в соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований в 1986 году в Страсбурге.
Для получения зигот для микроинъекций скрещивали мышей-самцов и самок линии C57BL/6J, имеющих черную окраску шерсти (Litscher E.S. et al., 2010). Перед ссаживанием с самцами половозрелым самкам в возрасте 4-5 недель вводили 7,5 единиц гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 46 часов 7,5 единиц хорионический гонадотропин человека (ХГч). Данная стимуляция гормонов вызывает синхронизацию созревания яйцеклеток и их готовность к моменту оплодотворения. Овуляция обычно происходит через 10-12 часов после введения ХГч.
Для проведения вставки в геном мыши, в цитоплазму каждой зиготы с помощью микроинъекций вводили генетическую конструкцию в составе (40нг/мкл sgРНК для tyr +20нг/мкл белка Сas9+ 10 нг/мкл ДНК матрица_GFP + 20 нг/мкл dPguCas13b белок_+ по 20 нг/мкл sgРНК для мРНК Ku70 и Polθ ) с раствором как sgRNA (50 нг / мкл каждая), так и мРНК Cas9 (100 нг / мкл). Микроинъекции генетических конструкций проводили на микроскопе Nicon с оптической системой Nikon Дик (Дифференциальный интерференционный контраст) с помощью микроманипулятора TransferMan 4R (Eppendorf) и микроинъектора Femtojet (Eppendorf) (Raveux A. et al., 2017). Инъецированные зиготы культивировали в течение 2 часов в среде KSOM в СО2 инкубаторе до имплантации псевдобеременным реципиентам CD1. Для получения псевдобеременности у самок CD1 их спаривали с вазэктомированными самцами. Геномную ДНК, полученную из биопсий хвоста рожденных детенышей, оценивали на наличие вставки гена GFP и мутаций в гене тирозиназы. Животных, несущих вставки GFP, скрещивали с мышами C57BL/6J для получения животных F1 и оценки передачи вставки в генеративные клетки мышей.
Выделение ДНК из из тканей рожденных детенышей проводили с помощью обработки протеиназой К при 56оС в течение 10 минут. Затем останавливали процесс нагреванием смеси в течение 10 минут при 95оС. Полученную ДНК использовали для генотипирования с помощью ПЦР, результаты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Оценку эффективности встраивания GFP в геном оценивали двумя способами: с помощью оценки флуоресценции бластоцист под микроскопом и с помощью генотипирования наличия вставки с помощью ПЦР. Для генотипирования была использована пара праймеров, один из которых был специфичен к последовательности в гене tyr, а второй – к последовательности гена GFP. Результаты оценки интенсивности флуоресценции и генотипирования с помощью ПЦР и под флуоресцентным микроскопом приведены на рисунке 3.
Для этого были выполнены следующие работы, в которых участвовали студенты, аспиранты и молодые ученые:
1.Введение мутации с помощью сайт-направленного мутагенеза в ген, кодирующий нуклеазу PguCas13b, для ее инактивации. Наработка белка PguCas13b в E.coli и его очистка с помощью аффинной хроматографии (Фотина Александра Сергеевна)
2. Наработка белка Cas13d в E.coli и очистка с помощью аффинной хроматографии (Чиринскайте Ангелина Валерьевна)
3. Подготовка мышей доноров для получения оплодотворенных яйцеклеток. Подготовка самок-реципиентов для подсадки оплодотворенных яйцеклеток– (Маркина Алиса Александровна).
4. Получение и доставка конструкций:
(sgРНК для tyr +белок SpСas9+ ДНК матрица_GFP + dPguСas13b белок_+ sgРНК для мРНК Ku70 и Polθ)
в зиготы мышей, как с помощью микроинъекций, так и с помощью электропорации. (Фотина Александра Сергеевна, Чиринскайте Ангелина Валерьевна)
5. Культивация эмбрионов в среде KSOM при 37°С и 5% CO2 в инкубаторе до стадии двух клеток. Трансплантация зигот, перенесших манипуляции, в яйцеводы псевдобеременных самок. (Завьялов Владислав Андреевич)
6. Выделение ДНК из тканей рожденных детенышей и амплифицикация целевых фрагментов с помощью метода ПЦР. Подготовка образцов для секвенирования (Чиринскайте Ангелина Валерьевна)
7. Валидация на уровне ранних эмбрионов наличия/отсутствия GFP вставки, с помощью флуоресцентного микроскопа, а также секвенирования ДНК целевого фрагмента гена tyr, выделенной из ткани рожденных детенышей. (Чиринскайте Ангелина Валерьевна)
8. Анализ сложных из-за возможной мозаичности хроматограмм с помощью компьютерных программы SYNTHEGO (https://ice.synthego.com). (Чиринскайте Ангелина Валерьевна).
Ссылки:
Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Essletzbichler, P., Han, S., Joung, J., Belanto, J.J., Verdine, V., Cox, D.B.T., Kellner, M.J., Regev, A., et al. (2017). RNA targeting with CRISPR–Cas13. Nature 550, 280–284.
Doe, B., Brown, E., and Boroviak, K. (2018). Generating CRISPR/Cas9-Derived Mutant Mice by Zygote Cytoplasmic Injection Using an Automatic Microinjector. MPs 1, 5.
Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Kellner, M.J., Joung, J., Collins, J.J., and Zhang, F. (2018). Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science 360, 439–444.
Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, 2012
Ittner, L.M., and Götz, J. (2007). Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc 2, 1206–1215.
Kushawah, G., Abugattas-Nuñez del Prado, J., Martinez-Morales, J.R., DeVore, M., Guelfo, J.R., Brannan, E.O., Wang, W., Corbin, T.J., Moran, A.M., Alvarado, A.S., et al. (2020). CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knock-down in animal embryos (Developmental Biology).
Scavizzi, F., Ryder, E., Newman, S., Raspa, M., Gleeson, D., Wardle-Jones, H., Montoliu, L., Fernandez, A., Dessain, M.-L., Larrigaldie, V., et al. (2015). Blastocyst genotyping for quality control of mouse mutant archives: an ethical and economical approach. Transgenic Res 24, 921–927.
Litscher E.S., Wassarman P.M. Isolation, and Manipulation of Mouse Gametes and Embryos // Methods in Enzymology. Elsevier - 2010 - Vol. 476. P. 73–84.
Raveux A., Vandormael-Pournin S., Cohen-Tannoudji M. Optimization of the production of knock-in alleles by CRISPR/Cas9 microinjection into the mouse zygote // Sci Rep. - 2017 - Vol. 7, № 1. P. 42661.
Использование Cas нуклеаз II типа для направленного редактирования генома позволяет получать новые животные модели заболеваний человека, в частности, как модели с нокаутом генов, так и несущие различные гены человека. Нуклеаза Cas9, с которой началось широкое применение Cas белков, вносит двуцепочечные разрывы в ДНК-мишень, комплементарную направляющей РНК. Репарация этих разрывов c помощью негомологичного соединения концов (NHEJ) или микрогомологичного соединения концов (MMEJ) приводит к возникновению мутаций, которые могут нокаутировать целевой ген, но для вставки последовательностей ДНК необходимо активировать путь репарации, опосредованный гомологичной рекомбинацией (HDR). В нашей работе для активации HDR мы использовали мРНК-направленное ингибирование сразу двух ключевых факторов путей репарации NHEJ и MMEJ, белков Ku70 и Polθ, соответственно. Для этого мы использовали нуклеазу PguCas13b, которая вносит направленные разрывы в РНК, в комплексе с направляющими РНК, специфичными к мРНК генов Xrcc6 и PolQ, соответственно. Рекомбинантный белок PguCas13b, в настоящее время недоступный коммерчески, был наработан нами в бактерии E.coli. Смесь белков SpCas9 и PguCas13b с соответствующими направляющими РНК и фрагмента ДНК, кодирующего флуоресцентный белок GFP, была инъецирована в зиготы мышей. Эффективность ингибирования путей репарации NHEJ и MMEJ мы оценивали по соотношению количества выживших бластоцист, несущих вставку гена флуоресцентного белка GFP в последовательность гена exo1, к количеству бластоцист дикого типа, выживших после инъекции. Наличие вставки подтверждали с помощью как флуоресцентной микроскопии, так и ПЦР со специфичными к гену GFP праймерами с последующим секвенированием. Частота вставки в этом случае достигала 5%, поскольку относительно высокие концентрации PguCas13b оказались токсичными из-за коллатерального эффекта, а относительно низкие приводили к вставке с низкой эффективностью. Инъекция в зиготы только белка SpCas9 вместе с фрагментом ДНК, кодирующим флуоресцентный белок GFP, не давала выживших бластоцист, несущих вставку. Мы предположили, что низкая эффективность связана с высокой концентрацией нуклеазы PguCas13b и ее коллатеральной активностью, т.е. способности неспецифично вносить разрывы в любый РНК сразу после связывания с целевым фрагментом РНК. Чтобы убрать коллатеральный эффект нуклеазы и снизить вероятность уничтожения других РНК в клетке, мы разработали подход использования инактивированной dPguCas13b с однонуклеотидной заменой. Данная замена не повлияла на связывание нуклеазы PguCas13b с таргетной мишенью, но при этом нуклеаза не вносила разрыв в мРНК Xrcc6 и PolQ. На втором этапе выполнения проекта мы получали мышей с направленной интеграцией трансгена GFP в первый экзон гена tyr. Для этого мы разработали направляющую РНК (gRNA) CRISPR для нацеливания на последовательность перед старт кодоном первого экзона гена tyr. Для образования слитого с тирозиназой белка GFP, вектор нацеливания гомологичной рекомбинации с последовательностью гена GFP был фланкирован последовательностями гена tyr длиной около 1000 нуклеотидов. В том случае, если направленная вставка интегрирует последовательность GFP в область стартового кодона гена tyr и образуется слитый белок GFP-tyr. Шерсть 12 из 28 детенышей была полностью белой или черно-белой, что свидетельствует о инактивации тирозиназы. Наличие вставки последовательности гена GFP в ген тирозиназы (tyr) мы определяли как с помощью флуоресцентной микроскопии, так и генотипированием и фенотипированием мышей. Всего было получено 2 мыши, несущих вставку гена GFP в ген тирозиназы (tyr), из 28 проанализированных живых детенышей, что соответствует 7%.
