Научная проблема, на решение которой направлен проект:
Оценка биоразнообразия паразитических организмов со сложными жизненными циклами - это проблема, на решение которой направлен проект. Мы протестируем интегративный подход к описанию видовой структуры на примере нескольких видов трематод с широким ареалом, включающим арктические моря Евразии и северо-западной Пацифики, при этом обладающих низкой специфичностью по отношению к окончательным хозяевам.

Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы:
Интегративный подход к изучению биоразнообразия паразитов, как отражение общебиологических тенденций интегративной таксономии, был разработан сравнительно недавно, до сих пор является предметом дискуссий, но применяется всё шире (Blasco-Costa et al., 2016; Bray et al., 2022). Для него обязателен синтез морфологического и молекулярного анализа, данных о специфичности по отношению к хозяевам и о географическом распространении. В случае трематод, которые являются наиболее богатой видами группой паразитических червей, важно помимо этого учитывать ещё и особенности реализации их сложных жизненных циклов. Сами по себе молекулярные данные, хоть и являются мощным инструментом документации биоразнообразия, не позволяют чётко определить границы видов из-за разной степени изменчивости маркерных последовательностей в разных группах животных, а также присутствия порой сильно выраженной генетической структуры у видов с широким ареалом. Более-менее формальные критерии для определения границ видов трематод были предложены в самое недавнее время (Bray et al., 2022), и выяснение, насколько они применимы на практике в разных таксонах с их уникальными биологическими особенностями, является актуальной проблемой. В этом отношении особенно значимы данные по жизненным циклам (круг хозяев, специфичность, строение личиночных стадий и партенит), поскольку они позволяют разграничивать виды, кажущиеся криптическими на основании только морфологии взрослых особей гермафродитного поколения, которые всё ещё являются краеугольным камнем в изучении разнообразия и систематики трематод. Только для порядка 10% описанных видов трематод жизненные циклы частично или полностью расшифрованы, и работа в этом направлении чрезвычайно важна на нынешнем этапе разработки идей об особенностях формирования биоразнообразия этой уникальной группы паразитов.

Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность:
Предлагаемый проект сфокусирован на изучении скрытого разнообразия морских трематод. В качестве модельных объектов выбраны четыре вида: Derogenes varicus, Progonus muelleri, Podocotyle atomon и Lecithaster salmonis. Эти виды характеризуются чрезвычайно широким спектром окончательных хозяев, высокой морфологической вариабельностью и широким ареалом. Наши предварительные молекулярно-генетические данные позволяют предполагать, что среди этих трематод присутствуют как минимум три комплекса криптических видов. Выяснение их филогении, жизненных циклов, филогеографии позволит: (1) протестировать современные подходы к изучению биоразнообразия трематод; (2) определить связность популяций исследуемых видов в арктических и дальневосточных морях, выявить возможности транс-арктического обмена паразитофауной рыб, оценить связанные с географией факторы видообразования; (3) выяснить, как влияют особенности реализации жизненных циклов у исследуемых видов на формирование генетической структуры.

Мы сформулировали для себя следующие конкретные задачи:

1. Описать генетическую структуру выбранных модельных видов трематод на основе набора ядерных и митохондриальных маркерных последовательностей ДНК. Выявить разнообразие генетических линий в пределах комплексов криптических видов.
2. Расшифровать (или переописать) жизненные циклы внутри каждого комплекса криптических видов, используя полученные молекулярно-генетические данные.
3. Провести морфологический анализ разных стадий жизненного цикла внутри комплексов криптических видов (в первую очередь - марит и церкарий).
4. Определить круг окончательных и промежуточных хозяев для каждого из видов. Выяснить, есть ли специфичность по отношению к хозяину/группе хозяев внутри комплексов криптических видов.
5. Провести филогеографический анализ изученных видов трематод. Установить границы ареалов генетических линий внутри рассматриваемых видовых комплексов. Определить для них возможные пути транс-арктического расселения.


Научная новизна исследований, обоснование того, что проект направлен на развитие новой для научного коллектива тематики, обоснование достижимости решения поставленной задачи (задач) и возможности получения предполагаемых результатов:
В последние годы все возрастающее число исследователей начинает обращаться к проблеме видов трематод с широким ареалом, последующему выявлению комплексов криптических видов и решению концептуальных вопросов - установлению признаков, маркирующих межвидовые границы (Gilardoni et al., 2020; Gonchar and Galaktionov, 2021; Bray et al., 2022). Примечательно, что практически не исследованными в этом плане являются трематоды, паразитирующие в рыбах северных морей Евразии и Дальнего Востока. Тем не менее, уже появляются первые молекулярные данные (полученные, в том числе, участниками проекта), свидетельствующие о наличии в дальневосточных морях и акваториях европейского сектора Арктики как одних и тех же (Atopkin et al., 2020; Sokolov et al., 2021; Krupenko et al., 2022), так и криптических видов (Sokolov et al., 2021; Krupenko et al., в печати). Однако эти предварительные результаты открывают простор для формулировки новых вопросов, в частности: (1) действительно ли у видов с широким ареалом осуществляется генетический обмен на всем его протяжении, или он ограничен локальными популяциями, приуроченными к определенным акваториям? (2) сколько видов скрывается внутри каждого комплекса, и какие критерии (помимо генетических) могут быть применены для установления границ между ними? (3) где зародились эти виды, и как шло их распространение: с востока на запад, или в обратном направлении? На получении этих абсолютно новых как для коллектива, так и научного сообщества данных и будет сфокусирован наш проект.

Освещать обозначенные вопросы мы планируем на нескольких модельных объектах. В первую очередь, это представители Lecithasteridae и Derogenidae, по которым у нас имеется не только достаточно обширный материал из Белого и Баренцева морей, но и предварительные наработки. Так, изученный нами ранее представитель первого семейства - Lecithaster salmonis - является видом с очень широким ареалом, включающим как минимум Белое и Японское моря (Atopkin et al., 2020; Krupenko et al., 2022). Мы впервые проверим, принадлежат ли виды рода Lecithaster, описанные из других Арктических и Дальневосточных морей (Полянский, 1955; Жуков, 1960, 1963) виду L. salmonis, а также изучим генетическую структуру этой трематоды. Это позволит нам выяснить, является ли данный вид единым на всём протяжении своего ареала. Вторая группа объектов - это комплексы криптических видов Derogenes varicus и Progonus muelleri. Согласно литературным и нашим данным (Sokolov et al., 2021; Krupenko et al., в печати), Derogenes varicus представлен как минимум четырьмя, а Progonus muelleri - как минимум двумя самостоятельными генетическими линиями, некоторые из которых выделяются в отдельные виды на основании морфологии личиночных стадий и специфичности по отношению к первым промежуточным хозяевам. При этом отдельные линии в пределах Derogenes varicus, по-видимому, географически разнесены, в то время как одна из линий Progonus muelleri обнаружена и в Охотском, и в Белом морях (Sokolov et al., 2021; Krupenko et al., в печати). Мы впервые оценим истинное видовое богатство в пределах этих двух комплексов криптических видов, проведем межвидовые границы используя вновь полученные данные о спектре окончательных и промежуточных хозяев и установим генетическую структуру для географически наиболее широко распространенных видов. Наконец, мы планируем включить в анализ новый для нас объект - Podocotyle atomon, мариты которого обладают низкой специфичностью к окончательному хозяину, и встречаются как в рыбах арктических (Шульман и Шульман-Альбова, 1953; Полянский, 1955), так и дальневосточных морей (Жуков, 1960, 1963). Согласно нашим предварительным результатам, Podocotyle atomon - это комплекс криптических видов, представленный в Белом и Баренцевом морях как минимум двумя генетическими линиями. Мы впервые установим скрытое видовое разнообразие в пределах Podocotyle atomon и переопишем жизненный цикл для видов этого комплекса.


Современное состояние исследований по данной проблеме:
Скрытое разнообразие паразитов является важной проблемой для таксономии и систематики, а также для решения практических задач, связанных с заболеваниями человека и сельскохозяйственных животных. Недавний мета-анализ показал, что, по сравнению с другими гельминтами, среди трематод обнаруживается больше криптических видов (Pérez-Ponce de León, Poulin, 2018). Это может быть связано с особенностями их размножения, небольшим количеством информативных для систематики жестких структур (таких как крючья), или с традиционно сложившимся подходом к описанию видов в этой группе. В любом случае, распространённость криптических видов среди трематод имеет критическое значение как для оценки разнообразия этих паразитов, так и для таксономических исследований.

Вопросы описания и разграничения видов тесно связаны с тем, какие общие подходы приняты в систематике той или иной группы. Для трематод “краеугольным камнем” систематики было и остается строение половозрелых особей гермафродитного поколения - марит (Gibson, 1987). Также внимание уделялось строению церкарий - личинок гермафродитного поколения (например, Cable, 1974). Однако при использовании только морфологических критериев сложно выделять надёжные признаки: характер их изменчивости зачастую остается неясным. В какой-то степени эту проблему можно пытаться решить, привлекая более тонкие морфологические методы: гистологию (Font et al., 1984; Gibson, Bray, 1986), конфокальную или сканирующую электронную микроскопию (Marigo et al., 2008; de Vasconcelos Melo et al., 2013; Marques et al., 2017; Leite et al., 2020), а также статистический анализ данных морфометрии (например, Gibson et al., 1992). Это трудоемко, технически недоступно многим исследователям, и вдобавок не позволяет радикально улучшить ситуацию.

Один из способов дополнить морфологические данные и достигнуть лучшего понимания видовых границ - это вовлечение информации о географическом происхождении материала и хозяевах. Однако, при таком подходе возможны две крайности. Первая - трактовать образцы из каждой точки и каждого нового хозяина как новые виды, хотя морфологическая “поддержка” может быть при этом довольно слабой (Исайчиков, 1928; Brinkmann, 1967; Shen, 1989; и др.). Вторая крайность - признавать существование всесветно распространённых видов и видов с очень широким спектром хозяев (Kostadinova et al., 2003; Bray et al., 2016; и др.). В таком случае велика вероятность, что морфологические различия просто не смогли выявить, хотя они существуют.
Казалось, что привлечение молекулярных данных поможет полностью решить эти сложности в применении морфологических критериев при выделении видов и построении филогении трематод (Blasco-Costa et al., 2016). Секвенирование маркерных последовательностей ДНК помогло в общих чертах прояснить макросистему трематод (Olson et al., 2003), выяснить эволюционные связи в отдельных группах (Fraija-Fernández et al., 2015; Bray et al., 2016; Tkach et al., 2016; Sokolov et al., 2019; и др.) и стимулировало описание новых видов (множество примеров, в частности, в последние годы - Roberts et al., 2019; Casalins et al., 2020; Montes et al., 2021 и др.). Однако интерпретация молекулярных данных тоже не всегда однозначна и, в частности, зависит от консервативности выбранного маркера (Blasco-Costa et al., 2016; Huston et al., 2021). Накопленный опыт позволил исследователям сформулировать принципы, которые помогут не запутывать, а, напротив, постепенно разрешать вопросы связанные с определением границ видов у трематод. В частности, достижение лучших результатов возможно при комплексном подходе: для различения близких видов трематод требуется реципрокная монофилия по наиболее вариабельному маркеру в сочетании с различиями в морфологии и/или в спектрах хозяев (Bray et al., 2022). Эти обобщения базируются, в основном, на материале по трематодам рыб в Индо-Тихоокеанской области (Huston et al., 2021; Bray et al., 2022; Cribb et al., 2022), так что особый интерес представляет их адаптирование для трематод из принципиально иных регионов. Кроме того, подобный подход пока опробован на небольшом наборе таксонов трематод (Gorgocephalidae, Lepocreadiidae, Bivesiculidae), и применение его в других группах также может иметь свою специфику.

Еще один источник информации, полезный для определения границ видов - это данные о жизненных циклах и строении личинок (церкарий и метацеркарий). В ряде работ было показано, что виды, не отличимые (или практически не отличимые) на стадии мариты, могут расходиться и по используемому виду первого промежуточного хозяина, и по морфологии/локализации личинок (Taskinen et al., 1991; Gilardoni et al., 2020; Gonchar, Galaktionov, 2021). Ограничением данного подхода является то, что жизненные циклы известны для сравнительно небольшого количества видов трематод (порядка 10% от всего их разнообразия; Littlewood, 2006), причём такие данные отсутствуют для многих таксонов ранга семейств (Pachypsolidae, Hirudinellidae, Accacoelidae, Callodistomidae и т.д.). Однако, молекулярно-генетический анализ позволяет достаточно надёжно реконструировать жизненные циклы, причём для него используются те же маркеры, что и для определения видовой принадлежности и построения филогении (Gonchar, Galaktionov, 2017; Kremnev et al., 2020; Corner et al., 2021; Huston et al., 2021; Wee et al., 2021; Velázquez-Urrieta, de León, 2021; Krupenko et al., 2022; Louvard et al, 2022; и др.).

Таким образом, реализация интегративного подхода к определению границ видов у трематод требует использования нескольких генетических маркеров (как минимум, 28S рДНК, ITS2 и cox1 мтДНК), надёжных данных о жизненных циклах и максимально широкого охвата в отношении источников материала (разные хозяева и точки сбора). Параллельно, анализ вариабельных маркерных последовательностей может использоваться для реконструкции филогеографии и, таким образом, помочь понять, как формировалось биоразнообразие, какие факторы на него влияли исторически, и какие влияют сейчас. Подобных работ на настоящий момент выполнено очень немного (Lawton et al., 2011; Gonchar, Galaktionov, 2020), так что данное направление представляется крайне перспективным.

Основные направления исследований в мировой науке по данной проблеме и научные конкуренты:
В настоящее время молекулярно-генетические методы при исследовании трематод применяются крайней широко, но преимущественно для решения вопросов систематики как на уровне отдельных видов (Sokolov et al., 2021; Curran et al., 2022; и др.), так и на макроуровне (Pérez-Ponce de León, Hernández-Mena, 2019). Реже встречаются работы по частичной расшифровке жизненного цикла (Wee et al., 2021; Louvard et al., 2022; и др.), еще более редкими являются работы, включающие комплексные данные по жизненным циклам (Velázquez-Urrieta, Pérez-Ponce de León, 2021; и др.). Есть исследования, в рамках которых молекулярно-генетические методы применяются для расшифровки жизненных циклов комплексов криптических видов, однако выполнены эти работы либо на пресноводных трематодах (Georgieva et al., 2013), либо на морских, но обитающих в южной части Атлантического океана (Gilardoni et al., 2020).
По набору исследуемых объектов нашей группе близка команда А.Д. Атопкина, работающая на Дальнем Востоке, однако их в первую очередь интересуют вопросы систематики. Транс-арктическое распространение трематод изучает группа под руководством К.В. Галактионова, однако их модельными объектами являются трематоды, мариты которых паразитируют в морских птицах. Наконец, группа под руководством Томаса Крибба не только работает по сходной тематике, они, собственно, разработали тот комплексный подход к изучению биоразнообразия трематод, который мы планируем использовать в нашей работе. Этих исследователей можно было бы рассматривать в качестве прямых конкурентов, однако они работают в совершенно другом регионе земного шара - Индо-Пацифике. В нашем проекте мы будем развивать предложенный группой Томаса Крибба подход, применив его к трематодам, паразитирующим в рыбах субарктических и арктических (Белое, Баренцево, Восточно-Сибирское) морей, а также морей бореально-умеренного пояса (Охотское, Японское).


Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта:
Изучать скрытое разнообразие трематод мы планируем на нескольких модельных объектах: Derogenes varicus, Progonus muelleri (Derogenidae), Lecithatser salmonis (Lecithasteridae) и Podocotyle atomon (Opecoelidae). Согласно литературным данным, эти трематоды характеризуются широким ареалом, охватывающим моря севера Евразии и Дальнего Востока (Шульман и Шульман-Альбова, 1953; Полянский, 1955; Жуков, 1960, 1963; и др.). Мариты выбранных модельных объектов обладают низкой специфичностью по отношению к окончательному хозяину, и, как следствие, паразитируют у большого числа видов рыб, относящихся к разным таксономическим группам. Согласно нашим и литературным данным (Sokolov et al., 2021; Krupenko et al., в печати), Derogenes varicus, Progonus muelleri и Podocotyle atomon представляют собой комплексы криптических видов, а L. salmonis, по-видимому, является единым видом с широким ареалом (Atopkin et al., 2020; Krupenko et al., 2022). Для выяснения истинного видового богатства выбранных нами модельных объектов, установления межвидовых границ и границ ареалов мы планируем применить следующие методы и подходы.

Для реализации проекта в первую очередь необходим сбор материала в географически разнесенных точках, включающих субарктические (Белое), арктические (Баренцево, Восточно-Сибирское), и дальневосточные (Охотское, Японское) моря. Не пытаясь охватить все многообразие морских рыб обозначенных регионов, мы сконцентрируемся преимущественно на представителях семейств Clupeidae, Cottidae, Gadidae, Osmeridae, Pleuronectidae и Salmonidae. Выбор именно этих рыб в качестве объектов изучения не случаен. Камбаловые и особенно керчаковые - это массовые виды, являющиеся неотъемлемым компонентом прибрежных сообществ. Кроме того, именно в бентосных рыбах наиболее часто попадается Progonus muelleri - ввиду особенностей своего жизненного цикла, использования в качестве второго промежуточного хозяина не копепод, а морских козочек (Sokolov et al., 2021; Krupenko et al., в печати). Тресковые, сельдевые и корюшковые - пелагические рыбы, способные преодолевать большие расстояние и обеспечивать генетический обмен между удаленными популяциями паразитов. Кроме того, дальневосточные представители каждого из этих семейств (Eleginus navaga, Clupea pallasii, Osmerus mordax dentex) в историческом прошлом мигрировали на Запад вдоль арктического побережья Евразии (Makhrov, Lajus, 2018), и могут быть ответственны за появление в этих акваториях дальневосточных видов паразитов. Наконец, лососевые - это типовые хозяева L. salmonis, специфичность к которым у этого вида наиболее высока (Krupenko et al., 2020). Более того, для лососевых характерно широкое распространение в водах северного полушария, что также делает их потенциальными кандидатами на роль переносчиков паразитов с Востока на Запад (или в обратном направлении).

Потенциальных промежуточных хозяев изучаемых трематод (гастропод отр. Littorinimorpha и ракообразных) мы будем собирать, по возможности, во всех запланированных локациях, однако наиболее массово - в Белом, Баренцевом и Японском морях. Отлов рыб будет осуществляться с помощью жаберных сетей, ловушек и удочек. Беспозвоночных животных мы будем собирать с помощью драги, кошки, легководолазного оборудования (в случае сублиторальных видов) и ручного сбора с литорали. Для поиска метацеркарий Derogenidae и Lecithasteridae мы будем брать пробы планктона с помощью сети Джеди.

В Белом море мы собираемся отлавливать рыб (окончательных хозяев) и беспозвоночных животных (промежуточных хозяев) в двух точках Кандалакшского залива: окрестностях Учебно-научной базы СПбГУ “Беломорская”, ББС ЗИН РАН “Картеш” (Керетский архипелаг) и ББС МГУ им. Н.А. Перцова (пролив Великая Салма). Использование двух точек в Белом море кажется нам целесообразным по нескольким причинам. С одной стороны, окрестности УНБ СПбГУ и ББС “Картеш” хорошо знакомы всем участникам проекта, что позволит оперативно отловить потенциальных промежуточных хозяев Podocotyle atomon (гастропод сем. Littorinidae и бокоплавов сем. Gammaridae), Derogenidae и Lecithasteridae (гаспропод сем. Naticidae, копепод и бокоплавов сем. Caprellidae), а также марит изучаемых трематод. С другой стороны, по нашим данным в окрестностях ББС МГУ гораздо чаще встречаются мариты Progonus muelleri. Именно здесь мы обнаружили первого промежуточного хозяина одного из видов этого комплекса (Krupenko et al., в печати), и с высокой степенью уверенности можем ожидать, что найдем партенит и личинок второго. На Баренцевом море основным местом наших сборов будет Восточный Мурман, окрестности пос. Дальние Зеленцы. Здесь мы будем отлавливать рыбу и первых промежуточных хозяев Derogenidae и Lecithasteridae (гастропод сем. Naticidae). В Восточно-Сибирском море мы будем собирать материал в Чаунской губе (окрестности Певека и Апапельгино), где планируем в первую очередь отлов рыб, и, если это окажется возможным - гастропод сем. Naticidae. В Охотском море материал будет собран в Тауйской губе (окрестностях г. Магадан), в кооперации с коллегами из ИБПС ДВО РАН. Здесь, как и в Чаунской губе, мы будем отлавливать в первую очередь окончательных хозяев - рыб, но, по возможности, постараемся собрать также и промежуточных хозяев. В Японском море мы будем собирать материал в заливе Восток, в окрестностях базы ННЦМБ ДВО РАН “Восток”. Здесь мы будем отлавливать как окончательных хозяев, рыб, так и промежуточных хозяев. Японское море - типовое местообитание вида L. salmonis, и наши основные усилия будут направлены на поиск партенит и личинок именно этой трематоды. Наконец, мы планируем включить в работу материал (рыбы и беспозвоночные животные), который был собран участниками проекта в Белом и Баренцевом морях ранее, а также будет собран в Баренцевом, Печорском и Японском морях в 2022 г. до начала реализации настоящего проекта.

Методической основой выполнения поставленных задач мы видим уже показавший свою эффективность комплекс молекулярно-генетических, морфологических и эколого-паразитологических методов. Во всех точках мы будем вести учет вскрытых рыб, а также записывать параметры экстенсивности и интенсивности инвазии трематод. Сбор этих данных (наряду с молекулярно-генетическими) будет использован в качестве биологического признака для установления межвидовых границ внутри комплексов криптических видов (в том случае, если у разных видов будет обнаружена специфичность по отношению к хозяину/группе хозяев). Обнаруженных марит мы будет фиксировать по стандартной методике, позволяющей стандартизировать снимаемые с червей впоследствии замеры - нагреванием в капле физиологического раствора над пламенем спиртовки и последующей фиксацией 96 %-ным спиртом (Cribb, Bray, 2010). Из марит будут изготовлены тотальные препараты для проведения морфологического анализа и морфометрии. Предварительно от червей будет отделен небольшой фрагмент для последующего выделения ДНК. Получившиеся ваучеры (гологенофоры) позволят однозначно привязать морфологическую изменчивость марит к генетической (или показать отсутствие этой привязки). Проведенная морфометрия взрослых червей может также помочь разграничить виды внутри комплексов криптических видов с использованием анализа главных компонент. Найденных партенит и метацеркарий мы также будем фиксировать для последующего выделения ДНК. Помимо этого, детальные морфологические исследования мы планируем провести для не обнаруженных нами ранее партенит и личинок внутри комплексов Derogenes varicus и Progonus muelleri, а также Podocotyle atomon. С этой целью мы планируем фиксировать данный материал в 2,5 % глутаральдегиде, 4 % ПФА и жидкости Ценкера для последующего составления морфологического описания. Его основу составят прижизненные наблюдения над личинками (микрофото- и видеосъемка), а также данные, полученные с применением гистологических методов, конфокальной и сканирующей электронной микроскопии. Гистологические срезы будут использованы для уточнения организации железистой системы церкарий и для выяснения путей миграции личинок в моллюске в процессе выхода во внешнюю среду. Сканирующая электронная микроскопия будет использована для описания общей морфологии и вооружения тегумента. Применение конфокальной микроскопии в сочетании с флуоресцентным мечением антителами, окрашиванием ядер и актина позволит визуализировать практически все структуры в теле церкарии: выделительную, пищеварительную и мышечную систему, зачаток половой системы, железистый аппарат. Мы ожидаем, что различия в строении церкарий (а также используемом виде первого промежуточного хозяина) окажутся наиболее удобными биологическими признаками для разграничения видов внутри комплексов Derogenes varicus и Progonus muelleri. Для Podocotyle atomon мы предполагаем, что морфология церкарий в пределах этого комплекса окажется скорее однотипной, а расходиться виды будут генетически и по используемым видам промежуточных хозяев.

Значительная часть работы завязана на молекулярно-генетических исследованиях. Для установления внутри- и межвидовых границ мы будем секвенировать набор ядерных (18S, ITS1, 5.8S+ITS2, 28S рДНК) и митохондриальных (в первую очередь - фрагмент гена cox1) маркеров. В случае, если разрешающей способности гена cox1 окажется недостаточно, мы будем пробовать добиться результатов секвенируя фрагменты других митохондриальных генов (например, nadh1, nadh3, nadh4). Использование набора из нескольких маркерных последовательностей (как ядерных, так и митохондриальных) в настоящее время является обязательным для подобного рода работ по филогенетическому анализу. Данные по фрагментам ДНК с разной степенью вариабельности дополняют друг друга, и это позволяет провести первичное выделение генетических линий внутри видов/комплексов видов. Наши морфологические исследования, анализ географического распространения и специфичности по отношению к хозяевам будут проводиться уже для выделенных таким образом генетических линий. Помимо этого, вариабельные митохондриальные последовательности будут использованы для построения сетей гаплотипов, что позволит нам оценить широту арела изучаемых видов, а также выявить вероятное место их происхождения и пути миграции. Анализ данных по внутривидовой изменчивости по этим маркерам позволит искать ответы на вопросы о генетической структуре видов и ее географических закономерностях в контексте информации о биологии разных стадий жизненного цикла и их хозяев.

Общий план:

1 год (январь 2023 – декабрь 2023)

1. С декабря по март 2023:
Обработка имеющегося материала по Lecithaster salmomnis и Podocotyle atomon из Белого, Баренцева, Печорского и Японского морей. Выделение ДНК из марит, изготовление тотальных препаратов. Выделение ДНК из партенит. Амплификация и секвенирование ядерных (18S, ITS1, 5.8S+ITS2, 28S) и митохондриального (cox1) маркеров. Обработка полученных сиквенсов, проведение филогенетического анализа. Построение предварительных сетей гаплотипов. Переописание жизненных циклов в пределах комплекса криптический видов Podocotyle atomon. Составление морфологического описания партенит и личинок этих видов, проведение морфометрии марит.
2. Март 2023:
Экспедиция на Белое море (УНБ СПбГУ “Беломорская”), отлов промежуточных и окончательных хозяев трематод. Получение и фиксация новых образцов марит и партенит Lecithaster salmonis, Podocotyle atomon, Derogenes varicus, Progonus muelleri.
3. Апрель-май 2023:
Обработка нового беломорского материала: выделение ДНК, секвенирование маркерных последовательностей, проведение филогенетического и филогеографического анализа. Изготовление препаратов с гологенофорами марит, морфологический анализ этих образцов
Обобщение полученных данных по генетической и морфологической изменчивости L. salmonis, филогеографический анализ, начало работы над рукописью.
Завершение описания партенит и личинок комплекса видов P. atomon. Подготовка иллюстративного материала.
4. Июнь 2023:
Сбор материала в Белом море в окрестностях Керетского архипелага (УНБ СПбГУ “Беломорская”) и Великой Салмы (ББС МГУ). Отлов окончательных (рыб) и промежуточных (гастроподы отр. Littorinimorpha и ракообразные) хозяев Derogenidae, Lecithasteridae и Opecoelidae. Получение и фиксация новых изолятов марит, личинок и партенит.
Составление морфологических описаний партенит и личинок для криптических видов P. muelleri на основе прижизненного микроскопирования; фиксация материала для дальнейшего морфологического анализа.
5. Июль 2023:
Сбор материала в Баренцевом море, в окрестностях пос. Дальние Зеленцы. Отлов окончательных (рыбы) и промежуточных (гастроподы отр. Littorinimorpha и ракообразные) хозяев Derogenidae, Lecithasteridae и Opecoelidae. Получение и фиксация новых изолятов марит и партенит. В случае обнаружения ранее не описанных партенит и личинок проведение их прижизненного микроскопирования, фото- и видеосъемки.
Выделение ДНК из изолятов P. atomon и L. salmonis, собранных в Белом море в июне 2023 г. Получение последовательностей рДНК и cox1, включение их в филогенетический и филогеографический анализы.
Обобщение данных по жизненным циклам и видовому составу комплекса криптических видов P. atomon. Начало работы над статьей.
6. Август 2023:
Сбор материала в Восточно-Сибирском (Чаунская губа) и Охотском (Тауйская губа) морях. Отлов окончательных хозяев (рыб) и, по возможности, промежуточных хозяев. Получение и фиксация новых изолятов марит и партенит.
Выделение ДНК из изолятов P. atomon и L. salmonis, собранных в Баренцевом море в июле 2023 г. Получение последовательностей рДНК и cox1, включение их в филогенетический и филогеографический анализ.
7. Сентябрь 2023:
Сбор материала в Японском море, окрестностях станции “Восток”. Отлов окончательных (рыб) и промежуточных (гастроподы отр. Littorinimorpha и ракообразные) хозяев Derogenidae, Lecithasteridae и Opecoelidae. Получение и фиксация новых изолятов марит и партенит. В случае обнаружения ранее не найденных партенит и личинок проведение их прижизненного микроскопирования, фото- и видеосъемки.
Выделение ДНК из изолятов P. atomon и L. salmonis, собранных в Восточно-Сибирском и Охотском морях в августе 2023 г. Получение последовательностей рДНК и cox1, их включение в филогенетический и филогеографический анализы.
8. Октябрь 2023: сбор материала в Белом море в окрестностях Керетского архипелага (ББС “Картеш”). Получение и фиксация новых изолятов марит Derogenes varicus и Progonus muelleri.
9. Ноябрь 2023: завершение работы над рукописями по жизненным циклам, видовому составу и филогеографии P. atomon и L. salmonis.
10. Декабрь 2024: подготовка промежуточного отчета по проекту.

В первый год реализации проекта будут получены следующие результаты:

1. Мы опишем комплекс криптических видов Podocotyle atomon, определим внутри- и межвидовую генетическую изменчивость по ядерным и митохондриальным маркерам, расшифруем жизненные циклы, переопишем партенит и личинок, проведем морфометрию марит. Будет выполнен филогеографический анализ, построены сети гаплотипов, уточнен ареал видов данного комплекса.
2. Мы оценим широту ареала Lecithaster salmonis, выясним, является ли этот вид единым на всем его протяжении, или же представляет собой комплекс криптических видов. Будет проведен филогеографический анализ, выявлено предположительное место возникновения L. salmonis, установлены пути его географического распространения и предложены возможные исторические сценарии колонизации разных видов лососёвых рыб на территории морей севера Евразии и Дальнего Востока.

2 год (январь 2024 – декабрь 2024)

1. С января по март 2024:
Обработка имеющегося материала по комплексам криптических видов Derogenes varicus и Progonus muelleri из Белого, Баренцева, Печорского, Восточно-Сибирского, Охотского и Японского морей. Выделение ДНК из марит, изготовление тотальных препаратов. Выделение ДНК из партенит и метацеркарий. Амплификация и секвенирование ядерных (18S, ITS1, 5.8S+ITS2, 28S) и митохондриального (cox1) маркеров. Обработка полученных сиквенсов, проведение филогенетического анализа. Построение предварительных сетей гаплотипов. Составление морфологических описаний новых партенит и личинок, обнаруженных в 2023 г.
2. Март 2024:
Экспедиция на Белое море (УНБ СПбГУ “Беломорская”), отлов рыб. Получение и фиксация новых изолятов D. varicus и P. muelleri.
3. Апрель 2024:
Обработка нового беломорского материала: выделение ДНК, секвенирование маркерных последовательностей, проведение филогенетического и филогеографического анализа. Завершение описания новых партенит и личинок криптических комплексов D. varicus и P. muelleri. Подготовка иллюстративного материала.
4. С мая по июль 2024:
Сбор материала в Белом море в окрестностях Керетского архипелага (УНБ СПбГУ “Беломорская”) и Великой Салмы (ББС МГУ). Отлов окончательных (рыб) и промежуточных (гастроподы сем. Naticidae, копеподы и бокоплавы) хозяев Derogenidae. Получение и фиксация в 96 %-ном спирте новых изолятов марит, личинок и партенит.
5. Июль 2024:
Сбор материала в Охотском (Тауйская губа) море. Отлов окончательных хозяев и, по возможности, первых промежуточных хозяев Derogenidae. Получение и фиксация новых изолятов марит и партенит. Выделение ДНК из изолятов D. varicus и P. muelleri, собранных в Белом море в мае и июне 2024 г. Получение последовательностей рДНК и cox1, включение их в филогенетический и филогеографический анализ.
6. Август 2024:
Обработка изолятов D. varicus и P. muelleri, собранных в Охотском море в июле 2024 г. Обобщение полученных данных по жизненным циклам, внутривидовой генетической изменчивости, видовому богатству и географическому распространению комплексов криптических видов D. varicus и P. muelleri.
7. Сентябрь-октябрь 2024: подготовка рукописи статьи по D. varicus и P. muelleri, подача в журнал.
8. Ноябрь 2024: Правка статьи в соответствии с замечаниями рецензентов. Подготовка итогового отчета по проекту.

На основе данных, полученных за 2-й год реализации проекта, будут получены следующие результаты:

1. Будет определена генетическая структура комплексов криптических видов Derogenes varicus и Progonus muelleri на территории морей севера Евразии и Дальнего Востока.
2. Полученные данные по спектрам промежуточных и окончательных хозяев, морфологии марит и церкарий, а также географическому распространению изолятов будут использованы для подтверждения валидности выделения генетических линий в самостоятельные виды.
3. По результатам филогеографического анализа будет выявлено вероятное место происхождения и пути распространения видов из комплексов Derogenes varicus и Progonus muelleri на территории морей севера Евразии и Дальнего Востока.
4. Будут выявлены основные факторы, определяющие процесс видообразования в комплексах Derogenes varicus и Progonus muelleri.


Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту, наличие опыта совместной реализации проектов:
Все участники проекта на протяжении длительного времени работают с трематодами, изучают их строение, жизненные циклы, разнообразие и разные аспекты биологии.
На протяжении последних пяти лет Крупенко Д.Ю., Гончар А.Г. и Кремнев Г.А. выполняли совместную работу по изучению фауны и жизненных циклов трематод, циркулирующих в сублиторальных сообществах Белого моря (из которых последние три года - в рамках проекта РНФ 19-74-10029 под руководством Д.Ю. Крупенко). Результатом этой работы стал значительный пересмотр видового состава трематод данного региона, их жизненных циклов, а также путей циркуляции. В частности, была обнаружена возможность прогенетического развития метацеркарий Neophasis anarrhichae в беломорских гастроподах Buccinum undatum (Krupenko et al., 2019); уточнен видовой состав беломорских трематод семейства Fellodistomidae, верифицирован жизненный цикл Steringophorus furciger и F. fellis, расшифрован жизненный цикл F. agnotum (Krupenko et al., 2020); впервые расшифрован жизненный цикл трематод семейства Brachycladiidae, паразитов морских млекопитающих (Kremnev et al., 2020); расшифрован жизненный цикл Hemiurus levinseni (Krupenko et al., 2020) и переописан жизненный цикл Neophasis oculata (Kremnev et al., 2021); в составе беломорской трематодофауны выявлен вид Lecithaster salmonis - паразит лососёвых Тихого океана, расшифрован его жизненный цикл (Krupenko et al., 2022); получены первые данные о комплексах криптических видов Derogenes varicus и Progonus muelleri, расшифрованы их жизненные циклы (Krupenko et al., в печати). Кроме того, авторами был получен еще целый ряд интересных данных о жизненных циклах, видовом составе трематод Белого моря, симбиофауне брюхоногих и двустрочатых моллюсков, паразитофауне рыб, которые пока не были опубликованы в виде статей, однако были частично представлены на международной конференции EMOP 2021 (Сербия, Белград). Под руководством Д.Ю. Крупенко исполнитель проекта О.А. Скобкина в 2022 г. защитила бакалаврскую работу, посвященную строению цистофорных церкарий L. salmonis. Большим опытом работы по реконструкции жизненных циклов и филогеографическому анализу трематод обладает А.Г. Гончар: в её работах расшифрованы жизненные циклы нескольких видов семейства Notocotylidae (Gonchar, Galaktionov, 2017, 2021; Gonchar et al., 2019); установлена генетическая структура трематод Tristrista anatis, паразитирующих в арктических птицах, и показано, как структура их жизненного цикла связана с возможностями транс-арктического распространения данных паразитов (Gonchar, Galaktionov, 2020); проведено сравнение генетической структуры для трематод с моно- и триксенными жизненными циклами (Gonchar, 2020). Таким образом, методы, которые мы планируем применять в рамках выполнения данного проекта, успешно применялись в наших предыдущих исследованиях.

У коллектива есть значительное количество наработок, которые будут привлечены для успешной реализации настоящего проекта. В первую очередь, это накопленный нами за время работы над предыдущим грантом РНФ фиксированный материал по разным стадиям развития беломорских и баренцевоморских трематод, в том числе всех тех видов, которые были выбраны в качестве модельных объектов данного исследования. Наличие этого материала позволит приступить к лабораторной работе ещё до запланированных экспедиций по сбору нового материала. Кроме того, мы планируем подключить к работе материал, который будет собран участниками проекта (Д.Ю. Крупенко и Г.А. Кремневым) в Печерском и Японском морях летом и осенью 2022 г., до начала реализации проекта. Наконец, у нас имеются достаточно серьезные наработки по генетической изменчивости и морфологической вариабельности марит Podocotyle atomon, которые станут основой для выявления генетических линий в пределах этого комплекса и переописания жизненных циклов. Полученные нами ранее обширные результаты по заражённости разных видов рыб Белого моря позволят в дальнейшем охарактеризовать специфичность для отдельных исследуемых комплексов криптических видов.

Резюмируя, члены коллектива давно работают единой командой, обладают опытом совместной реализации проектов. Владение широким спектром методов, необходимых для выполнения поставленных задач, подтверждается предыдущими опубликованными результатами. Наконец, в нашем распоряжении имеется обширный материал, собранный в предыдущие годы работы, который будет использован для успешной реализации настоящего проекта.