Результаты, полученные в 2022 году отображены в отчетной документации. Здесь приводятся конкретные результаты, указанные в разделе 2 отчета о НИР:
1. Проведённые эксперименты по направлению исследований «Анализ молекулярных механизмов выделения нейроактивных веществ и связанных с ними мембранных процессов».     Новые данные были получены в экспериментах по изучению реформирования везикул в результате «bulk» эндоцитоза при клеточной секреции нейроактивных веществ. В рамках проекта нами ранее была разработана технология анализа динамики мембранных процессов при секреции с помощью микроскопии супер-высокого разрешения Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED) в живых хромафинных клетках надпочечников. С помощью STED технологии мы получили возможность изучать в реальном времени динамику мембранных явлений в процессе экзо- и эндоцитоза в живой секреторной клетке. Эти эксперименты, позволили объяснить каким образом формируются мембранные структуры различных типов в процессе секреции в реальном времени. В наших экспериментах в 2022 году было показано, что при интенсивной стимуляции отпочкования клатриновых везикул происходит от больших инвагинаций плазматической мембраны. При этом данные инвагинации остаются связанными с наружной мембраной клетки перемычками, а не отпочковываются полностью, как происходит при классической форме «bulk» эндоцитоза. Таким образом нами было впервые доказано существование промежуточной формы эндоцитоза, при которой классическая форма клатрин-опосредованного эндоцитоза кооперируется с «bulk» эндоцитозом. Эксперименты проводились в сотрудничестве с Национальным Институтом Здоровья (NIH-NINDS, США). По материалам исследований была опубликована статья в одном из ведущих научных журналов в области нейрофизиологии - iScience (импакт-фактор: 6,10; Q1).
     Были проведены эксперименты по исследованию роли F-BAR белков в процессах реформирования везикул в процессе секреции. В экспериментах на модельной системе - нервно-мышечном соединении у дрозофилы, которая позволяет исследовать сложные генетические модификации белков в живых синапсах - исследовалась роль F-BAR белка Nervous-Wreck (Nwk). Предполагается, что он участвует как в клатрин-независимом, «bulk», так и в клатрин-опосредованном эндоцитозе. Ранее в проекте мы обнаружили, что этот белок взаимодействует с белком-скаффолдом Dap160 в результате взаимодействия SH3 доменов белков. Dap160, в свою очередь, взаимодействует с многими эндоцитозными молекулами, а также с белком синапсином, который организует везикулы в кластер в нервных окончаниях. Было показано, что у мутанта, у которого Dap160 не может взаимодействовать с Nervous-Wreck, нарушается механизм контроля размера синаптических везикул. Для подтверждения этого результата мы провели исследования на мутантах Nervous-Wreck, у которых нарушена возможность связываться с Dap160 и взаимодействовать с плазматической мембраной. Исследована относительная локализация белков в нервных окончаниях с помощью конфокальной микроскопии, STED и электронной микроскопии. В физиологических экспериментах проанализированы функциональные последствия селективного нарушения взаимодействия белков. По материалам исследований в 2022 году подготовлена и направлена в журнал Cell Reports (импакт-фактор: 9,99; Q1) статья. Результаты исследований были также представлены в виде стендового доклада на VI конференции ИТБМ СПбГУ «Актуальные проблемы трансляционной биомедицины 2022», 25-26 июля 2022 года.
     В экспериментах с использованием другой модельной системы, разработанной ранее в нашей лаборатории, гигантского аксона миноги, мы исследовали роль F-BAR белка, синдапина, в процессе реформирования секреторных везикул. Мы использовали антитела, которые блокируют взаимодействие SH3 домена белка с ключевым эндоцитозным белком, ГТФазой динамином. Ранее считалось, что синдапин рекрутирует динамин для эффективного отпочкования больших участков синаптической мембраны при высокочастотной стимуляции в процессе «bulk» эндоцитоза. Было обнаружено, что напротив, блокада взаимодействия белков приводит к резкому увеличению образования свободных эндосом при длительной (20 мин) высокочастотной стимуляции (5 Гц). Эти результаты позволяют предполагать, что синдапин секвестрирует динамин на поверхности мембранных инвагинаций и препятствует формированию эндосом при стимуляции. Предполагается, что это может приводить к вышеописанной кооперации «bulk» и клатрин-опосредованного эндоцитоза и более эффективному формированию везикул одинакового размера с помощью клатрин-опосредованного эндоцитоза после завершения высокочастотной стимуляции.
     По материалам исследований в 2022 году подготовлено и направлено в журнал Биологические мембраны (Q4) краткое сообщение с описанием данного результата. Проводятся дальнейшие исследования локализации синдапина в пресинапсе с помощью микроскопии высокого разрешения для выяснения детальных молекулярных механизмов описанных явлений.

1.1 Кооперация клатрин-опосредованного эндоцитоза и «bulk» эндоцитоза при реформировании секреторных везикул.
     Для детального структурного анализа мембранных структур, формирующихся в хромаффинных клетках при реформирования секреторных везикул, производилась быстрая заморозка клеток в процессе секреции. Препараты заливались в смолу и исследовались с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Для объемной визуализации структур на внутриклеточной поверхности клеток изготавливали реплики с поверхности мембраны после быстрого разрушения клеток с последующей фиксацией в альдегидах. С использованием обоих подходов в дополнение к классическим формам эндоцитоза – клатрин-опосредованного эндоцитоза с поверхности внутренней мембраны и «bulk» эндоцитоза – удалось обнаружить массовое формирование клатриновых с поверхности мембранных инвагинаций.
Для изучения динамики формирования данных структур и процесса отпочкования клатриновых пузырьков проводилась STED микроскопия в живых хромаффинных клетках, погруженных в раствор. При этом мембрана клетки метилась в результате повышенной экспрессии фосфолипазы С дельта РН-домена конъюгированного с mNeonGreen. Клатрин метился в результате трансфекции клеток конструктом клатрин mTFP1. Это позволило провести оптическую регистрацию процесса формирования и отпочкования клатрин-окаймленных ямок с поверхности инвагинации в реальном времени.
Был проведен количественный анализ параметров и характеристик инвагинаций с клатрин-опосредованными ямками.
      Было показано, что при реформировании секреторных везикул задействуется дополнительная промежуточная стадия, на которой происходит кооперация клатрин-опосредованного эндоцитоза и «bulk» эндоцитоза.
Сформированы соответствующие выводы:
1. В реформировании секреторных везикул в процессе секреции участвует дополнительная промежуточная стадия, на которой происходит кооперация клатрин-опосредованного эндоцитоза и «bulk» эндоцитоза.
2. Клатрин-опосредованный эндоцитоз происходит преимущественно на мембранных инвагинациях. Это позволяет получать большее количество везикул одинакового размера в процессе восстановления и, соответственно, обеспечивать квантовый характер выделения биологически активных веществ при секреции.

1.2 Взаимодействие белков Dap160-Nwk контролирует размеры синаптических везикул.
     Получены следующие результаты:
1) Было показано, что белок-скаффолд Dap160 взаимодействует с NWK с помощью SH3С домена в дефосфорилированном состоянии.
2) Получены конфокальные изображения нервно-мышечных синапсов, меченных с помощью иммуногистохимии антителами против Dap160 и NWK у 3-instar личинок дрозофилы. Dap160 и NWK в значительной степени (>80%) колокализуются при стимуляции. У dC мутанта колокализация нарушается и составляет < 35%.
3) В нервно-мышечных соединениях у мутанта dC и dF-BAR синаптические везикулы имеют увеличенный диаметр.
4) Вызванные и миниатюрные потенциалы в нервно-мышечных соединениях у 3-instar личинок дрозофилы у контрольной линии и у мутанта dC. Графики показывают статистический анализ амплитуды и частоты миниатюрных потенциалов (Р <0.05) и уровень падения амплитуды вызванных потенциалов при ритмической стимуляции с частотой10 Гц.
     Согласно полученным результатам были сформированы следующие выводы:
1. Наши эксперименты показывают, что рекрутирование F-BAR белка Nwk с помощью скаффолд-белка Dap160 к мембране формирующегося синаптического пузырька в процессе эндоцитоза является важным этапом формирования однородной популяции синаптических везикул при синаптической активности.
2. Nwk меняет свою локализацию в нервной терминали при синаптической активности. В состоянии покоя Nwk локализуется в периактивной зоне синапса на границе кластера синаптических везикул. Взаимодействие с SH3C доменом Dap160 перемещает Nwk в область пресинаптической мембраны, где происходит реформирование синаптических везикул.
3. Взаимодействие между двумя белками регулируется фосфорилированием. У мутантов, у которых Dap160 лишен SH3C домена, рекрутирования Nwk не происходит. При нарушении взаимодействия между Dap160 и Nwk, а также у мутантов, у которых в структуре Nwk отсутствовал F-BAR домен, позволяющий белку связываться с пресинаптической мембраной, синаптические везикулы в нервно-мышечных синапсах имели различные диаметры. Восстановления функции при введении только F-BAR, у rescue мутанта nwk BAR, не происходит.
4. При синаптической активности при нарушении взаимодействия Dap160 и Nwk происходит нарушение синаптического цикла и реформирования синаптических везикул.
5. Электрофизиологические эксперименты выявили нарушения в синаптической передаче, которые коррелировали со структурными изменения в нервно-мышечных синапсах.

1.3 Исследование роли F-BAR белка синдапина в «bulk» эндоцитозе. Негативная регуляция функции динамина синдапином при восстановлении синаптических везикул.
     Внутриклеточные микроинъекции в гигантские ретикулоспинальные аксоны миноги проводили с помощью микроэлектродов. После введения антител аксоны стимулировали с частотой 5 Гц в течение 20 мин. Для миноги данная частота является физиологической, поскольку регистрируется в аксонах при инициации локомоторной активности.
Ультраструктурный анализ синапсов обнаружил пятикратное увеличение эндосомоподобных структур на центральных ультратонких срезах синапсов в аксонах инъецированных FAB фрагментами антител против SH3 домена синдапина по сравнению с не инъецированными аксонами в том же препарате или в аксонах инъецированных нейтральными кроличьими IgG (P <0.001; n=11 для каждого случая). Достоверных различий в количестве эндосомоподобрых структур в не инъецированных синапсах и синапсах инъецированных нейтральными кроличьими IgG не наблюдали (P >0.05; n=11 для каждого случая).
     Для выяснения природы эндосомоподобрых структур мы провели их трехмерную реконструкцию синапсов по серийным срезам с помощью программы Amira. Для каждого случая было реконструировано три синапса. Результаты показали, что основная часть профилей представляют собой свободные эндосомы. На мембранной поверхности многих из них наблюдали клатрин-окаймленные ямки, что указывает, что в их состав входит мембрана синаптических везикул. Количественный анализ показал достоверное (5и кратное, P <0.001, n=3) увеличение числа свободных эндосом в реконструированных синапсах, инъецированных FAB фрагментами антител.
Полученный результат указывает, что SH3 домен синдапина не рекрутирует динамин для последующего отпочкования эндосом от поверхности мембраны, как считалось ранее. Увеличение числа свободных эндосом можно объяснить активностью других белков, например, амфифизина, который может доставлять свободный динамин к месту отпочкования мембранных структур. Полученный результат, позволяет взглянуть на функцию синдапина по-новому и предположить иную роль этого белка в его взаимодействии с динамином. Мы предполагаем, что синдапин является негативным регулятором ГТФазы динамина. Белок в комплексе с динамином удерживает динамин на поверхности больших мембранных инвагинаций, к которым прикрепляется с помощью F-BAR домена. Это позволяет локально увеличить концентрацию динамина на их поверхности. При этом, как показали недавние исследования, возможен переход белков в жидкую фазу. В результате, при фосфорилировании и разрушении комплекса синдапин-динамин, динамин может активно участвовать в клатрин-опосредованном эндоцитозе на поверхности эндосом, способствуя, таким образом, эффективному реформированию везикул одинакового размера. Можно также предположить, что уменьшение вероятности отпочкования мембраны, содержащей синаптические белки позволяет удержать мембрану, содержащую белки необходимые для реформирования везикул в непосредственной близости от активной зоны, препятствуя, таким образом, возможному аксональном транспорту этой мембраны из зоны синаптического контакта.
      Таким образом выявлено, что блок SH3 домена синдапина с помощью антител приводит к увеличению свободных эндосом в синапсах при высокочастотной активности. Это позволяет предположить, что синдапин является негативным регулятором функции ГТФазы динамина в синапсах при высокочастотной стимуляции.
По материалам исследований подготовлено краткое сообщение в журнал Биологические мембраны (Q4). Проводятся дальнейшие исследования для выяснения детальных молекулярных механизмов обнаруженных эффектов. Планируется довести данную работу до уровня журнала Q1 в 2023 году.

2. Проведённые исследования по теме «Изучение роли белковых конденсатов и фазовых переходов состояния пресинаптических белков в норме и при образовании патологических агрегатов и амилоидных структур в нервных клетках».
     На основании данных, полученных нашей лабораторией в рамках настоящего проекта и литературных данных была выдвинута гипотеза, что BAR белки являются регуляторами фазовых переходов жидкость-жидкость (англ. liquid-liquid phase transitions), которые приводят к образованию белковых конденсатов, участвующих в синаптическом везикулярном цикле в нервных окончаниях. В журнал Биологические мембраны был написан обзор: Шишков А. Г., Нифантова Н. В., Коренькова О. М., Сопова Е. С., Бродин Л., Шупляков О. В. BAR белки как возможные регуляторы белковой жидкой фазы в нервных окончаниях в центральной нервной системе. Биологические мембраны. (2022). Статья принята к печати.
     В лаборатории продолжаются эксперименты по анализу молекулярных механизмов фазовых переходов жидкость-твёрдое тело (англ. liquid-solid state transitions), лежащих в основе формирования патологических белковых агрегатов, которые обнаруживаются в нейронах при болезнях Альцгеймера и Паркинсона. На основании данных, полученных в проекте и литературных данных, нами выдвинута гипотеза, что в основе образования патологических белковых агрегатов, содержащих синуклеин, лежат нарушения в формировании белковых жидких фаз участвующих в секреторном цикле синаптических везикул в пресинаптических окончаниях. Работа опубликована: Brodin L., Milovanovic D., Rizzoli S.O., Shupliakov O. α-Synuclein in the Synaptic Vesicle Liquid Phase: Active Player or Passive Bystander? Front. Mol. Biosci., 2022; 9:891508.
Гипотезы, выдвинутые в обзорах, проверяется в экспериментах, которые в настоящее время проводятся в лаборатории.

2.1 BAR белки как возможные регуляторы белковой жидкой фазы в нервных окончаниях в центральной нервной системе.
     Результаты экспериментов, полученные в последние годы, показали, что BAR белки являются одними из ключевых компонентов секреторного везикулярного цикла в нервных окончаниях нейронов. Они участвуют в регуляции секреции нейромедиаторов при слиянии синаптических везикул с пресинаптической мембраной, а также в рециклировании везикул в результате эндоцитоза. Локализация этих белков в зонах нервных окончаний, где формируются жидкие белковые фазы, предполагает дополнительные функции этих молекул. В обзоре мы обсуждаем функции BAR белков на различных этапах секреторного цикла. Мы предполагаем, что BAR белки, помимо регуляции экзо- и эндоцитоза, играют важную роль в организации резервного пула везикул и на промежуточных этапах секреторного цикла. Мы выдвигаем гипотезу, объясняющую каким образом эти белки могут участвовать в регуляции формирования белковых жидких фаз в нервных окончаниях при синаптической активности. К данной гипотезе привели результаты наших экспериментов, которые мы опубликовали в рамках настоящего проекта в 2021 году (результаты были представлены в отчёте). А именно, что при введении изолированных SH3 доменов, разрушающих жидкую белковую фазу, организующую везикулы в активной зоне, в пресинапсе образуются белковые агрегаты. Как известно, в структуру синаптических BAR белков входят SH3 домены, которые могут находиться как в состоянии аутоингибирования, так и активно взаимодействовать с пресинаптическими белками, образующими жидкую фазу. Таким образом BAR белки могут участвовать в регуляторном процессе.
     BAR белки находятся в мономерном аутоингибированном состоянии и стабилизируют жидкую фазу синапсина, организующую везикулы в кластер. F-BAR белки (FCHo, FCHSD и частично синдапин) локализованы в периактивной зоне. При стимуляции вход кальция через потенциал-зависимые Са2+каналы приводит к фосфорилированию синапсина с помощью СаМКII и разрушению жидкой фазы в кластере. N-BAR белки подвергаются дефосфорилированию и димеризации, что приводит к взаимодействию с мембраной синаптических везикул и с другими эндоцитозными белками, например, c динамином и синаптоянином, которые также локализуются в кластере в состоянии покоя. Динамин при этом может одновременно и связывать синдапин, и взаимодействовать с амфифизином, находящимся на мембране везикул. Везикулы перемещаются в активную зону и сливаются с пресинаптической мембраной. ВAR белки, участвующие в регуляции этих стадий, находятся в растворимом состоянии в аксоплазме.
При эндоцитозе ВAR белки снова включаются в состав жидкого белкового конденсата в периактивной зоне. При отпочковании везикул от мембраны с помощью ГТФазы динамина происходят посттрансляционные модификации белков и разрушение жидкой фазы. BAR белки взаимодействуют с синапсином, что приводит к увеличению его локальной концентрации. Дефосфорилирование синапсина и последующее усиление его взаимодействия с везикулами приводят к замещению ВAR белков на поверхности везикул и формированию жидкой фазы. Посттрансляционные изменения и образование аутоингибированных мономеров BAR белков приводят к стабилизации жидкой фазы и организации везикул в кластер. Подробности в тексте обзора.
Гипотеза, выдвинутая в обзоре, проверяется в наших экспериментах в лаборатории.

2.2 Роль α-синуклеина, входящего в состав патологических белковых агрегатов при нейродегенеративных заболеваниях, в регуляции жидкой фазы, организующей синаптические везикулы?
     Анализ данных литературы позволяет заключить, что несмотря на интерсивные исследования, остается неясным какую физиологическую функцию имеет белок α-синуклеин в персинаптических окончаниях. Однако, данные, полученныне в последние годы, позволяют предполагать, что он, вместе с синаптическим белком синапсином, участвует физическом феномене - в организации жидкой белковой фазы, которая организует синаптические везикулы в кластер в активной зоне синапса. Данная роль позволяет предположить механизм патологической трансформации жидкой фазы α-синуклеина в твердую фазу, которая может служить основой для формирования белковых агрегатов в нейронах, которые выявляют при нейродегенеративных заболеваниях, например, при болезни Паркинсона.
В настоящее время в лаборатории проводятся эксперименты, которые проверяют данную гипотезу.

2.3 Исследование ранних патологий в центральных синапсах при мутациях митохондриальных генов, которые приводят к возникновению нейродегенеративных заболеваний.
     Ранее нами было обнаружено, что инактивация Mfn2 приводит к изменению формы митохондрий уже через 2-3 недели после выключения гена. Фокус наших исследований в 2022 году был направлен на изучение внутренней структуры митохондрий у нейронов черной субстанции. Для этого отрабатывались режимы и настройки ФИП-СЭМ для получения серийных срезов с шагом 6 нм.
     Инактивация Mfn2 приводит к нарушению внутренней структуры митохондрий, а именно, морфологии крист. При выключении Mfn2 митохондриальные кристы принимают форму «чаши». Мы также обнаружили, что некоторые кристы ветвятся и образуют цепочки, состоящие из множества сферических структур, соединенных узкими перемычками. Зеленый – внешняя митохондриальная мембрана, желтый – внутренняя мембрана. Масштаб: 0,25 мкм.
     Измерения площади поверхности крист через 6 недель после выключении Mfn2 приводит к трехкратному увеличению площади поверхности отдельных крист (P <0.001; n=20). Предполагается, что происходит перераспределение белковых комплексов, локализованных в основании крист, которые контролируют их размеры. Иммуногистохимические исследования локализации этих комплексов белков, позволят дать ответ на этот вопрос. Эти исследования проводятся в настоящее время в лаборатории.
     Таким образом, были сделаны следующие выводы:
1. Выключение гена Mfn2 в ДН на ранних стадиях приводит к изменению формы митохондрий. Органеллы принимают эллиптическую форму, что указывает на перераспределение белковых комплексов на поверхности мембраны митохондрий, контролирующих их форму.
2. Инактивация Mfn2 в ДН нарушает регулярную организацию митохондриальных крист. Кристы принимают форму «чаши», ветвятся и образуют длинные цепочки. Полученные результаты подтверждают предположения, что Mfn2 связан с белковыми комплексами, которые стабилизируют структуру внутренней мембраны митохондрий.
3. Наши исследования позволяют предполагать, что восстановление нормальной экспрессии Mfn2 будет имеет важное значение для терапии форм болезни Паркинсона, связанных с мутациями Mfn2.