Исследования по НИР «Лаборатория биологии амилоидов» были направлены на изучение механизмов, лежащих в основе амилоидогенеза, а также их использование для разработки подходов к диагностике и, в перспективе, лечению амилоидозов, кроме того, на выявление «амилоидомов» (т.е. совокупности амилоидов в протеоме) различных организмов.

В ходе данного этапа НИР велись исследования по следующим направлениям: поиск новых амилоидов и потенциальных амилоидогенных белков у различных видов животных, включая человека; проверка амилоидогенных свойств у белков кандидатов, выявленных в ходе предыдущих исследований; изучение механизмов, способствующих преодолению и возникновению межвидовых прионных барьеров; изучение механизмов лежащих в основе образования белками биомолекулярных конденсатов, на модели дрожжевого белка Sup35; изучение роли неструктурированных участков дрожжевого белка Sup35 в формировании биоконденсатов; изучение влияния отдельных компонентов шаперонного комплекса Hsp104/Hsp40/Hsp70 на агрегацию Sup35NM из различных видов дрожжей (S.cerevisiae, O.methanolica и L.kluyverii); анализ эффектов известных наследственных мутаций в пептиде Aβ42 на его амилоидную агрегацию, в дрожжевой модели; разработка подхода к неинвазивной диагностике преэклампсии на основе анализа фракции детергент-устойчивых белковых агрегатов в образцах мочи.

В ходе данного этапа работы впервые было показано, что белок человека RAD51, играющий ключевую роль в гомологичной рекомбинации ДНК, формирует амилоидные фибриллы in vitro, а также в бактериальной системе C-DAG. Установлено, что RAD51 слитый с GFP склонен к образованию амилоидо-подобных агрегатов в цитоплазме, при продукции в клеточных линиях человека HEK293T. Используя биоинформатические алгоритмы, выявлены потенциальные участки ответственные за амилоидную агрегацию RAD51.
Проведена характеристика фибрилл формируемых RAD51, установлено, что RAD51 формирует скрученные фибриллы имеющие толщину примерно 25–50 нм и длину более 1 мкм. Фибриллы объединены в толстые (~1 мкм) пучки фибрилл. Каждая фибрилла, состоят из нескольких протофиламентов шириной несколько нанометров, которые связаны латерально. Фибриллы RAD51 проявляют все характерные для амилоидов свойства, такие как устойчивость к детергентам, связывание с красителями тиофлавином Т и Конго красным. Окрашивание амилоидных фибрилл Конго красным вызывает двойное лучепреломление в поляризованном свете. Также продемонстрировано, что агрегация RAD51 может быть ускорена при использовании уже сформированных агрегатов (затравки). Это указывает на то, что агрегация RAD51 является амилоидоподобной. Окончательное доказательство амилоидной природы фибрилл было получено при помощи ренгеноструктурного анализа, который показал наличие кросс β-структуры у исследуемых фибрилл, данная характеристика является отличительной чертой всех амилоидов. Поскольку белок RAD51 человека склонен к образованию амилоидных фибрилл на поверхности клеток бактерий при физиологических условиях, и при сверхпродукции в цитоплазме клеточных линиях человека, то можно предположить склонность к амилоидо-подобной агрегации белка RAD51 in vivo в цитоплазме клеток человека. Мы полагаем, что агрегация RAD51 может влиять на его функции при репарации и рекомбинации ДНК. Формирование белком RAD51 цитоплазматических агрегатов может приводить к нарушению его функционирования; альтернативно, RAD51 в своем амилоидном состоянии может приобретать новые, ранее не известные функции. Для выяснения биологической роли амилоидоподобной агрегации RAD51 и ее возможного участия в репарации ДНК, стабильности генома и онкогенезе, необходимы дальнейшие исследования.

В ходе исследований, выполненных на предыдущих этапах работы, в мозге самцов крысы R. Norvegicus был выявлен ряд белков, которые могут быть потенциальными функциональными амилоидами. Одним из выявленных белков оказался основной белок миелина – MBP. Ранее для этого белка, также была показана, способность формировать фибриллы in vitro. В тоже время, полных доказательств амилоидной природы белка MBP in vivo, получено не было. В ходе данной работы была проведена оценка амилоидных свойств белка MBP в мозге самцов крысы R. Norvegicus. В экспериментах выполненных in vitro, in vivo и ex vivo получены доказательства того, что MBP, функционирует в мозге крысы в амилоидной форме. Используя биоинформатические предсказания, выполненные при помощи различных алгоритмов, а также дрожжевую модель выявлена последовательность ответственная за агрегацию белка MBP. На основе полученных результатов предложена новая модель структурной организации компактного миелина, в состав которого входят амилоидные фибриллы белка MBP.

Ранее нами было показано, что РНК-связывающий белок FXR1 функционирует в головном мозге крыс в амилоидной форме. При этом N-концевая часть белка FXR1 высококонсервативна и имеет высокую степень гомологии в различных классах позвоночных. В тоже время оставалось неясным, насколько амилоидный способ укладки FXR1 распространён среди основных классов позвоночных животных. В ходе данной работы было показано, что в мозге красноухой черепахи, шпорцевой лягушки, и домашней курицы белок FXR1 представлен в форме фибриллярных SDS-устойчивых агрегатов, колокализуется с амилоид-специфичными красителями, окрашивается Конго красным, при этом демонстрируя двойное лучепреломление в поляризованном свете. Полученные в ходе выполнения проекта данные свидетельствуют в пользу того, что FXR1 функционирует в цитоплазме нейронов головного мозга у представителей всех основных классов позвоночных в амилоидной форме.

В ходе данного этапа работы были изучены закономерности передачи прионного состояния между белками Sup35 из разных видов дрожжей, имеющих слабую степень родства. Было показано, что белок Sup35 из L. kluyveri, O. methanolica и N. castellii, дальнеродственных по отношению S. cerevisiae видов дрожжей, способны формировать детергент-устойчивые агрегаты в клетах S. cerevisiae. Таким образом, Sup35 из L. kluyveri, O. methanolica и N. castellii взаимодействуют с внутриклеточным окружением в достаточной мере для того, чтобы сформировать прионные агрегаты. В то же время прионные агрегаты Sup35 этих видов не передают свое прионное состояние на Sup35 S. cerevisiae. Исключение составил белок Sup35NM O. methanolica, который формировал прионные агрегаты в клетках S. cerevisiae и преодолевал межвидовой прионный барьер при дальнеродственной передаче приона [PSI+]. Продемонстрировано, что Sup35 O. methanolica с делетированным участком 115-138 а.к. теряет способность агрегировать в штамме [pin-], кроме того агрегирует в штамме [PIN+] с пониженной частотой. На основе полученных в работе результатов сделано заключение, что приодаление прионного барьера между Sup35 из O. methanolica и S. cerevisiae, происходит вследствие того, что агрегаты Sup35 из O. methanolica выступают в качестве фактора PIN, являясь «затравкой» для начала агрегации мономеров Sup35 из S. cerevisiae.

В ходе этапа продемонстрировано, что шапероны дрожжей S. cerevisiae – Sis1 и Ssa1 способны связываться с прионными агрегатами Sup35NM из отдалённых видов дрожжей (O. methanolica и L. Kluyverii). Полученные данные свидетельствуют о том, что взаимодействия между шаперонными белками являются не специфическими, а взаимозаменяемыми внутри далеких групп организмов. В совокупности с данными полученными в работах Reidy and Masison 2012; Reidy et al. 2013, а также полученные нами результаты указывают на высокую степень консервативности механизма дезагрегации белков между исследуемыми видами дрожжей, и не зависят от наличия межвидового прионного барьера.

Показана различная эффективность связывания шаперонов Sis1, Ssa1 и Hsp104 с белками Sup35N и Sup35NM у дрожжей S.cerevisiae, на начальных стадиях формирования прионных агрегатов. Согласно полученным данным, на ранних стадиях агрегации (6 часов) Sup35N не колокализуется с Sis1, Sis2 или Hsp104, полученный результат можно объяснить тем, что комплекс шаперонов не распознает специфичные сайты связывания, и только когда концентрация прионизованного белка Sup35N достигает значительной величины (после 12 часов индукции синтеза Sup35NM), начинает присоединяться к фибриллам менее специфично. В случае агрегации Sup35NM, взаимодействие с шаперонами Sis1/Sis2/Hsp104 происходит сразу же после начала формирования [PSI+]. На основании полученных данных можно заключить о присутствии в M-домене Sup35, сайтов для связывания с шаперонами.

Используя дрожжевуя тест-систему, для оценки амилоидогенного потенциала белков, были исследованы эффекты известных наследственных мутаций в пептиде Aβ42 на эффективность амилоидной агрегации. Агрегацию Aβ42 в тест-системе оценивали по способности химерного белка Sup35N-Aβ42 нуклеировать полноразмерный белок Sup35, индуцируя, таким образом, его прионизацию. Всего было исследовано 12 различных мутаций в Aβ42 человека.
Анализ вариантов мутантных вариантов Aβ42 в дрожжевой тест-системе показал, что замены D23N и A42V, услиливают индукцию [PSI+], т.е. являются более амилоидогенными в сравнении с а.к. в Aβ42 дикого типа. Замены A2T, A2V, E11K и L34H наоборот снижают эффективность агрегации Aβ42. Мутация A2V (Исландская мутация) ранее описана как мутация снижающая вероятность развития болезни Альцгеймера. Мутация A2T описанная ранее, как наследственная и ассоциированная с БА, в дрожжевой модели демонстрирует склонность к снижению агрегации. Полученный результат, может объясняться тем, что эффекты данной мутации на развитие БА, не связаны с агрегацией Aβ. Мутация L34Н элиминировала агрегацию Aβ42, как в нашей модели, так и в E. coli Wurth et al., 2002, при этом данная мутация описана в клинике (мутация типа Пьемонта), как мутация, приводящая к ранней форме БА. Особенностью клинических проявлений у носителей данной мутации является появление патологии без формирования видимых β-амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков в головном мозге, при этом присутствие олигомеров, токсичных для эндотелиальных клеток. Таким образом, полученные нами данные о негативном влиянии мутация L34H на агрегацию Aβ42 согласуются с клиническими данными. Вариант Aβ42 несущий Мутацию K16N не отличался от дикого типа, в тоже время ранее проявлялась в гетерозиготном состоянии в сочетании с Aβ42 дикого типа. Остальные мутантные варианты значительно не отличались от Aβ42 дикого типа.

Изучена роль неструктурированных участков дрожжевого белка Sup35 в образовании биоконденсатов (безмебранные органеллы клетки, представляющие собой скопление определённых белков и зачастую нуклеиновых кислот). В ходе данной работы была выявлена роль отдельных участков NM-доменов Sup35 в формировании биоконденсатов. Показано, что биоконденсаты формируемые N- или NM-доменами Sup35 являются жидкими каплями. Выявлено, что N-домен Sup35 образует биоконденсаты при сверхпродукции в клетках, даже без стрессовых воздействий. NM-домены дрожжевого белка Sup35 образуют биоконденсаты не только при изменении pH, но и в ответ на гиперосмотический шок (при воздействии 1M KCl). В образовании биоконденсатов при гиперосмотическом шоке задействованы участки Sup35NQ (с 3 по 39 а.к.) и Sup35NR (с 40 по 97 а.к.). Установлено, что делеция участка Sup35 c 3 по 39 а.к. приводит к снижению количества Sup35 в клетках S. cerevisiae. Установлено, что механизм образования биоконденсатов Sup35 при гиперосмотическом шоке не является pH-зависимым.

В ходе данного этапа НИР при помощи методики протеомного скрининга амилоидов PSIA-LC-ESI были составлены протеомные профили для детергент-устойчивых агрегатов выделенных из образцов мочи в группе женщин с преэклампсией и в группе здоровых беременных женщин. Проведено сравнение белкового и пептидного состава образцов в исследуемых группах и выявлены специфичные маркеры преэклампсии в составе мочи и агрегатов. Показано, что протеомные профили опытных и контрольных образцов имели схожие компоненты и включали основные белки крови. В составе всех образцов мочи от пациентов с диагнозом преэклампсия обнаружены гликопротеины AZGP1 и A1BG, которые у здоровых беременных женщин обнаруживается в меньшем количестве и не попадают в список наиболее представленных белков. Кроме того, образцы мочи от пациентов с преэклампсией содержат белки ютероглобин и карбоновую ангидразу 1, которые отсутствуют в моче здоровых беременных женщин. Во фракции детергент-устойчивых агрегатов, выделенных из мочи пациентов с преэклампсией, обнаружен специфичный для данной группы пептид EYTDASFTNR, который является фрагментом белка церулоплазмина. Данный пептид по результатам нашего исследования является одним из потенциальных факторов, участвующих в развитии преэклампсии, исследование которого может помочь раскрыть механизмы патогенеза данного заболевания.