Научная проблема, на решение которой направлен проект
Биоортогональные реакции — это такой тип быстрых химических превращений, которые могут протекать с исключительной хемоселективностью в любом биологическом окружении, не влияя на биосистему и не подвергаясь влиянию из вне, то есть полностью ортогонально по отношению к внешним биологическим условиям. Сегодня биоортогональные реакции являются уникальным инструментом для селективной модификации биомолекул как вне, так и внутри живых систем. Ключевым и неотъемлемым атрибутом биоортогональных реакций являются специфические биоортогональные функциональные группы. Эти группы изначально отсутствуют в биологических системах и природных биомолекулах, но могут быть введены в них при помощи специальных техник. Такие биоортогональные функциональные пары обладают высокой реакционной способностью и хемоселективностью по отношению друг к другу при сохранении химической инертности к многообразию функций в естественном биологическом окружении.
На сегодняшний день известен ряд биоортогональных реакций, многие из которых успешно используются на практике. Наиболее эффективной и широко используемой биоортогональной реакцией является азид-алкиновое циклоприсоединение, промотируемое напряжением (Strain-Promoted Azide-Alkyne Cyloaddition, SPAAC) – клик-реакция между напряженными циклическими алкинами и азидами, приводящая к образованию триазолов.
Особое положение SPAAC обусловлено достаточно быстрой кинетикой, отсутствием необходимости использовать токсичные катализаторы, а также уникальными свойствами как органических азидов, так и напряженных циклических алкинов. Так, органические азиды, в отличие от азидного аниона и азидоводородной кислоты, не оказывают токсического действия на биосистемы; азидная группа, в отличие от других диполей, синтетически может быть введена в большое число мономерных предшественников биополимерных молекул и далее в сами биополимеры; введение азидной группы не изменяет биологоческие функции биополимерных молекул. Циклоалкины, в свою очередь, при правильном сочетании стерических, электронных и стереоэлектронных эффектов могут быть чрезвычайно активными в SPAAC и сохранять инертность по отношению к кислороду воздуха и большинству нуклеофильных функциональных групп биосистем.
Для применения SPAAC в биоортогональной биоконъюгации необходимы техники метаболического мечения биополимеров азидными группами, а также широкий круг стабильных циклоалкиновых реагентов. Метаболическое мечение — это введение одной из клик-групп в биополимеры живых систем в результате их роста и жизнедеятельности в присутствии ненатуральных биомономеров, содержащих эти клик-группы. На сегодняшний день разработано большое число таких техник. Что касается второго компонента – циклоалкинового реагента, то кроме стабильности в биосистемах и активности в SPAAC, циклоалкин должен содержать функциональную группу (лучше, если это будет клик-группа, химически ортогональная активированной тройной связи) для введения функции-репортера (например, флуоресцентная метка) или функции-эффектора (низкомолекулярные БАВ, антитела и другие терапевтические биополимеры).
Несмотря на то, что сегодня известно около двух десятков различных типов циклоалкиновых коров, для биохимического применения в основном используется коммерчески-доступные SPAAC реагенты на базе циклооктинов DBCO, BCN, OCT (производители Lumiprobe, Sigma Aldrich, Fisher Scientific, Click Chemistry Tools). Эти SPAAC реагенты имеют стандартные, но не уникальные группы для дополнительной функционализации, что может затруднять реализацию конкретных биологических решений. Кроме этого, данные реагенты дорогостоящие и труднодоступные в условиях изменившихся логистических цепочек. Самостоятельный синтез коммерчески-доступных циклоалкиновых реагентов многостадиен и сложен, а введение дополнительных функций, необходимых для конкретного биологического применения, часто остается в литературе без описания.
Поэтому разработка новых синтетически доступных, стабильных, реакционноспособных в SPAAC циклоалкинов с улучшенными свойствами и дополнительными возможностями функционализации, является чрезвычайно актуальной научной проблемой, решению которой будет посвящен этот проект.
Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб
Главной масштабной задачей проекта будет являться разработка новых циклоалкиновых SPAAC регентов с применением комплексного подхода, основанного на рациональном дизайне органических молекул.
Для решения обозначенной задачи будет разработана общая стратегия, которая состоит из нескольких последовательных этапов. (1) Выбор основных энергетических параметров, которые могут быть рассчитаны и использованы для предсказания баланса стабильность циклоалкинов / реакционная способность циклоалкинов в SPAAC. (2) Определение структурных особенностей и параметров, влияющих на баланс стабильность / активность (стерический фактор, электронные эффекты заместителей, стереоэлектронные эффекты) и выбор целевых структур. (3) Разработка синтетических подходов для получения циклоалкинов, являющихся наиболее перспективными с точки зрения рассчитанных параметров и возможности функционализации. (4) Изучение на практике стабильности и реакционной способности новых циклоалкинов, верификация расчётов. (5) Разработка новых тактик введения функциональных групп в наиболее перспективные циклоалкины. (6) Синтез конъюгатов циклоадкинов с флуоресцентными красителями. (7) Демонстрация возможности применения полученных реагентов для решения конкретных биологических задач.
За основу создания новых SPAAC реагентов будет принято направление, базирующееся на комбинации двух ключевых подходов для регулирования реакционной способности циклоалкинов: 1) «Дестабилизация реагента» за счет аннелирования циклоалкинового кора с гетероциклом/ароматическим циклом, что приводит к искажению валентных алкиновых углов, и, следовательно, приближает циклоалкин к переходному состоянию SPAAC как геометрически, так и энергетически. 2) «Стабилизация переходного состояния» за счет введения к пропаргильному атому С циклоалкинового кора сигма-акцепторного гетероатома, что позволяет снижать барьер SPAAC за счет стереоэлектронных эффектов как в переходном состоянии, так и ввиду большего искажения валентных алкиновых углов в исходных реагентах при меньших энергетических затратах по сравнению с искажениями за счет аннелирования гетероцикла.
Недавно нами было показано, что именно такая комбинация позволяет получать стабильные и реакционноспособные циклононины, которые можно модифицировать функциональными группами и использовать для визуализации метаболически меченых клеток, [19,20] что является заделом для данного проекта и обоснованием возможности его реализации.
Однако данный подход может быть существенно расширен за счет варьирования природы гетероцикла, числа и природы сигма-акцепторов, и использован для создания еще более активных циклоалкинов, функционализированных одной или несколькими дополнительными клик-группами и флуоресцентными красителями.
Именно наличие таких дополнительных функций отличает обычные производные семейства циклоалкинов от SPAAC реагентов. Поэтому для структур с наилучшим балансом стабильность / активность будет отрабатываться тактика введения функциональных групп и методики их модификации. Несмотря на кажущуюся простоту, функционализация циклоалкинового кора не является тривиальной задачей, так как классические методы введения и трансформации функциональных групп часто требуют использования сильных нуклеофильных и электрофильных агентов, кислот и оснований, окислителей и восстановителей, несовместимых с напряженным циклоалкиновым каркасом.
Итоговой задачей проекта будет демонстрация возможности применения новых циклоалкиновых клик-реагентов для визуализации метаболически меченых клеток.
Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел
SPAAC реагенты на основе циклоалкинов относятся к классу производных циклических алкинов среднего размера. Ключевой структурной особенностью циклоалкинов, обуславливающих их реакционную способность, является значительное отклонение валентных алкиновых углов от 180°, что и служит движущей силой SPAAC. Изогнутые алкиновые углы, с другой стороны, определяют повышенный уровень энергии циклического напряжения циклоалкинов, что приводит к их дестабилизации как с кинетической, так и с термодинамической точки зрения. Поэтому для синтеза таких молекул требуются специальные методы. Все синтетические стадии с производными циклоалкинов следует проводить чрезвычайно аккуратно во избежание нежелательных побочных процессов. Учитывая кинетическую нестабильность циклоалкинов, с особенной аккуратностью следует проводить модификацию функциональных групп при циклоалкиновом коре. Поэтому для проекта, связанного с получением новых SPAAC реагентов крайне важен не только богатый синтетический опыт, но и опыт работы с такими необычными соединениями, как напряженные циклические алкины.
Наша научная группа как раз имеет опыт работы с напряженными циклическими алкинами. Так, на протяжении последних 10 лет научные исследования лаборатории были связаны с синтетическими аналогами природных ендииновых антибиотиков, а также с самими циклоалкиновыми SPAAC реагентами.
Ендииновые антибиотики относятся к семейству циклических алкинов, содержащих внутри 10-членного цикла (Z)-гекса-3-ен-1,5-дииновый фрагмент. Ендииновая система напряженного цикла способна подвергаться циклоароматизации по Бергману с образованием 1,4-фенилендирадикалов, что, с одной стороны определяет механизм их противоопухолевого действия, а с другой требует высокой осторожности и аккуратности при получении. В нашей лаборатории был разработан синтетический подход к 10-членным ендиинам, конденсированным с гетероциклами, основанный на электрофил-промотируемой циклизации и реакции Соногаширы для синтеза ключевых ациклических ендиинов с различными функциональными группами и правильно подобранном методе циклизации – реакции Николаса. Реакция Николаса ‒ уникальный метод, основный на алкилировании различных нуклеофильных функциональных группы Co2(CO)6-стабилизированными карбкатионами пропаргильного типа. Кроме стабилизации карбкатионов, Со2(СО)6-фрагмент создает необходимый изгиб валентного алкиновых углов, что сближает взаимодействующие группы в случае внутримолекулярной реакции, а также снижает циклическое напряжение в продуктах реакции.
Опыт в химии ендиинов оказался незаменимым при переходе к поиску новых циклоалкиновых реагентов. Так, в 2021 году нами было найдено новое интересное семейство циклоалкинов ‒ гетероциклоалкины, конденсированные с гетероциклами. Нами была продемонстрирована общность синтетического подхода к таким молекулам, основанного также, как и в случае ендиинов, на последовательности электрофил-промотируемой циклизации, реакциях Соногаширы и замыкании напряжённых циклов по Николасу. Важно, что нам удалось показать применимость нового семейства циклоалкинов для конструирования SPAAC реагентов, то есть получить циклоалкины, модифицированные при помощи флуоресцентных красителей, а также продемонстрировать возможность их практического применения для визуализации метаболичеcки меченых клеток. Кроме этого, нами была обнаружена необычная закономерность между стабильностью и реакционной способностью для гомологов данного класса циклоалкинов. Оказалось, что реакционная способность в SPAAC для достаточно стабильных 9-членных циклов и нестабильных 8-членных циклов близка. Эти необычные свойства циклононинов были объяснены согласованным влиянием стереоэлектронных эффектов как от гетероцикла, так и от гетероатома на стабилизацию переходного состояния SPAAC.
С другой стороны, мы предположили, что нестабильность 8-членных циклов может быть объяснена не только на основании чрезмерного искажения валентных алкиновых углов, но и с использованием теории молекулярных орбиталей. Так, нами был дан совет по поиску новых структур с лучшей кинетикой и большей стабильностью. Для поиска таких молекул до их синтеза необходимо оценивать не только величины энергий циклического напряжения и искажения валентных алкиновых углов, но также и величину HOMO-LUMO зазора. Для получения стабильных молекул величина HOMO-LUMO зазора должна быть максимально увеличена, что в случае гетероциклоалкинов, конденсированных с гетероциклами, может быть достигнуто варьированием природы как гетероцикла, так и гетероатома. Именно это направление планируется развивать в текущем проекте.
В 2023 году мы показали, что два других стабильных циклоалкина IC9O и BT9NTs также могут быть функционализированы. На основании квантово-химических расчётов мы сконструировали флуоресцентные производные циклононина IC9O, которые давали флуоресцентные триазолы. Для этого было необходимо ввести пи-акцепторные заместители в положение С6-изокумаринового цикла, что минимизировало безызлучательную дезактивацию возбужденного S1 состояния изокумарина через электроциклическое раскрытие пиранонового цикла.
Мы также смогли осуществить модификацию бензотиофенового циклононина за счет очень важной и удобной изотиоцианатной группы. Полученный реагент легко взаимодействовал с первичными и вторичными аминами, включая биогенные амины, красители-амины и биотин-амин. Полученные флуоресцентные циклоалкиновые мочевины были использованы для визуализации клеток (работа готовится к публикации, 2023).
Отдельно следует отметить, что студенты и аспиранты, вовлеченные в проект, уже имеют необходимый опыт работы с циклоалкиновой химией. На сегодняшний день по химии циклоалкинов защищаются дипломные работы (руководитель Данилкина Н.А.: Видякина А.А. – диплом магистра, 2022 год, Ким М.Д. – диплом бакалавра, 2023 год, Кутузов Я.А. – планируется защита диплома бакалавра, 2024 год), проходит работа над кандидатской диссертацией (Видякина А.А. , руководитель – Данилкина Н.А.), результаты апробируются на конференциях и, на данный момент, готовятся к печати (материал по BT9N-NCS реагенту). Мы имеем в наличии большой набор реагентов для продолжения данных исследований и прочное научное сотрудничество с биологами, способными протестировать конечные объекты исследования на биологических моделях.
