1. Исследование функций дофаминовой системы.1.1 Исследование D3/DAT-двойных нокаутов.Поскольку гены DAT и D3 расположены в разных хромосомах, мышей, гетерозиготных по соответствующим генам скрестили для получения двойных гетерозиготных мышей, которые в дальнейшем были скрещены для получения 9 генотипов в соответствии с менделевским распределением.Все генотипы оказались жизнеспособными при рождении. Однако мыши, которые были нокаутными по гену DAT (DAT-KO) и гетерозиготными по гену D3 (D3het), демонстрировали настолько активный груминг, что он приводил к серьезным самоповреждениям кожи лап и спины. Масса тела животных DAT-KO была ниже по сравнению с мышами дикого типа. Мыши с двойным нокаутом DATk / D3k также имели меньшую массу тела по сравнению с животными WT и D3k (p <0,001). Другие генотипы не выявили аномалий роста. Мутация в гене D3 не повлияла на температуру тела - и D3-KO, и D3het имели нормальную температуру тела, а также DATh, DATh / D3h и DATk / D3h. DAT-KO имели значительно более низкую температуру тела по сравнению с животными дикого типа (p <0,001). Интересно, что отсутствие рецептора D3 вместе с белком DAT восстановило температуру тела до уровня дикого типа.У животных D3k наблюдалось лишь небольшое увеличение двигательной активности. Между тем, животные D3h значительно увеличили как общее пройденное расстояние, так вертикальную активность по сравнению с животными дикого типа (P <0,05). У животных DAThet не было выраженного изменения двигательной активности, в то время как мыши DAT-KO были заметно гиперактивны (p <0,05). У гетерозиготных животных по обоим генам (DAThet / D3het) двигательная активность была повышена по сравнению с животными DAThet (p <0,05), но не превышала активность животных D3het. Наиболее интересно то, что активность животных DAThet / D3ko была выше по сравнению с животными D3ko и DAThet (p <0,05), что указывает на аддитивные эффекты обеих мутаций в уровне двигательной активности. Оценка стереотипности была выше для всех мутантов по сравнению с животными WT (p <0,05) без значительных различий между мутантными генотипами. Внеклеточный уровень дофамина в стриатуме измеряли с помощью микродиализа «с низкой скоростью перфузии». Внеклеточный уровень DA в стриатуме был в два раза выше у животных D3-KO и D3het по сравнению с животными WT. Внеклеточный уровень DA у животных с DAThet также был повышен вдвое по сравнению с диким животным. У животных, имеющих обе эти мутации, уровень внеклеточного дофамина был еще более повышен - в DATh / D3h и DATh / D3k уровень дофамина был примерно в 4 раза выше, чем у животных WT.1.2 Исследование обучения DAT-нокаутных крыс.Предварительный анализ полученных результатов показал, что DAT-KO крысы обучались выполнению поставленной задачи, но тратили достоверно больше времени на ее решение (p<0.0001) и проходили достоверно большее расстояние при обследовании лабиринта (p<0.0001) по сравнению с крысами WT. Латентный период достижения первого объекта также достоверно различался в большую сторону у DAT-KO крыс по сравнению с WT, но только при обследовании нового объекта (p<0.0001). Интересно отметить, что DAT-KO крысы совершали достоверно меньше ошибок при обследовании новых объектов, чем крысы WT (p<0.01).Во втором блоке экспериментов, после трехмесячного перерыва, и WT, и DAT-KO крысы демонстрировали сохранность ранее выработанного навыка. Количество ошибочных реакций при обследовании новых объектов у крыс WT достоверно снижалось, в то время как у DAT-KO крыс этот показатель оставался на стабильно низком уровне, достоверно не отличаясь от такового при первом тестировании. 1.3 Исследование полового поведения DAT-нокаутных крыс.В первом копулятивном тесте более 80% самцов DAT KO и HET крыс проявляли копулятивное поведение с сексуально рецептивной крысой-самкой, демонстрируя маунтинги и интромиссии. В среднем у 85% самцов крыс DAT KO происходила эякуляция, по сравнению с эякуляцией у 60% самцов крыс HET. Эти значения были выше, чем у крыс WT, поскольку только 50–60% крыс-самцов дикого типа проявляли элементы копулятивного поведения с рецептивной самкой и достигли эякуляции в первом тесте. Процент крыс DAT KO и HET, у которых наблюдались маунтинги, интромиссии и достижение эякуляции, повысился до 100% во втором тесте, тогда как самцы WT достигли такого уровня лишь в третьем тесте.Присутствие недоступной восприимчивой самки крысы и последующее совокупление с ней привело к увеличению внеклеточных концентраций дофамина в диализате NAcc от крыс DAT KO, HET и WT, но со значительными различиями между тремя линиями крыс. Эти различия в основном связаны с различиями, обнаруженными в абсолютных значениях дофамина в диализате трех линий крыс (дофамин у крыс DAT KO> HET> WT), а не с различиями во временных моделях высвобождения дофамина. Концентрации глутаминовой кислоты увеличивались по сравнению с базовыми значениями в диализате NAcc у крыс DAT KO, HET и WT при воздействии на восприимчивую самку крысы. Однако, хотя базальные значения аминокислоты были обнаружены сходными у крыс DAT KO, HET и WT, временная картина высвобождения глутаминовой кислоты значительно различалась у трех линий крыс. Попарные сравнения выявили первое значительное увеличение концентрации глутаминовой кислоты после введения самки крысы в клетку, но только у крыс WT (на 80% выше базовых значений), тогда как более высокое увеличение концентрации у WT, а также у крыс HET был обнаружен во время копуляции, с пиковыми значениями в первые 15 мин для обеих линий (на 154% и 115% выше базальных значений у крыс WT и HET, соответственно). Напротив, хотя у крыс DAT-KO не было обнаружено увеличения концентрации глутаминовой кислоты ни при недоступности самки, ни в первые 30 мин копуляции, повышение концентрации аминокислоты было обнаружено у крыс DAT KO только во второй половине периода копуляции с пиковым значением на 75 мин (на 100% выше базального значения.Исследования также показали, что самцы крыс HET демонстрировали больше NCPE, чем DAT-KO и крысы WT. Крысы HET и, в меньшей степени, DAT-KO показали большее маунтингов (садок) по сравнению с крысами WT. Крысы DAT KO показали больше число эякуляций (например, более высокий EF) по сравнению с крысами WT и, в меньшей степени, крысами HET. Кроме того, между генотипами были выявлены различия в уровнях экспрессии ∆- FosB, синаптофизин, синтаксин-3, BDNF, trkB, PSD-95, PSA-NCAM и Arc в медиальной PFC, в VTA и NAcc. Наиболее значимые различия были обнаружены в основном в mPFC, где более низкая экспрессия почти всех исследованных маркеров, за исключением Arc (экспрессия которого была выше) и PSA-NCAM (более низкие уровни не достигли статистической значимости), была обнаружена у крыс DAT-КО по сравнению с крысами WT, при этом крысы HET демонстрировали промежуточные значения. Различия в экспрессии большинства вышеперечисленных маркеров также были обнаружены в VTA, и NAcc, однако только в нескольких случаях эти различия были в том же направлении, что и различия, обнаруженные в mPFC среди трех линий крыс.Таким образом, сравнивая крыс DAT KO с крысами WT, BDNF был ниже, а trkB выше в VTA, без различий в NAcc; ∆-FosB был выше в VTA, но ниже в NAcc; синаптофизин был ниже в Acc; синтаксин-3 был ниже в VTA и N Acc; PSD-95 был выше в VTA и ниже в N Acc; PSA-NCAM был выше в VTA, но не отличался в N Acc.1.4 Исследование действия хинина на DAT-нокаутных крысах Предварительные данные показали, что в течение первых 20 минут эксперимента у всех крыс DAT-KO наблюдалось достоверное увеличение пройденного расстояния. Анализ последующих временных интервалов показал, что внутрибрюшинное введение хинина вызывало более значительное увеличение расстояния, пройденного животными, по сравнению с последствиями введения NaCl. Достоверные различия наблюдались между группами DAT-KO крыс, получавших хинин и NaCl, причем среди самок различия были более значимыми (two-way ANOVA group factor, F (1, 96) = 45.41, p<0.0001) чем среди самцов (two-way ANOVA group factor, F (1, 96) = 5.32, p<0.05).Мы предполагаем, что низкоафинные внесинаптические транспортеры ОСТ могут частично регулировать внеклеточный DA, поэтому их блокада вследствие инъекции хинина усиливает локомоторную активность у крыс DAT-KO. В присутствии эстрогенов (у самок крыс) эффект блокады ОСТ хинином на астроцитах значительно усиливается, что показано в экспериментах на срезах гиппокампа. Это может объяснить более выраженное влияние хинина на самок крыс DAT-KO. 2.Изучение влияния кардиотонических стероидов (КТС) на дофаминовую систему.Нами был разработан и опубликован простой и надежный способ производства стандартизированных многоразовых канюль. Разработанный метод производства позволяет быстро модифицировать канюли для использования в хронических экспериментах как на мышах, так и на крысах. На первый и второй день эксперимента интравентрикулярная инъекция уабаина вызвала увеличение длины трека в тесте «Открытое поле» в 2 раза (p=0.0002) и в 1.6 раза (p=0.0351) соответственно, по сравнению с контролем. На третий день инъекции поведение мышей, получавших уабаин, достоверно не отличалось от контрольной группы по данному параметру.Анализ активации сигнального каскада в ткани стриатума через 24 часа после третьей инъекции уабаина показал снижение активации Akt в 2,7 раза (p=0,0335). Активация ERK1/2 в группе мышей после инъекции уабаина достоверно не отличалась от контроля. Инкубация нейронной культуры с 30 нМ уабаином в течение 16 часов привела к изменению экспрессии нескольких групп генов, связанных с трансляцией и сборкой рибосом (24), термогенезом (18), болезнью Паркинсона (11), развитием нервной системы (72), регуляцией роста аксонов (19) нейритов в целом (38), регуляцией апоптоза (64), везикулярным транспортом (35), регуляцией МАП-киназной активности (15), изменениями в поведении (28), синаптической пластичностью (21), рибосомальными компонентами (26), белками, характерными для аксонов (40), синаптическими белками (44), белками, характерными для дендритов (31), миелиновой оболочкой (13), белками, связанными с рециркуляцией эндосом (14) и синаптической мембраной (18). Инъекция 1 мкл дигоксина 50 мкМ в желудочки мозга мышей билатерально приводила к увеличению длины трека в 1,7 раза в открытом поле (p=0,0018), время, проведенное животными в центре поля, увеличилось в 1,9 раза (p=0,0049), также в два раза возрастала стереотипия (p=0,0012) по сравнению с контрольной группой (см. рис. 2.2.3). Двустороннее введение 1 мкл буфалина в дозах 10 мкМ, 200 мкМ и 500 мкМ не вызывало достоверных изменений в поведении мышей, инъекция 1 мкл 1 мМ буфалина вызвала значимое снижение двигательной активности (p<0,0001) и эпизоды фризинга.Наблюдаемые поведенческие эффекты инъекции дигоксина сопровождались увеличением активации Akt в 1,5 раза (р=0,0139), увеличением активации ERK1/2 в 1,68 раза (p=0,0327) и уменьшением активации GSK3β в 1,56 раза (p=0,0152) в стриатуме через 30 минут после инъекции по сравнению с контролем. Инъекция 1 мкл буфалина 1мМ привела к увеличению активации ERK1/2 в 2,2 раза (p=0,0182), в то время как уровень фосфорилирования Akt и GSK3β остался неизменным по сравнению с контролем. 3. Использование циклической вольтаметрии in vivo для измерения дофаминовой нейротрансмиссии у крыс Обнаружено статистически значимое увеличение дофаминового ответа в области NАcc в зависимости от амплитуды и частоты тока после электростимуляции VTA как в опытной, так и в контрольной группах (двухфакторный дисперсионный анализ повторных измерений F (4,32) = 9,414 P <0,0001 и (F (6,48) = 11,89 P <0,0001). Однако, более выраженный дофаминовый ответ наблюдался у стрессированных крыс по сравнению с контрольной группой при более высоких амплитудах тока (290 и 330 мкА P < 0,05), но не более низких амплитудах (190, 210 и 250 мкА P> 0,05) (тест множественных сравнений Сидака). Стимуляция на более высоких частотах (40, 50 и 60 Гц P <0,05), в отличие от низких частот (5, 10, 20 и 30 Гц, P> 0,05) вызвала значительно более выраженный 43 (рисунок 2.3.3.) дофаминовый ответ в NAcc подверженных стрессу крыс по сравнению с контрольной группой (тест множественных сравнений Сидака). Последующее ведение раклопрайда привело к статистически значимому увеличению дофаминового ответа в обеих группах (F (1,11) = 5,321 P = 0,0415). Однако, с большим эффектом в контроле, по сравнению с крысами стрессорной группы (P <0,05). Согласно протоколу дофаминового «истощения», обе группы показали одинаково резкое снижение электрически вызванного дофаминового ответа (~ 45% по сравнению с исходным P <0,05). Однако через 40 минут, было обнаружено восстановление исходного уровня дофамина в обоих («стресс» и «контроль») группах.4. Исследование функций серотонина на модели THP2-нокаутных животных Активация оси ГГНС после острого иммобилизационного стресса приводит к высвобождению кортикостерона из надпочечников и последующему ответу во внешних структурах оси, таких как префронтальная кора, через активацию геномного пути ГР. В частности, связывание гормона со своим рецептором вызывает его транслокацию в ядро. Мы проанализировали уровень белка ГР в ядерной и цитозольной фракциях сразу после окончания острого стресса и обнаружили, что после стресса количество рецепторов в ядре увеличилось у крыс TPH2 +/+, в отличие TPH2 –/–. В тотальном гомогенате и в цитозольном компартменте значимых отличий по количеству белка ГР обнаружено не было. Попадая в ядро, ГР связываются со специфическими участками ДНК (GREs – glucocorticoid responsive elements) генов-мишеней ГК, и этому связыванию способствует присутствие кофакторов, таких как MAZ1 и SP1. В тотальном гомогенате наблюдали значительное увеличение количества белка MAZ1 у крыс дикого типа TPH2 +/+, подвергшихся стрессу, по сравнению с нокаутами, подвергшихся стрессу TPH2 –/–. В уровне белка SP1 никаких изменений обнаружено не было. После транслокации в ядро ГР изменяет экспрессию генов, несущих последовательности GRE. Стресс значительно повышает уровень мРНК Dusp1, особенно у крыс TPH2 +/+. Также изменялась экспрессия Gadd45β: стрессовое воздействие вызывало повышение транскрипции не только у крыс TPH2 +/+, но также у животных TPH2 –/–. Однако, повышение экспрессии при стрессе было значительнее у TPH2 +/+ по сравнению с таковым у крыс TPH2 –/–, подвергшихся стрессу. Сходным образом изменялся уровень Nr4a1: экспрессия Nr4a1 была повышена как у TPH2 +/+, так и у TPH2 –/– по сравнению с их контролем. При стрессе у TPH2 +/+ уровень экспрессии Nr4a1 был также выше по сравнению с крысами TPH2 –/–. Уровень мРНК Sgk1, Gilz и Fkbp5, напротив, изменялся только при стрессе: мы наблюдали равное увеличение экспрессии этих генов в обоих генотипах. Помимо всего, стресс также влияет на уровень мРНК P11, вызывая снижение экспрессии в обоих генотипах. Однако, у нокаутов TPH2 –/– уровень мРНК P11 был повышен по сравнению с TPH2 +/+. В экспрессии FoxO1 значимых изменений обнаружено не было.Ранее было показано, что острый стресс может влиять на экспрессию Per1 через воздействие на последовательность GRE. Исходя из роли Per1 в контроле циркадных ритмов, мы измерили экспрессию основных компонентов циркадного ритма. Уровень мРНК Per1 был значительно повышен у крыс TPH2 +/+, подвергшихся стрессу, по сравнению с их исходным контролем. Это увеличение наблюдалось также у крыс TPH2 –/– после иммобилизационного стресса, однако, подобный эффект был более выражен у животных TPH2 +/+. Кроме того, экспрессия Per2 была выше у животных TPH2 –/–, подвергшихся стрессу, по сравнению с TPH2 +/+. Мы не обнаружили никаких изменений в экспрессии Cry1 и Cry2. Аналогично тому, что наблюдалось при экспрессии Per1, уровень мРНК Rev-erbα после стресса был увеличен у животных TPH2 +/+, в то время как у TPH2 –/– крыс никаких изменений не было. Также мы наблюдали повышенную экспрессию Rev-erbβ у TPH2 –/– по сравнению с TPH2 +/+.Представленные результаты показывают, что дефицит серотонина препятствует активации геномного пути ГР в ответ на острый стресс. Показано, что серотонин модулирует транскрипцию циркадных генов, что предполагает изменение циркадных ритмов при стрессе. Примечательно, что серотонин играет ведущую роль в управлении функциями мозга не только на базовом уровне, но и в ситуациях стресса. Ранее было показано, что в отсутствии серотонина у крыс с дефицитом TPH2 изменены механизмы нейропластичности не только в обычных условиях, но и после воздействия острого стресса.Активация оси ГГНС - одна из первых реакций на стресс. Однако, нисходящий путь, который активируется после высвобождения кортикостерона, очень сложен. В частности, после того, как после выделения из надпочечников, кортикостерон попадает в мозг, где действует на рецепторы, широко представленные в клетках. ГР на поверхности клетки обеспечивают быстрый ответ, модулируя высвобождение нейромедиаторов и митохондриальную активность по так называемому негеномному пути; а цитозольные рецепторы интернализуются в ядро, где после связывания с последовательностями GRE начинают контролировать транскрипцию генов-мишеней. Хотя в предыдущих исследованиях было обнаружено, что высвобождение кортикостерона после острого стресса не зависит от уровня серотонина в головном мозге, в данной работе мы продемонстрировали, что интернализация ГР в ядро под воздействием острого стресса происходит только у TPH2 +/+, но не у TPH2 –/– крыс. Это говорит о том, что отсутствие серотонина в головном мозге не влияет на высвобождение гормона из надпочечников, но мешает активации геномного пути на уровне ЦНС. В соответствии с этими данными ранее было продемонстрировано, что модуляция серотонинергической системы хроническим лечением антидепрессантами усиливает транслокацию ГР в ядерный компартмент. Изучая уровень ГР в различных субклеточных компартментах, мы обнаружили, что недостаток серотонина ингибирует стресс-индуцированную транслокацию ГР в ядро. Поскольку прямое влияние центрального серотонина на высвобождение кортикостерона после острого стресса исключено по результатам предыдущих экспериментов, должен существовать другой механизм, связывающий серотонин и функции ГР. Скорее всего, перекрестная связь между этими двумя системами возникает на уровне взаимодействия нижестоящих путей серотониновых рецепторов с фосфорилированием ГР. Ранее было продемонстрировано, что проникновение ГР в ядро облегчается фосфорилированием специфических серинов посредством активации путей MAPKs и CDKs. Поскольку активность MAPK модулируется рецепторами 5-HT2A и 5HT1A, сниженная активация сигналинга рецептора 5-HT в отсутствие лиганда может быть причиной понижения уровня фосфорилирования ГР и его последующей транслокации в ядро при остром стрессе.Фосфорилирование ГР также контролируется сигналингом BDNF. Ранее было продемонстрировано, что крысы TPH2 –/– характеризуются сниженной экспрессией Bdnf после воздействия острого иммобилизационного стресса в течение 1 часа по сравнению с диким типом. Это может привести к снижению фосфорилирования ГР, которое связано с нейротрофинами. Интересно, что GRE характеризуются наличием сайтов связывания, обогащенных GC, на которые нацелены факторы транскрипции, такие как MAZ1 и SP1. Эти факторы транскрипции в непосредственной близости от GREs могут усиливать связывание ГР и таким образом усиливать активацию транскрипции генов-мишеней. Здесь, в соответствии с увеличением количества ГР в ядре, мы наблюдали повышение уровни MAZ1 у животных, подвергнутых стрессу TPH2 +/+, в отличие от небольшого снижения уровня у TPH2 –/– стрессированных животных. Эти данные свидетельствуют о том, что снижение активации геномного пути у TPH2 –/– крыс в ответ на острый вызов может быть вызвано не только отсутствием транслокации ГР как таковым, но также и сниженным уровнем этого кофактора. Уровень SP1, напротив, не изменился после стрессового воздействия. Следовательно, эти два кофактора могут влиять на взаимодействие между ГР со специфическими участками ДНК генов-мишеней ГК. ГР, как ядерный рецептор, действует как регулятор транскрипции, препятствуя транскрипции генов, имеющих GRE в своей регуляторной последовательности. В соответствии с этим недавно было продемонстрировано, что транслокация ГР в ядро сопровождается ап-регуляцией экспрессии генов, содержащих GRE, таких как Gadd45β, Sgk1, Nr4a1 и Dusp1. В данной работе мы показали, что у TPH2 –/– крыс гены с регуляторными последовательностями GRE активируются в меньшей степени по сравнению с диким типом. В частности, уровень мРНК Dusp1 был увеличен у TPH2 +/+, в то время как у TPH2 –/– крыс никаких изменений не наблюдалось. Сходным образом уровень мРНК Gadd45β и Sgk1 был увеличен в обоих генотипах, но у TPH2 +/+ больше, чем у TPH2 –/– крыс. Это предполагает влияние серотонина на их транскрипцию. Несколько исследований показали, что фармакологические или генетические изменения серотонинергической системы могут модулировать их экспрессию. Однако другие гены, чувствительные к глюкокортикоидам, в равной степени были активированы после острого стресса вне зависимости от генотипа. Это может быть связано с другими факторами, которые могут влиять на их экспрессию и могут способствовать стрессовой реакции. Кроме того, нельзя исключать, что отсутствие серотонина может изменять эпигенетический состав некоторых генов, связанных с ГР, через механизм серотонилирования гистонов, и, следовательно, их транскрипцию после острого стресса.Как уже упоминалось, серотонин участвует в контроле различных физиологических функций, и, в частности, циркадная система связана с этим нейромедиатором как анатомически, так и генетически. Кроме того, было продемонстрировано, что циркадные гены могут подвергаться воздействию острого стресса. Интересно, что после острого стресса экспрессия Per1 повышалась у животных дикого типа, но не у TPH2 –/– крыс. Уровень мРНК Per2, напротив, был повышен у TPH2 –/– больше, чем у TPH2 +/+. Этот другой паттерн может быть связан с разной активацией Per1 и Per2 глюкортикоидными рецепторами. Экспрессия Rev-erbα апрегулируется под действием стресса у TPH2 +/+, но не у TPH2 –/– крыс, в то время как экспрессия Rev-erbβ базово повышена у TPH2 –/– крыс, а при стрессе происходит выравнивание уровня в двух генотипах. Поскольку Rev-erb ответственны за правильную петлю обратной связи в часовом механизме, наблюдаемые модуляции могут указывать на изменения циркадного ритма на базальном уровне и обратной связи с активацией циркадных генов после стресса. В целом, наши данные подтверждают участие серотонина в реакции на стресс; отсутствие серотонина в головном мозге влияет на функциональность оси ГГНС в префронтальной коре, модулирующей активацию геномного пути. Снижение уровня серотонина влияет на активность циркадных генов как в обычных условиях, так и в ответ на острый стресс, что позволяет предположить потенциальную связь между серотонином, стрессом и циркадными ритмами5. Изучение молекулярных основ психических расстройств на модели Danio rerio. Благодаря проведению анализа уровня моноаминов в тканях мозга удалось продемонстрировать действие на медиаторы центральной нервной системы рыб ареколина – природного психоактивного алкалоида, обладающего анксиолитической активностью. Повышение уровня норадреналина, серотонина, а также снижение оборота серотонина (выражающееся в виде отношения 5-HIAA/серотонин), среди прочих данных, подтверждают высокую чувствительность рыб зебраданио к ареколину и близким к нему соединениям, что увеличивает уверенность в валидности использования рыб как модели для изучения механизмов влияния препаратов на центральную нервную систему.Влияние вещества на функционирование системы моноаминов также подразумевает возможность разработки анксиолитического препарата на основе молекулы ареколина. Нейрохимический анализ рыб, подвергшихся влиянию методики хронического непредсказуемого стресса, согласовался с аналогичным серотонинергическим ответом при проведении теста у грызунов и при аффективных расстройствах у человека.Интересным наблюдением является факт, что изменение уровня оборота серотонина и его метаболита (5-HIAA) проявляются только со второй недели опытов. Это может говорить о недостаточности более коротких (например, недельных) воздействий на рыб для вызывания патологических изменений, что, безусловно, стоит принимать в расчёт в дальнейшем. Практическая значимость полученных результатов связана с тем, что обобщая имеющиеся данные и дополняя их новыми сведениями можно сделать вывод о том, что рыбы Danio представляют собою хорошую модель для исследования феноменов стресса и функций моноаминергических систем. Несмотря на ограничения и трудности, заключающиеся в необходимости разработки и адаптации специфических методик, в работе с мозгом малого объёма, в эволюционной детерминированности реакций и др., выбор рыб в качестве объекта исследования явно обладает рядом положительных, по сравнению с млекопитающими, свойств. Среди таких, например, увеличение скорости скрининга фармакологических препаратов, большая доступность для ряда манипуляций, возможность получения новой информации о функционировании тех же систем. Результаты исследований закрепляют ценность животной модели рыб Danio, расширяя спектр имеющихся возможностей трансляционных разработок
6. Центр трансгенеза и редактирования генома 6.1. Разработка системы для наработки в E. coli и выделения в препаративных количествах рекомбинантной нуклеазы PguCas13b.Для наработки белка PguCas13b в E. coli мы использовали плазмиду pC0067PguCas13b, несущую ген PguCas13b, слитый с последовательностью, кодирующей 6 гистидинов, и последовательностью SUMO. На первом этапе работы было необходимо подобрать условия, при которых рекомбинантный белок PguCas13b будет, с одной стороны, продуцироваться в достаточно большом количестве, и с другой стороны, будет оставаться в клетках E. coli преимущественно в растворимом состоянии. Мы использовали три разных экспрессионных штамма E. coli:- BL21 (DE3) pLysS – экспрессионный штамм сo строгим контролем продукции рекомбинантного белка за счет плазмиды pLysS, несущей ген Т7 лизоцима.- Rosetta (DE3) pLysS - экспрессионный штамм с дополнительной плазмидой, несущей гены редких тРНК, и со строгим контролем продукции рекомбинантного белка за счет плазмиды pLysS, несущей ген Т7 лизоцима. NiCo21 (DE3) - экспрессионный штамм с минимизированным количеством белков, связывающихся с ионами металлов, для более чистого выделения рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA.Мы провели индукцию экспрессии гена PguCas13b во всех трех штаммах E. coli, наилучшее соотношение по количеству растворимого рекомбинантного белка PguCas13b к общему белку было выявлено для штамма BL21 (DE3) pLysS. Далее мы оценили влияние концентрации индуктора (IPTG), температуры инкубации и времени инкубации на количество растворимого белка PguCas13b в штамме BL21 (DE3) pLysS. В итоге нами было выбрано оптимальное сочетание – 1 мМ IPTG, 37°C, 16 часов, при котором количество растворимого белка было максимальным.Выделение и очистку белка PguCas13b из E. coli проводили с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA, после выделения белок аликвотировали. Одна из аликвот была использована в эксперименте по протеолитическому отщеплению последовательности SUMO от белка PguCas13b. Последовательность SUMO используется для стабилизации и перевода в растворимое состояние рекомбинантного белка в бактериях, после выделения и очистки эту последовательность обычно отщепляют с помощью специфичной SUMO-протеазы. 6.2 Тестирование активности нуклеазы PguCas13b в условиях in vitro Мы проверили влияние наличия последовательности SUMO на стабильность белка PguCas13b в условиях in vitro. Было отмечено, что после отщепления последовательности SUMO эффективность работы рекомбинантного белка уменьшается, что может быть связано с его дестабилизацией в условиях in vitro. Полученные результаты говорят о том, что в условиях in vitro для нуклеазы PguCas13b характерна, помимо специфического расщепления РНК, дополнительная неспецифическая коллатеральная активность, что приводит к деградации РНК (характерный низкомолекулярный «шлейф»). Наличие такой активности позволяет предположить, что использование данной нуклеазы в тестировании на наличие специфических РНК в образце может быть весьма перспективным. 6.3 Оценка специфичности В экспериментах по оценке специфичности мы использовали белок PguCas13b с последовательностью SUMO, поскольку в условиях in vitro такой белок был более стабилен. Мы проанализировали специфичность расщепления РНК мишени при использовании направляющих РНК, несущих однонуклеотидные замены в последовательности, комплементарной РНК мишени. Мы получили направляющие РНК с заменами в 1, 15 и 24 положении и сравнили эффективность расщепления РНК мишени при использовании мутантных направляющих РНК и направляющих РНК дикого типа, полностью комплементарных таргетной последовательности. Однонуклеотидная замена в 15 положении (центральная часть направляющей РНК) приводила к нарушению взаимодействия направляющей РНК и РНК мишени, что в свою очередь блокировало расщепление РНК мишени за счет действия белка PguCas13b. При этом наличие замен в концевых участках направляющей РНК также приводило к отсутствию расщепления РНК мишени. Такая высокая специфичность говорит о том, что белок PguCas13b с последовательностью SUMO может быть успешно использован при создании наборов для детекции однонуклеотидных замен в РНК.Новые технологии, основанные на системах CRISPR/Cas13, мишенью которых является РНК, будут способствовать развитию как исследовательских, так и терапевтических приложений. Выявленная нами 100% специфичность по трем однонуклиодидным заменам в направляющей РНК нуклеазы PguCas13b к РНК мишени открывает широкую перспективу для разработки инструментов подавления транскрипции мРНК (knockdown), тканеспецифичной детекции экспрессии генов и других задач, связанных с направленным редактированием РНК в клетках млекопитающих. Более того, 100% специфичность PguCas13b и высокая коллатеральная активность делает ее идеальным кандидатом для разработки тест-систем для экспресс-диагностики.Полученные результаты дают возможность получить прототип тест-системы для экспресс-диагностики различных вирусных инфекций с использованием PguCas13b. То, что выбранная нами изоформа Cas13 еще не была использована в исследовательских работах, в том числе в тест-системах, дает нам преимущество в возможности как публикации, так и патентования результатов. Потенциальные клинические применения системы CRISPR/ PguCas13b важны для быстрого обнаружения различных нуклеиновых кислот (тест системы для экспрессдиагностики инфекционных заболеваний), а также для лечения генетических заболеваний, связанных с нарушениями сплайсинга мРНК. Каталитически неактивную нуклеазу PguCas13b можно будет использовать в качестве программируемого РНК-связывающего белка для отслеживания транскриптомов в реальном времени. С использованием каталитически неактивной нуклеазы PguCas13b в комплексе с ферментом ADAR можно будет разработать новый вариант системы REPAIR, обладающей значительно более высокой специфичностью, чем ранее описанные платформы редактирования РНК (Cox et al., 2017). Тип редактирования, который комплекс способен совершить, позволяет использовать его как уникальный метод для лечения многих заболеваний через внесение точечных изменений в мРНК транскрипты. 
В этом году было привлечено следующее финансирование из сторонних источников:1) Грант РНФ №19-75-30008 "Разработка инновационных лекарственных средств на основе TAAR рецепторов следовых аминов: 2020 г. этап 2"2) Грант РФФИ №20-315-90077 "Исследование функций TAAR-рецепторов в терморегуляции как возможных мишеней для терапии неотложных состояний в психиатрии, связанных с гипертермией"3) Грант РФФИ №20-34-90099 "Высокопроизводительный скрининг лигандов рецептора следовых аминов TAAR9"4) Договор на НИР с ООО "Аксоникс" на тему "Изучение влияния и/н введения пептидного препарата LCGM на модели шизофрении, индуцированной введением блокатора NMDA рецепторов - МК-801"5) Договор на НИР с ООО "Экселлена" на тему "Поиск химических соединений, обладающих агонистическими и антагонистическими свойствами к TAAR рецепторам следовых аминов, исследования их фармакодинамики и механизма действия" (софинансирование гранта РНФ)6) НИР на тему "Исследование серии органических соединений на антагонистическую активность к TAAR1 рецептору" в партнерстве со Сколковским институтом науки и технологии7) Грант РФФИ №19-14-50566\19 "Клеточная заместительная терапия при болезни Паркинсона – история развития и перспективы использования в клинической практике"8) Договор об оказании услуг с Институтом точной механики и оптики (ИТМО) на тему "Услуги по содержанию лабораторных животных (мышей) в количестве 100 голов в условиях SPF вивария в течение 4 месяцев"