Обьектом исследования является пациент с диагносцированным заболеванием COVID-19 различной степени тяжести. Наша гипотеза: Идентификация фенотипических и генетических факторов, определяющих риски развития цитокинового шторма при COVID-19 поможет прогнозировать риск развития тяжелого течения заболевания и его осложнений. Цель работы: 1. разработать прогностический алгоритм анализа риска развития тяжелого течения COVID -19 , используя комплексную оценку течения заболевания у пациентов с различной степенью тяжести заболевания 2. разработать рекомендации по применению данного алгоритма на этапе диспансерного наблюдения населения с выделением групп риска по тяжелому течению . В ходе выполнения НИР на данном этапе получены следующие научные результаты: 1. проанализированы и получены наиболее прогностически важные биомаркеры , как для диагностики цитокинового шторма , так и для диагностики тяжелого течения COVID-19 у пациентов с цитокиновым штормом , в том числе сформирована шкала оценки риска летального исхода. Данные модели и шкалы проходят процесс оформления РИД 2. Методом сканирующей электронной микроскопии показано появление при цитокиновом шторме аномальных лимфоцитов, увеличение размеров моноцитов. Подобное увеличение характерно для септических повреждений , что дополнительно свидетельствует о том, что цитокиновый шторм развивается по механизмам схожим с сепсисом. Также показано увеличение аберрантных форм эритроцитов , что характерно для гемолитической анемии. 3. при проведении биоинформационного анализа результатов секвенирования клинического экзома пациентов с COVID-19 была выявлена повышенная частота патогенных вариантов в группах госпитализированных больных COVID-19 по сравнению с общей популяцией ( база данных gnomAD- выборка до 141456 человек). Наибольшее количество вариантов найдено в гене муковисцидоза CFTR(20 вариантов); пирина MEFV (средиземноморская семейная лихорадка, 8 вариантов) динеина DNAH5( цилиарная дискинезия; 7 вариантов) альфа -1- антитрипсина SERPINA1(наследственная форма эмфиземы легких ; 5 вариантов). 4. Определен набор из 11 генетических вариантов , демонстрирующих умеренную связь с количественными и номинальными признаками , связанными с тяжестью COVID-19. для трех из этих вариантов удалось найти подтверждающие доказательства об их роли в патогенезе заболевания.
Научный коллектив Городской больницы № 40 совместно с Санкт-Петербургским Государственным Университетом в рамках проекта " Комплексное исследование молекулярно-генетических основ короновирусной инфекции SARS-COV-2 путем анализа генома короновируса COVID-19 и анализа генома ( экзома) пациентов с различной степенью тяжести течения заболевания" решают глобальную проблему для всемирного здравоохранения. Для этого исследователи выполняют научный анализ полученных данных по нескольким направлениям:
1. Выделяют и изучают основные механизмы развития тяжелых форм заболевания. Для этого изучается механизм развития цитокинового шторма, как определяющий развитие пневмонии и тяжелой дыхательной недостаточности у части пациентов. В ходе работы выделены основные клинические и лабораторные факторы прогнозирующие развитие "шторма" и риск смерти у пациентов с уже развившимся цитокиновым штормом. Эти данные позволят врачам диагносцировать ухудшение состояния пациента до развития и/или прогрессирования дыхательной недостаточности.
2. Изучают генетические факторы ( геном и экзом человека) , которые могут у конкретного индивидуума определять предрасположенность к развитию тяжелого течения заболевания. Это позволит разработать рекомендации диспансерного наблюдения по ведению групп риска, персонифицировано подбирая терапию , как на амбулаторном этапе , так и стационарном.
В основе исследования - комплексный анализ особенностей полиморфизма генов и транскриптомных профилей человека с помощью высокопроизводительного полногеномного секвенирования, морфологии клеток , уровней циркулирующих биомаркеров и иных лабораторных с учетом тщательно собранного клинико-инструментального анамнеза. Подобного исследования еще не проводилось в РФ. Данная работа имеет практическое значение и будет способствовать пониманию механизма индивидуального течения болезни и лечения пациента с инфекционным заболеванием.
Результаты научного поиска на данном этапе:
1. На предыдущем этапе нами получена прогностическая шкала , позволяющая прогнозировать развитие цитокинового шторма. Мы продолжили изучение факторов риска цитокинового шторма с определением прогностических биомаркеров на следующей панели: маркеры эндотелиального поражения - растворимая форма лиганда CD 40(sCD40l) , макрофагальный хемокин ( MDC), фракталкин , интерферон гамма индуцируемый белок (IP-10) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). По нашим данным концентрация MDC, sCD40l и IP-10 значительно различались у пациентов с тяжелым течением относительно средне-тяжелого и легкого (p<0,0001) Уровень фракталкина также достоверно отличался у пациентов с цитокиновым штормом и без. В настоящее время формируется модель (деревья решений) позволяющая прогнозировать развитие цитокинового шторма и прогноз заболевания с оформлением РИД
2. Далее мы изучили факторы риска развития тяжелого течения и летального исхода у пациентов с диагносцированным цитокиновым штормом. Наиболее значимыми прогностическими факторами для летального исхода при цитокиновом шторме оказались: отношение нейтрофилов к лимфоцитам на пятый день госпитализации, отношение нейтрофилов к лимфоцитам на третий день госпитализации, оценка по шкале NEWS в динамике, Д-димер в 1-3 день госпитализации, уровень ЛДГ и интерлейкина -6, минимальный уровень лимфоцитов за период с первого по третий день. К лабораторным маркерам с пороговым значением , превышение которых сопряжено с повышенным риском летального исхода, относятся: отношение нейтрофилов к лимфоцитам на пятый день госпитализации >8.1, отношение нейтрофилов к лимфоцитам на третий день госпитализации>7.7, оценка по шкале NEWS > или равно 7 в динамике, Д-димер в 1-3 день госпитализации >3мкг/мл FEU, уровень ЛДГ> 430ЕД/л и интерлейкина -6> 70 пг/мл, минимальный уровень лимфоцитов за период с первого по третий день 0.45-0.87 -10 9/л . Нами выполнена задача с разработкой способа прогноза риска развития летального исхода у пациентов с ЦШ на основе демографических, клинических и лабораторных данных для последующего использования в повседневной врачебной практике. Сравнение предлагаемого способа с другими, известными в медицине , показало его соответствие критериям изобретения. Данный способ сейчас находится в процессе оформления РИД
3. Нами изучены методом низковольтной сканирующей электронной микроскопии- особенности морфологии эритроцитов у пациентов с цитокиновым штормом. Показано появление при цитокиновом шторме аномальных лимфоцитов, увеличение размеров моноцитов. Подобное увеличение характерно для септических повреждений , что дополнительно свидетельствует о том, что цитокиновый шторм развивается по механизмам схожим с сепсисом. Также показано увеличение аберрантных форм эритроцитов , что характерно для гемолитической анемии. Заложены в биобанк пробы эритроцитов, моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, эозинофилов и базофилов, полученные от контрольных доноров и от пациентов с цитокиновым штормом для дальнейшего изучения микроРНК в этих клетках
4. Продолжено исследование генома и экзома методом секвенирования , у пациентов перенесших COVID-19 различной степени тяжести. При проведении биоинформационного анализа результатов секвенирования клинического экзома пациентов с COVID-19 была выявлена повышенная частота патогенных вариантов в группах госпитализированных больных COVID-19 по сравнению с общей популяцией ( база данных gnomAD- выборка до 141456 человек). Наибольшее количество вариантов найдено в гене муковисцидоза CFTR(20 вариантов); пирина MEFV (средиземноморская семейная лихорадка, 8 вариантов) динеина DNAH5( цилиарная дискинезия; 7 вариантов) альфа -1- антитрипсина SERPINA1(наследственная форма эмфиземы легких ; 5 вариантов).Всего мы обнаружили 5 количественных признаков, которые демонстрировали умеренные сигналы ассоциации по всему экзому. К ним относятся уровни С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке, количество лимфоцитов, лейкоцитов и нейтрофилов, а также поражение легких, оцененное с помощью анализа КТ. Всего в 15 вариантах выявлена связь при p<10-4 по выбранным количественным признакам. Только два из идентифицированных вариантов достигли порога значимости для всего экзома при (3.5*10-6) (порог, соответствующий стандартному уровню значимости p<0.05 с поправкой наколичество протестированных вариантов). Этот вариант показал значимыеассоциации как с количеством лейкоцитов, так и с числом нейтрофилов (этотрезультат можно объяснить высокой степенью корреляции между этими признаками).Кластеризация этих вариантов по неравновесному сцеплению (LD) выявила 11 независимыхлокусов (1 — для уровней СРБ в сыворотке; 2 — для количества лимфоцитов,лейкоцитов и нейтрофилов; и 5 — для оценки поражения легких на основе КТ.Четыре из этих замен были расположены в кодирующих последовательностях, а остальные варианты были интронными или другими некодирующими вариантами. Из11 независимых вариантов, выявленных в нашем анализе, 9 соответствовали значимым цис-eQTL согласно данным экспрессии генотипа тканей (GTEx). 4 из этих вариантов соответствовали цис-eQTL, влияющим на экспрессию нескольких генов во многих тканях. Из них 3 варианта оказали наиболее значимое влияние на соседние гены: вариант интрона rs2276638 в гене DNAJB2 оказывал наиболее существенное влияние на экспрессию гена PTPRN в цельной крови по данным GTEx (p-значение = 2x10-27);вариант rs33985936 в SCN11A оказывал наибольшее влияние на экспрессию генаTTC21A в пищеводе; и вариант rs112544 в LZTR1 оказывал наиболее значительное и широкое влияние на экспрессию антисмыслового транскрипта THAP7-AS1. Из оставшихся 5 вариантов со значительным сигналом цис-eQTL 4 оказывали значительное влияние на экспрессию гена, несущего соответствующий вариант, и только 1 влиял на экспрессию соседнего гена. В совокупности эти результаты не позволяют сделать уверенный вывод о том, какой именно ген-мишень влияет нафенотипирование большинства вариантов; однако представляется вероятным, что варианты в ATXN1, PKHD1, SETX, PIEZO1 и CDH23 оказывают прямое влияние на фенотип, изменяя функцию (в случае миссенс-вариантов в ATXN1 и CDH23) или уровни экспрессии соответствующего гена.
На основании анализа клинического и генетического материала, собранного у более чем 1500 пациентов , получены данные :
1. позволяющие прогнозировать тяжесть течения заболевания с пределах госпитализации пациента , выделены основные клиническое и лабораторные показатели, определяющие риск летального исхода у пациента с явлениями цитокинового шторма.
2. получены данные о морфологии элементов крови у пациентов с цитокиновым штормом, объясняющие особенности патогенеза заболевания
3. предварительно выделены генетические факторы и определены их ассоциации с диагностическими признаками , определение которых способно прогнозировать риск развития тяжелого течения инфекционного заболевания у индивидуума
4. Разработанные прогностические модели проходят процедуру оформления РИД
1. Щербак Сергей Григорьевич , ведение НИР и контроль его выполнения , 100% вклад в работу проекта
2. Анисенкова Анна Юрьевна , все разделы проекта , 100% вклад в работу проекта
3.Мосенко Сергей Викторович, все разделы проекта , 100% вклад в работу проекта
4. Апалько Светлана Вячеславовна, все разделы проекта , 100% вклад в работу проекта
5. Кондратов Кирилл Александрович, раздел 2.4, 3.5 66.6% вклад в работу проекта
6. Скитченко Ростислав Константинович разделы 2.3,3.3 66,6% вклад в работу проекта
7. Шиманский Виктор Сергеевич 33,3%
8. Полковникова Ирина Андреевна 33,3%
9. Вологжанин Дмитрий Александрович 33,3%
