Проект посвящен разработке амперометрического сенсора для экспрессного количественного определения Helicobacter Pylori (HP) в биоптате. Рак желудка и толстой кишки являются одними из самых распространенных онкологических заболеваний, причиной которой может быть присутствие бактерии Helicobacter pylori, которая признана экспертами Всемирной Организации Здравоохранения абсолютно доказанным канцерогеном 1 класса. Кроме того бактерия играет решающую роль в развитии Н. рylori -индуцированного гастрита и язвы. Согласно положениям консенсуса Маастрихт V (Флоренция, 2015 г.), посвященным вопросам диагностики и лечения инфекции H. pylori исследование быстрым уреазным тестом для определения наличия инфекции H. pylori рекомендовано для первичной диагностики. Эффективность теста особенно важна для выбора правильной стратегии лечения в будущем, так как согласно рекомендациям после положительного быстрого уреазного теста необходимо назначить лечение, которое будет включать в себя антимикробные препараты. Избыточное назначение антибиотиков и связанный с ним рост антибиотикорезистентности является проблемой. H. pylori была внесена в список приоритетных патогенов для изучения и развития новых антибиотиков. На данный момент существуют коммерчески доступные быстрые уреазные тесты, которые определяют присутствие бактерии по аммиаку качественно, используя в качестве аналитического сигнала изменение цвета кислотно-основного индикатора. Количественное определение аммиака поможет судить о степени обсемененности H. pylori в биоптате и повысить точность диагностики быстрым уреазным тестом. Альтернативными методами количественного определения H. pylori в биоптате являются гистологический метод и определение бактерии методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти методы имеют свои недостатки: не являются экспрессными, а в случае H. pylori важно назначить лечение как можно скорее, дороги в исполнении, требуют специально обученный персонал. Определение количества бактерии гистологическим методом субъективно и сильно зависит от мастерства оператора. Количественная оценка бактерии H. pylori будет производиться по аммиаку, который образуется при расщеплении мочевины характерным для H. pylori ферментом – уреазой. План проекта включает в себя разработку способа определения аммиака, которое предполагается осуществлять с помощью газового сенсора классической конструкции: биоптат|газопроницаемая мембрана|внутренний раствор|электрод, модифицированный солями тяжелых металлов, образующих прочные комплексные соединения с аммиаком: медь, серебро, кадмий и т.д. От растворения во внутреннем растворе соль предохраняется пористой полимерной пленкой, например, Нафионом. Предварительной стадией работы является электрохимическое восстановление соли металла до металла. Аналитическим сигналом служит ток окисления металла с поверхности электрода, при потенциале, отвечающем образованию комплексного соединения иона металла и аммиака. Далее апробация сенсора будет включать себя проверки на модельном биоптате с известной уреазной активностью. Моделирование биоптата будет производиться с использованием полимерной матрицы и растительной уреазы Canavalia ensiformis, активность которой будет определяться по стандарту производителя. Далее будет проведена апробация сенсора на реальных биоптатах. Полученные значения прироста концентрации аммиака будут сопоставлены с данными гистологии и ПЦР, будет определенно значение диагностического критерия для проведения диагностики. Участники проекта Института химии имеют большой опыт исследования новых сенсорных материалов для определения глюкозы и пероксида водорода (в ферментативном и бесферментном вариантах), полученных методами прямого электрохимического синтеза (DENA), методом ионного наслаивания, и лазерно-индуцированного осаждения из раствора. В группе присутствует врач-исследователь, который имеет опыт изучения Helicobacter pylori, принимала участие в разработке, внедрении и совершенствования средств диагностики бактерии, в том числе быстрого уреазного теста. План работы на 1-й год.
В первый год работы планируется провести выбор солей тяжелых металлов для модификации поверхности электрода (печатного графитового электрода), исходя из констант устойчивости комплексов металлов (Cu(I) и (II), Cd(II), Ag(I) и др. ), способы нанесения на поверхность электрода, выбор типа газопроницаемой мембраны и состава внутреннего раствора, установления аналитических характеристик сенсора по отношению к аммиаку на модельных смесях. Результатом проекта станет способ количественного определения бактерии Helicobacter pylori аммиаку с помощью быстрого уреазного теста, будут определены диагностические критерии обнаружения Helicobacter pylori с помощью разработанного способа. Для реализации проекта планируется привлечь средств из внешних источников финансирования на 4 000 000 рублей на весь срок проекта.
Объектом исследования является разработка электрохимического сенсора для определения аммиака, который вырабатывается в биоптате в ходе биохимической реакции разложения карбамида уреазой Helicobacter pylori.
Увеличение информативности быстрого уреазного теста повышением диагностической эффективности и удобства использования, стандартизации процедуры проведения анализа, сокращения влияния человеческого фактора путем автоматизации измерения аммиака, выделяющегося в ходе теста, а также определения гистамина для дополнительной идентификации атрофии, вызванной бактерией амперометрическим сенсором.
1)Результаты соотнесения результата полуколичественных с гистологией и ПЦР
Всего биологический материал был получен от 75 пациентов. В эндоскопической картине преобладал распространенный поверхностный гастрит умеренной степени выраженности 59,6 %. В 19,3 % случаев были выявлены эрозивные поражения слизистой желудка, причем у 3,5 % эрозии были обнаружены также в луковице 12 п. к. Нодулярный антральный гастрит отмечался у 14%, а язва желудка — у 1,8 % . В 100 % случаев воспалительные изменения слизистой желудка сочетались с воспалительными изменениями слизистой оболочки постбульбарных отделов двенадцатиперстной кишки, расцененных нами как проявление поверхностного дуоденита.
Cогласно полученным данным, в большинстве случаев – 69,6 %
инфицированность бактерией H. pylori не обнаружилась, что согласуется с данными
исследований об уровне распространенности хеликобактериоза в России [12] .
Распределение по уровням инфицированности получилось следующее:
биологических образцов, имеющих высокую уреазную активность (Результат по Pronto
Dry 108, результат по Expert «+++») -33,4%, имеющих среднюю уреазную активность
(Результат по Pronto Dry 107-106, результат по Expert «++») -30,3%, имеющих высокую
уреазную активность (Результат по Pronto Dry 105-104, результат по Expert «+») -36,3%.
Таким образом, в изученной популяции встречаются все степени уреазной активности, которые могут быть обнаружены данными БУТ.
Обнаружена корреляция между полуколичественными показателями Expert и
процентным отношением бациллярных форм (r = 0.424, p < 0.05), процентным отношением бактерий на поверхности (r = 0.328, p < 0.05), средним количеством бактерий Н. pylori по Аруину (r = 0.357, p < 0.05. В связи с полученными результатами анализа все параметры, указывающие на степень инфицированности Н. pylori были выражены в виде шкал от 0 до 3 и выведена общая характеристика инфицированности Н. pylori как сумма
баллов всех этих четырех параметров без учета степени вклада каждого из параметров.
Была выявлена заметная корреляция между общей характеристикой инфицированности Н. pylori и полуколичественными показателями Expert (r = 0.479, p<0.05) и Pronto Dry (r = 0.451, p<0.05).
Следовательно, шкалу Pronto Dry можно применять как референтную при
разработке сенсоров на аммиак.
1.2. Соотнесение результатов уреазных тестов и уровней аммиака
Растительная уреаза, полученная из бобов Canavalia ensiformis, широко
используется в качестве модельного вещества при исследовании быстрых уреазных тестов. Для определения диапазона концентраций в котором должен работать электрохимический сенсор была проведена серия экспериментов для определения количества аммиака, соответствующего уреазной активности выделяющегося фермента в соответствии с результатами, полученными в разделе 1. Таким образом, получены количества аммиака в ячейке равные 5,0•10-5; 1,0•10-4; 2,5•10-4;3,75•104
5,0•10-4.
2. Разработка электрохимического сенсора для определения аммиака и гистамина. Подбор модификаторов и условий определения.
Аммиак является ключевым продуктом, выделяющимся в ходе биохимической реакции, а в биоптате представляет несомненный диагностический интерес, поскольку повышение его содержания в слизистой оболочке является предвестником атрофии и рака желудка, что особенно вероятно в присутствии НР. Для определения аммиака и гистамина могут использоваться одинаковые модификаторы, что позволит унифицировать производство сенсоров и повысить информативноть БУТ.
В части разработки сенсора для определение аммиака, выделяющегося в ходе быстрого уреазного теста, были подобраны модификаторы и их концентрации: 1•10-5М раствора CuSO4 и 0,5% раствор полимера в изопропиловом спирте. Эксперименты проводились на модельных растворах с заданной концентрацией аммиака. В дальнейшем предполагается проводить эксперименты в присутствии модельной уреазы.
В части разработки сенсора на гистамин для повышения информативности быстрого уреазного теста так же были подобраны модификаторы, для удобства и унификации сенсоров были подобраны те же вещества, но в других концентрациях: 2•10-3 М раствора CuSO4 и 0,25% полимера ЛФ-4ск. Изученные сенсоры показали высокую чувствительность в модельных растворах гистамина. В дальнейшем планируется провести эксперименты по обнаружению гистамина в модельном биоптате, сформированном в гуаровой камедью
Работа проводилась по двум направлениям:
1) Полуколичественное определение уреазной активности в биологическом
образце с помощью нескольких быстрых уреазных тестов, позволяющих
полуколичественно определить уреазную активность и соотнести ее с морфологической характеристикой биопсийного материала. Получены уровни уреазной активности для формулировки аналитической задачи, осуществлен пересчет получаемых полуколичественных характеристик в единицы уреазной активности бобовых.
2) Разработка амперометрического сенсора и его апробация на модельных
системах путем модификации печатных сенсоров растворами солей меди(II) с последующим нанесением пленок полимера ЛФ-4ск. Сигнал был получен методом циклической вольтамперометрии в растворах с разной концентрацией аммиака, а так же модельной структуре «искусственный биоптат» с заданной концентрацией аммиака. Были подобраны оптимальные параметры модификации печатных сенсоров солями меди(II) для определения аммиака, выделяющегося в ходе реакции, проведено исследование биоптатов полуколичественными уреазными тестами. Для дополнительной информативности БУТ было предложено определять гистамин печатными электродами с модификацией в условиях
аналогичных сенсорам на аммиак.
Ермаков С.С. - руководитель и координатор проекта проекта. 25%
Д.В. Наволоцкая - разработка амперометрических сенсоров и их проверка 22,5%
Н.И. Паролова - проведение исследований на реальных биоптатах 22,5%
Е.О. Коломина - проведение экспериментов, обработка результатов полученных в ходе исследований как лабораторных, так и клинических. 30%
Исследование относится к аналитической химии – разработка принципов детектирования аммиака с помощью химических сенсоров, междисциплинарный подход обоснован объектом исследования – биоптатом слизистой оболочки желудка (СОЖ), полученным в ходе фиброгастродуоденоскопии и целей определения аммиака и гистамина – диагностики инфекции Helicobacter pylori необходимой для правильной постановки диагноза в гастроэнтерологии. Полученные результаты найдут свое применение в медицине. Разрабатываемая методика исследования реальных в случае получения положительных результатов, сможет применяться результаты медицинской диагностике.
| Краткое название | GZ-2021 |
|---|
| Акроним | M3_2021 - 1 |
|---|
| Статус | Завершено |
|---|
| Эффективные даты начала/конца | 22/03/21 → 31/12/21 |
|---|
