Гуманизированные животные, в геном которых интегрированы соответствующие человеческие гены, являются важными инструментами для создания моделей заболеваний человека и для биомедицинских исследований в области иммунологии, онкологии, трансплантологии. Список трансгенных животных, разработанный для тестирования лекарственных средств и выявления патогенетических механизмов широкого спектра заболеваний, продолжает расти.
Традиционно, получение трансгенных животных происходит путем введения плазмидной ДНК - трансгена - в пронуклеус зиготы. Одним из недостатков данного метода является то, что трансген случайно интегрируется в геном реципиента. И, как результат, для оценки «адекватности» созданной модели требуются дополнительные исследования по определению каждого сайта интеграции трансгена, локального воздействия на его экспрессию и потенциального влияния на соседние гены, а в случае их повреждения - проведение дополнительных манипуляций по удалению или восстановлению.
Благодаря открытию локуса «ROSA26» во время исследования сайтов интеграции введенного трансгена β-галактозидазы у мыши, появилась возможность получать животных с постоянным уровнем экспрессии введенного трансгена почти во всех клетках организма. У мышей локус ROSA26 расположен на хромосоме 6 и его транскрипт, несмотря на конституционную экспрессию во всех типах клеток, не транслируется в белок. Таким образом, локус ROSA26 представляет собой идеальный сайт для встраивания чужеродной ДНК, где обеспечивается стабильная экспрессия трансгена и при этом не нарушается функция собственных генов. В настоящее время локус ROSA26 широко используется для создания трансгенных животных.
Традиционно для сайт-специфической вставки трансгена в локус ROSA26 с помощью гомологичной рекомбинации использовали эмбриональные стволовые клетки, но этот процесс стал более эффективным с появлением технологии CRISPR/Cas). К настоящему времени обнаружено множество типов систем CRISPR/Cas, большая часть которых использует нуклеазы Cas в комплексе с направляющими РНК для внесения двухцепочечных разрывов в комплементарной ДНК-мишени (White et al., 2015). В сочетании с системой Cre-loxP появилась возможность получения моделей с тканеспецифичной экспрессией введенных трансгенов. Исследования на животных моделях со вставкой трансгена в локусе ROSA26 предполагают большую точность и воспроизводимость результатов, чем их традиционные трансгенные аналоги. Поэтому разработка и применение сайт-специфической направленной гуманизации генома животных является одним из важных областей развития трансляционной биомедицины и «персонализированной» медицины.
Недавно был обнаружен новый V класс нуклеаз - Сas12 (Cas12а, Сas12b, Cas12f (другое название Cas14a). С началом широкого применения Cas-белков ведется активный поиск новых Cas-белков с улучшенными характеристиками, такими как более высокая активность, специфичность и т.д. Многие нуклеазы Cas12 проявляют коллатеральную неспецифическую нуклеазную активность в клетках прокариот, запускаемую при связывании целевой последовательности. Программируемая природа ферментов Cas12 делает их привлекательной отправной точкой для разработки инструментов генотипирования, поскольку при активации Cas12 производится также неспецифичное расщепление окружающих ssДНК. Если эта ДНК конъюгирована с одной стороны с флуорофором, а с другой стороны с его ингибитором, то расщепление данной ДНК приведет к высвобождению флуорофора и возникновению флуоресценции в растворе. Объектом исследования является CRISPR/Cas технология, применяемая для направленного редактирования генома и генотипирования.
Целью работы является отработка методики сайт-специфической интеграции трансгена в локус ROSA26 эмбрионов мышей с помощью CRISPR/Cas технологии и создание новой системы детекции мутаций в ДНК с использованием новой нуклеазы Cas12а.
В работе были использованы методы эмбриологии, биоинформатики, цитологии, микробиологии, молекулярной биологии, биохимии, флюоресцентной микроскопии. Для наработки нуклеаз Cas12a, Сas12b, Cas12f(Cas14a) были использованы методы бактериальной трансформации, выделения плазмидной ДНК из бактерий, выделения и очистки рекомбинантного белка из E.coli с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе. Для получения линии мышей c геном GFP, интегрированным в локус Rosa26, мы инъецировали смесь направляющей РНК, белка Cas9 и плазмидных конструкций в зиготы, которые подсаживали псевдобеременным самкам-реципиентам. У полученных детенышей выделяли геномную ДНК , после чего целевые фрагменты амплифицировали с помощью ПЦР и их последовательность секвенировали. Для проведения анализа хроматограмм секвенирования использовали программу SYNTHEGO (https://ice.synthego.com). Наряду с этим наличие экспрессии гена GFP у мышей анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Для разработки новой стратегии генотипирования мышей мы использовали методику, основанную на свойстве нуклеазы Сas12a неспецифически расщеплять однонитевую ДНК после взаимодействия с таргетной двунитевой ДНК .
Исследование активности и специфичности РНК-управляемой нуклеазы LbCas12a в условиях in vitro
Ранее было показано, что LbCas12a проявляет различную расщепляющую активность в отношении различных последовательностей PAM. Канонической последовательностью PAM для LbCas12a считается TTTV, но сообщалось о неканонических PAM с пониженной эффективностью, таких как CTTV, TCTV и TTTC. Мы идентифицировали новую последовательность PAM (TTAA) и сравнили активность нуклеазы LbCas12a в присутствии нашей новой последовательности PAM1 (TTAA) с канонической последовательностью PAM2 (TTTA). Мы выбрали каноническую последовательность TTTA PAM, поскольку она соответствует консенсусу 5’ TTTV-3’ PAM. Более того, взаимодействие LbCas12a и TTTA PAM хорошо охарактеризовано в кристаллических структурах.
Мы получили серию crРНК, состоящих из 20-нуклеотидной спейсерной последовательности, комплементарной фрагменту ДНК гена экзонуклеазы 1 (Exo1) Mus musculus. Мы собрали LbCas12a с 20 вариантами crРНК, содержащими одиночные нуклеотидные замены в положениях 1-20 спейсерной области, и использовали этот комплекс в реакции с двумя последовательностями-мишенями, отличающимися только последовательностью PAM: TTAA (PAM1) и ТТТА (PAM2). Для измерения интенсивности расщепления LbCas12a использовали амплифицированные фрагменты двухцепочечной ДНК-мишени (395 п.н. гена Exo1), содержащие последовательности PAM1 и PAM2 соответственно. В качестве положительного контроля образцы содержали crРНК без замен, в качестве отрицательного контроля реакции не содержали crРНК. Для каждой ДНК-мишени реакции проводили в 3 повторностях. Результаты оценивали как эффективность расщепления двухцепочечной ДНК-мишени и неспецифической деградации одноцепочечной ДНК (коллатеральная активность), измеряемую по интенсивности репортерной флуоресценции. По конечной точке измеряли интенсивность флуоресценции после инкубации LbCas12a и направляющими РНК с несовпадением пар оснований в положениях 1-20 и ДНК-мишенью Exo1, содержащей PAM1 или PAM2. Рассчитывали пороговое значение в соответствии с руководством по эксплуатации программного обеспечения Bio-Rad CFX Maestro (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Каждую реакцию проводили с использованием разных вариантов направляющей РНК, несущих одну несовпадающую пару оснований в положениях 1-20 соответственно. В качестве отрицательного контроля образец без crРНК инкубировали в тех же условиях. Зонд содержит направляющую РНК без каких-либо несоответствий. Для анализа интенсивности расщепления ДНК-мишени использовали электрофорез в агарозном геле.
После инкубации LbCas12a с амплифицированным фрагментом ДНК Exo1, содержащим новый PAM TTAA (PAM1), мы наблюдали 100% активность расщепления только для образцов с crРНК без каких-либо несоответствий. Кроме того, мы обнаружили наличие небольшого количества продуктов расщепления в образцах с несовпадением пар оснований в положении 20. В остальных случаях, наоборот, расщепления ДНК не наблюдалось. Побочная активность LbCas12a в образцах, содержащих PAM1, наблюдалась только для направляющей РНК без несоответствия пар оснований, что соответствует результатам электрофореза. Это указывает на высокую специфичность расщепления двухцепочечной ДНК для LbCas12a, которая распознает новый PAM1, хотя и с пониженной эффективностью.
После инкубации LbCas12a с амплифицированным фрагментом ДНК Exo1, который содержит фрагмент канонического PAM TTTA (PAM2), мы наблюдали 100% расщепление в образцах дикого типа и в образцах с несовпадением пар оснований в положениях 1-5 и 18-20. Напротив, в образцах с несовпадениями в положениях 12, 13 и 15 расщепления ДНК вообще не наблюдалось. В остальных образцах с несовпадением пар оснований наблюдалось частичное расщепление с разной интенсивностью. После инкубации с ДНК-мишенью, содержащей PAM2, интенсивность флуоресцентного сигнала соответствовала данным электрофореза, за исключением образцов с несовпадением пар оснований в положениях 17-19. Это может быть связано с тем, что отсутствие комплементарности между crRNA и ДНК-мишенью в этих положениях приводит к ингибированию каталитической активности LbCas12a или ее значительному снижению. Однако мутация, расположенная в дистальной позиции 20 последнего PAM, немного поддерживала каталитически активное состояние нуклеазы. Полученные данные свидетельствуют о более низкой специфичности LbCas12a, распознающего PAM2, хотя и с высокой эффективностью.
Мы исследовали, может ли замена в направляющей РНК различными типами оснований влиять на расщепление LbCas12a ДНК-мишени, содержащей новый PAM1. В ранее описанных экспериментах в результате мутации в положениях 20 и 19 crРНК урацил был заменен на аденин (U20A и U19A). Дополнительно были получены варианты crРНК с заменами урацила на цитозин (U20C) и гуанин (U20G) в положении 20 и в положении 19 (U19C, U19G). Мы выбрали эти две позиции, которые имели разную эффективность переваривания субстрата. В позиции 20 расщепление было эффективным, а в позиции 19 — слабым. В результате нам не удалось выявить каких-либо статистически значимых различий расщепления ДНК между образцами с заменами на основания с аденином, цитозином или гуанином как по 19, так и по 20 положению кРНК. Таким образом, различные типы замен на 3'-конце crРНК не влияли на активность LbCas12a.
Разработка методики эскпресс-генотипирования линии мышей с делецией 2-х нуклеотидов в гене Pde6b.
На первом этапе мы проверили активность LbCas12a на ДНК-мишени, содержащей 2-нуклеотидную делецию и PAM1. Мы получили ДНК-мишень с делецией 2 нуклеотидов из ткани мышей Pde6b-KO, полученную нами в нашей лаборатории с помощью системы CRISPR/Cas9 (данные не опубликованы). Спейсерная область crРНК была подобрана для распознавания двухцепочечной ДНК-мишени Pde6b у мышей дикого типа. Способность LbCas12a обнаруживать делецию оценивали по расщеплению двухцепочечной ДНК с помощью гель-электрофореза и флуоресцентного анализа.
По нашим данным, наличие двухнуклеотидной делеции в исследуемой ДНК-мишени приводит к ингибированию активности LbCas12a, что можно выявить с помощью гель-электрофореза и флуоресцентного анализа. Как видно из представленных результатов, мы наблюдали присутствие продуктов расщепления только в образцах, содержащих ДНК-мишень дикого типа.
Затем мы изучили специфичность побочной активности для LbCas12a, направленного на ДНК-мишень Pde6b, содержащую PAM1, с помощью анализа репортера, меченного флуорофорным гасителем, с использованием репортера одноцепочечной ДНК, меченного FAM, в качестве субстрата. Выявлено, что LbCas12a, направленный на распознавание последовательностей PAM1, проявляет различный уровень активности в зависимости от длины репортерной оцДНК. Значительное увеличение флуоресценции наблюдалось для LbCas12a, направленного на распознавание PAM1 с использованием 12-нуклеотидного репортера. Выбор репортера, несущего флуоресцентную метку FAM, был сделан нами на основании оптимального сочетания флуоресцентный сигнал/шум. Этот репортер может быть использован в последующих тестах, в том числе для оценки минимальной концентрации ДНК-мишени. которые могут быть обнаружены разработанной нами платформой.
Проверка активности белка Cas12b in vitro
Для изучения влияния последовательности PAM на эффективность расщепления ДНК нуклеазой Cas12b, мы оценили результаты расщепления последовательностей с различными PAM (CTTA и TTTA) с помощью электрофореза в агарозном геле. Полученные результаты подтверждают имеющиеся данные о высокой эффективности работы Cas12b с использованием PAM 5’-TTTA-3’, кроме того, показано, что Cas12b способна также распознавать неканоническую последовательность PAM 5’-CTTA-3’, ранее не описанную.
Анализ влияния однонуклеотидных замен на эффективность расщепления целевой последовательности ДНК
Мы оценили влияние однонуклеотидных неспаренностей между crRNA и целевой ДНК на эффективность расщепления ДНК нуклеазой Cas12b при разных последовательностях PAM.
Полученные результаты подтверждают предположение, что специфичность Cas12b к однонуклеотидным неспаренностям в комплексе crRNA-ДНК в целом уменьшается по мере отдаления от PAM. Кроме того, существуют положения, замены в которых хуже распознаются Cas12b вне зависимости от PAM – 9, 11, 17.
Для PAM 5’-TTTA-3’, примерно в половине случаев (положения 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20) происходило разрезание ДНК-мишени, при этом ДНК была деградирована практически со 100%-й эффективностью, как в случае crRNA с заменами, так и в случае crRNA дикого типа.
Для PAM 5’-CTTA-3’ эффективность Cas12b ниже, чем при использовании канонического PAM 5’-TTTA, однако его специфичность повышается – уровень деградации ДНК, сравнимый с диким типом, наблюдался в 5 случаях из 20 (положения 9, 11, 17, 19, 20). В некоторых случаях, неспаренности между crRNA и ДНК не сводили нуклеазную активность Cas12b к нулю, однако, значительно ее снижали – в положениях 14, 15, 16, 18.
Таким образом, можно заключить, что активность расщепления целевой ДНК нуклеазой Cas12b различается в зависимости от последовательности PAM. Cas12b активнее расщепляет целевую ДНК, содержащую PAM 5’-TTTA-3’, по сравнению с PAM 5’-CTTA-3’, но при этом его чувствительность к неспаренностям crRNA-ДНК оказывается ниже.
Анализ коллатеральной активности Cas12b
Приведенные данные по изучению коллатеральной активности в зависимости от положения мутации в crRNA, для PAM 5'-ТTTA-3’, демонстрируют, что наименьшая толерантность к неспаренностям наблюдается для положений с 9 по 20. Однако результаты, полученные в трех повторностях эксперимента, крайне гетерогенны, а активность расщепления флуоресцентной репортерной ДНК при использовании crRNA с однонуклеотидными заменами могла достигать и даже превышать уровень активности для Cas12b в комплексе с crRNA дикого типа.
Данные для PAM 5'-CTTA-3’ позволяют заметить, что эффективность расщепления целевой двунитевой ДНК в целом коррелирует с коллатеральной активностью, так как в положениях, где наблюдался минимальный уровень коллатеральной активности (2-8, 10, 12, 14), не было и целевой нуклеазной активности. Кроме того, рост уровня флуоресценции в этих образцах был ниже по сравнению с теми, где использовали PAM 5’-TTTA-3’, что также говорит о корреляции между целевой и коллатеральной активности. Однако, как и в предыдущем случае, результаты, полученные в трех повторностях, крайне различны, и в некоторых случаях не позволяют различить образец с crRNA с однонуклеотидной заменой от crRNA дикого типа.
Из полученных результатов можно заключить, что активность расщепления репортерной ДНК нуклеазой Cas12b различается в зависимости от последовательности PAM. При использовании PAM 5’-TTTA-3’, наблюдается более высокая коллатеральная активность, чем при использовании PAM 5’-CTTA-3’. Подтверждается, что Cas12b менее толерантен к заменам в более близких к PAM положениях, а также, что существует некоторая корреляция между целевой и коллатеральной активностью белка.
Однако ни в том, ни в другом случае, специфичность нуклеазы не полная, и сильно варьирует. Это дает основание полагать, что подходить к разработке тест-систем на основе коллатеральной активности Cas12b следует с высокой долей осторожности, чтобы избежать возникновения ложноположительных результатов.
Создание линии трансгенных мышей с направленной интеграцией трансгена в локус ROSA26
Для проведения направленной интеграции трансгена GFP в геном мыши мы сконструировали плазмиду, в которой ген GFP находится под промотором гена SV40 и фланкирован последовательностями ROSA26 для проведения гомологичной рекомбинации. Эту конструкцию мы инъецировали в цитоплазму зигот мышей вместе с рибонуклеиновым комплексом направляющей sgRNA к локусу ROSA26 и белка Cas9. В итоге родилось 4 детеныша, у одного из которых наблюдалось флуоресцентное свечение при визуализации с помощью портативной УФ-лампы. Доказательство наличия вставки последовательности GFP также было проведено с помощью ПЦР реакции на геномной ДНК с праймерами, специфичными к последовательностями ДНК.
