Данный проект направлен на отработку методики создания гуманизированных мышей, с помощью CRISPR/Cas направленного введения трансгена в локус Rosa26 эмбрионов мышей. На сегодняшний день в России данная методика не используется. На этом фоне особое значение приобретает быстрая разработка плазмидных конструкций для направленной интеграции гена в локус Rosa26 эмбрионов мышей. Планируется получение конструкции для интеграции в мышиный геном зеленого флуоресцирующего белка, получение эмбрионов мышей, несущих в геноме ген GFP под контролем различных тканеспецифичных промоторов, отработка новой методики генотипирования с использованием нуклеазы Cas14.
Описанные в проекте исследования позволят создать гуманизированные животные модели для изучения различных заболеваний человека, разработки персонализированных терапевтических подходов для их лечения. Также будет разработана новая система детекции мутаций в ДНК с использованием новой нуклеазы Cas14. Разработанный нами прототип тест-системы может быть использован не только для генотипирования, но и в диагностике вирусных инфекций. Данная диагностическая платформа может быть легко масштабирована для внедрения в рутинную клиническую практику.
Для достижения этой цели планируется:
● получение плазмидных конструкций для интеграции гена зеленого светящегося белка в локус ROSA26 с помощью различных механизмов, включающих в себя гомологичную рекомбинацию и слияние двунитевых концов.
● микроинъекции полученных конструкций в мышиные эмбрионы для оценки эффективности выбранной стратегии.
● оценка эффективности интеграции гена GFP в локусе ROSA26 мышиных эмбрионов, с помощью секвенирования амплифицированного фрагмента ДНК, выделенного из бластоцист.
● оценка тканеспецифичности экспрессии гена GFP в эмбрионах мышей.
● разработка системы быстрого генотипирования на основе нуклеазы Cas14
Будут получены данные об эффективности интеграции трансгена GFP в локус Rosa26 эмбрионов мышей. Ожидается, что результаты продемонстрируют эффективность адресного введения трансгенов в геномный локус ROSA26 мышиных эмбрионов с перспективой использования этого метода для создания гуманизированных животных в совместных проектах с НТУ Сириус и другими НИИ. Будет разработана тест система для экспресс- генотипирования мышей, несущих точечные мутации, микроделеции и вставки, с использованием Сas14 нуклеазы.
1. Разработка подходов для направленной интеграции трансгена в локус ROSA26 генома мыши
Для проведения направленной интеграции трансгена GFP в геном мыши мы сконструировали плазмиду, в которой ген GFP находится под промотором гена SV40 и
фланкирован последовательностями ROSA26 для проведения гомологичной рекомбинации. Эту конструкцию мы инъецировали в цитоплазму зигот мышей вместе с
рибонуклеиновым комплексом направляющей sgRNA к локусу ROSA26 и белка Cas9. Всего было проведено 300 микроинъекций, после которых выжило и доросло до стадии
бластоцисты 95 клет
