1. Разработка подходов для направленной интеграции трансгена в локус ROSA26 генома мыши
Для проведения направленной интеграции трансгена GFP в геном мыши мы сконструировали плазмиду, в которой ген GFP находится под промотором гена SV40 и
фланкирован последовательностями ROSA26 для проведения гомологичной рекомбинации. Эту конструкцию мы инъецировали в цитоплазму зигот мышей вместе с
рибонуклеиновым комплексом направляющей sgRNA к локусу ROSA26 и белка Cas9. Всего было проведено 300 микроинъекций, после которых выжило и доросло до стадии
бластоцисты 95 клеток. Мы оценили эффективность вставки трансгена в геном двумя способами: с помощью оценки флуоресценции бластоцист под микроскопом и с помощью
генотипирования наличия вставки с помощью ПЦР. Для генотипирования была использована пара праймеров, один из которых был специфичен к последовательности
локуса ROSA26, а второй – к последовательности гена GFP. Встраивание траснгена произошло в 27 из 95 бластоцист, при этом мы наблюдали корреляцию между наличием в геноме вставки трансгена и флуоресценцией при анализе бластоцист под микроскопом.
2 Наработка и очистка рекомбинантного белка Cas14а
Для наработки белка Cas14а в E.coli мы трансформировали штамм Rosetta плазмидой pLBH531_MBP-Cas14a1, которая несет ген cas14а, слитый с последовательностью, кодирующей 10 гистидинов, и последовательностью MBP (maltose binding protein), кодирующей 387 аминокислот. MBP используется для увеличения растворимости рекомбинантного белка, экспрессируемого в E. coli. Между последовательностью MBP и последовательностью белка Cas14а находится сайт расщепления протеазой TEV. Синтез рекомбинантного белка мы индуцировали добавлением ИПТГ. Наличие белка в бактериальном лизате после индукции показали при помощи белкового электрофореза в ПААГ Для выделения и очистки рекомбинантного белка из E.coli мы использовали металл-аффинную хроматографию на Ni-NTA сефарозе на приборе Bio-Rad NGC. Элюирование белка с колонки проводили с использованием ступенчатого градиента имидазола от 50 до 500 мМ с шагом в 50 мМ После выделения белка мы удаляли MBP и His-tag инкубацией в течение ночи с протеазой TEV. Из растворов до и после протеолиза отбирали аликвоты для оценки качества протеолиза на электрофорезе.
Чтобы удалить MBP и His-tag из раствора, а также избавиться от белка MBP-Cas14a,не прошедшего протеолиз, мы проводили повторную очистку Cas14a на Ni-NTA колонке.
Очищенный белок (см. рис.5) был переведен в буфер для хранения и использован в дальнейших экспериментах.
2.3.3 Тестирование активности нуклеазы Cas14а в условиях in vitro
Мы протестировали способность нуклеазы Cas14a специфически разрезать двунитевую ДНК в условиях in vitro в зависимости от наличиля делеции двух нуклеотидов в области, комплементарной crRNA. В том случае, если область делеции находилась в непосредственной близости от PAM, мы наблюдали отсутствие расщепления дцДНК, тогда как ДНК дикого типа расщеплялась специфично. Мы оценили эффективность расщепления флуоресцентного репортера в зависимости от наличия расщепления целевой дцЛНК.
Наличие расщепления флуоресцентного репортера коррелирует с наличием расщепления целевого фрагмента. Таким образом, данная методика позволяет проводить тестирование коротких делеций за короткий срок без дополнительного секвенирования.