Гликирование белков является естественной неферментативной посттрансляционной модификацией, образующейся в ходе взаимодействия восстанавливающих сахаров или α-дикарбонильных продуктов их распада с аминогруппами лизиновых и гуанидиновыми группами аргининовых остатков. Образуемые относительно нестабильные соединения легко участвуют в меж- и внутримолекулярных перегруппировках, окислении и деградации, приводя к формированию так называемых конечных продуктов глубокого гликирования (advanced glycation end-products - AGEs). Показано, что эта структурно разнообразная группа участвует в развитии таких серьезных метаболических нарушений, как сахарный диабет, болезни Альцгеймера и Паркинсона, и лежит в основе возрастных изменений в тканях млекопитающих.
Недавно было показано, что пищевые продукты растительного происхождения могут повышать уровни гликирования компонентов плазмы при их потреблении млекопитающими. Существует предположение, что этот эффект обусловлен высоким содержанием высокореактивных углеводов и их фосфатных производных в тканях растений. Этот факт согласуется с гораздо более высокими (до десяти раз по сравнению с млекопитающими) уровнями образования AGEs в тканях растений и их возрастным накоплением. Также было выявлено, что экологический стресс приводит к выраженному увеличению скорости образования AGEs в растениях. Позже наша группа продемонстрировала, что накопление определенных классов AGEs напрямую связано с засухой. Принимая во внимание грядущие изменения климата, необходимо должным образом изучить влияние гликирования сельскохозяйственных растений, сопровождающего засуху, на здоровье человека. К сожалению, этот аспект не был должным образом исследован до сих пор.
Таким образом, в данном проекте будут рассматриваться последствия опосредованного засухой гликирования белков растений гороха (P. sativum) - культурного растения, известного высоким содержанием белка в семенах.
В лаборатории Prof. Dr. L. Wessjohan (Leibniz Institute of Plant Biochemistry - IPB, Department of Bioorganic Chemistry) интенсивно изучаются биологические эффекты растительных продуктов. Старение и образование AGEs в растениях находятся в центре внимания отдела: исследования, касающиеся накопления продуктов гликирования в растениях, успешно проводятся в IPB. IPB обладает всеми необходимыми ресурсами для анализа с помощью жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (ЖХ-МС), в отделе биоорганической химии в распоряжении имеется семь масс-спектрометров и более десятка ЖХ-систем. В институте есть все необходимое для работы с растениями (теплицы, фитотроны), выделения белка и твердофазной экстракции.
В результате выполнения этого проекта будет проведена оценка провоспалительных эффектов, связанных с белками семян гороха. Будет определена интенсивность провоспалительной реакции в клеточной культуре в ходе воздействия гидролизатов белка из семян растений гороха, подверженных засухе. Также будет выявлено, компоненты каких сигнальных каскадов вовлечены в наблюдаемый клеточный ответ.
Гликирование белков представляет собой модификацию белков, которая образуется при воздействии таких углеводов как глюкоза, мальтоза. Известно, что гликированные белки стимулируют воспалительный ответ и участвуют в патогенезе различных заболеваний, в том числе осложнений диабета, сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Недавно было показано, что пищевые продукты растительного происхождения могут повышать уровни гликирования белков плазмы крови при их потреблении млекопитающими. Так известно, что старение растений, созревание их семян, действие неблагоприятных абиотических факторов среды, а также хранение и термическая обработка продуктов питания растительного происхождения приводит к образованию гликированных растительных белков.
Таким образом, в данном проекте рассматривались последствия неблагоприятных условий (засухи) на пищевые качества семян гороха.
В рамках данного проекта предполагалось выращивание растений в стандартных условиях с последующим кратковременным воздействием экспериментальной засухи на этапе созревания семян. После выделения белка и полного ферментативного гидролиза проводили оценку в отношении их способности модулировать воспалительный ответ в культуре клеток человека in vitro. Таким образом, мы оценивали качество семян в контексте эффекта на клетки гетеротрофного потребителя семян. Для выполнения этой работы, был выбран сорт гороха SGЕ.
Для получения семян, 300 растений были стратифицированы, пророщены, высажены на вермикулит и инокулированы культурой симбиотической бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM 1026. На 42-ой день растения были перенесены на водную среду, и пять дней спуста на среду, содежащую полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ8000). Поскольку устойчивость зрелых растений гороха данного сорта к осмотическому стрессу, вызванному ПЭГ, была неизвестна, концентрация осмотика была дополнительно оптимизирована. Как было показано, присутствие уже 2.5% (w/v) ПЭГ в среде вызывало закрытие устьиц, в то время как содержание хлорофилла не менялось под действием осмотического стресса. Активность фотосистемы II (PSII) достоверно снижалась только в присутствии 10% (w/v) ПЭГ. Основываясь на этих результатах, мы выбрали наименьшую активную дозу стрессора - 2.5% (w/v) ПЭГ. Осмотический стресс был приложен на этапе формирования последних бобов (на 46-й день), то есть после завершения цветения. Таким образом, моделировалась кратковременная засуха на этапе формирования семян. До приложения стресса растения имели нормальный тургор и цвет, в то время как растения, подвергшиеся действию двухдневной экспериментальной засухи, имели сниженный тургор по сравнению с контрольными. После созревания семян и высыхания бобов, различий во внешнем виде растений и соответствующих семян не наблюдалось.
Анализ физиологического состояния растений, подвергнутых действию кратковременной засухи, показал характерный для данных условий паттерн изменений – все параметры (устьичная проводимость, содержание хлорофилла, активность ФСII, относительное влагосодержание и водный потенциал листа) были статистически достоверно снижены. Таким образом, можно утверждать, что засуха была успешно смоделирована. Анализ биохимических маркеров стресса показал его слабую интенсивность. Несмотря на развитие окислительного стресса, возможности антиоксидантных систем растений не были исчерпаны (что было видно из неизменного уровня восстановленной и окисленной форм аскорбата).
Затем из полученных семян гороха был выделен тотальный белок с помощью фенольной экстракции. После чего, препарат белка был подвергнут глубокому энзиматическому гидролизу в присутствии 0.5 % додецилсульфата натрия (ДДС), необходимого для количественной солюбилизации белков семян гороха. После этого проводили полный энзиматический гидролиз путем последовательной инкубации тотального белка с проназой Е (2 этапа по 24 ч при 37°: на каждом этапе добавляли фермент в расчете 0,8 Е на 1 мг белка), протеиназой К (24 ч при 37° в расчете 0,13 Е на 1 мг белка) и карбоксипептидазой Y, предварительной выделенной из Saccharomyces cerevisiae (24 ч при 25° в расчете 0,11 Е на 1 мг белка). Для контроля прохождения гидролиза проводили электрофорез в ПААГ в присутствии SDS. После этого удаляли SDS методом твердофазной экстракции с помощью картриджей Chromabond С18.
Для изучения возможных эффектов гидролизатов белка, полученных из семян гороха на организм млекопитающих, была оценена активация сигнальных путей PI3K/Akt/mTOR, MAPK/ERK, JAK/STAT и транскрипционного фактора NF-κB, которые могут участвовать в запуске воспалительного ответа. Степень фосфорилирования компонентов сигнальных каскадов, отражающая их активацию, количественно оценивалась с помощью технологии Luminex® xMAP® в культуре клеток нейробластомы человека SH-SY5Y. Основываясь на предыдущих результатах полученных в нашей группе, свидетельствующих о повышении содержания КПГГ в листьях арабидопсиса после воздействия засухи и на известных биологических эффектах КПГГ, ожидалось усиление провоспалительных свойств белков из семян растений, подвергнутых засухе.
Концентрация гидролизатов и время обработки были оптимизированы в серии предварительных экспериментовю Оптимизация показала, что 30 минутная обработка клеток гидролизатами в высоких концентрациях (2.5 и 5 мг/мл) значительно снижает уровень фосфорилирования всех анализируемых компонентов. При этом гидролизаты в концентрации 0.0625-0.25 мг/мл не показали каких-либо статистически значимых различий в клеточном ответе по сравнению с клетками, обработанными культуральной средой. В следующем раунде оптимизации было показано, что более длительное время инкубации (3 часа) приводит к статистически значимому увеличению уровней фосфорилирования NF-kB и IkB в клетках, обработанных белковыми гидролизатами из семян гороха в концентрации 0.5-1 мг/мл, по сравнению с клетками, обработанными культуральной средой.
Таким образом, после обработки SH-SY5Y белковыми гидролизатами семян гороха в течение 3 ч уровень фосфорилирования IkB, TNFR1, ERK 1/2, Akt, JNK, CREB, p38 увеличился по сравнению с клетками, обработанными средой. При этом, гидролизаты из семян растений, подвергнутых засухе, приводят к более низкой реакции фосфорилирования IkB, FADD, IKKa/b, NF-kB, p38, JNK, p70S6K, STAT3, STAT5 по сравнению с гидролизатами из семян контрольных растений.
Таким образом, белковые гидролизаты из семян гороха стимулировали активацию PI3K/Akt/mTOR и MAPK/ERK сигнальных каскадов. Однако гидролизаты белка из семян гороха контрольных растений более реактивны в отношении инициации провоспалительного ответа через эти пути по сравнению с гидролизатами из семян растений, подвергнутых засухе. При этом нельзя однозначно утверждать, что активация сигнальных каскадов была вызвана взаимодействием рецепторов к КПГГ (англ. receptor for advanced glycation end products – RAGE) со своими лигандами. Это согласуется с данными по содержанию КПГГ в семенах растений, подвергнутых засухе, которое не изменялось по сравнению с контролем (эта часть работы не входила в данный проект). Кроме того, мы не наблюдали статистически значимого повышения уровня фосфорилирования транскрипционного фактора NF-kB, что может быть связано с ингибированием NF-kB другими внутримолекулярными взаимодействиями. Более того, наблюдалось снижение активации этого фактора, что можно объяснить увеличением содержания вторичных метаболитов, образующих аддукты с потенциально антиоксидантными свойcтвами, либо с подавлением первичного метаболизма, сопровождающим засуху.
