В результате выполнения данного проекта нами был в основном разработан и предложен мировому научному сообществу новый модельный объект Evo-Devo – известковая губка Leucosolenia variabilis Haeckel, 1870 (подкласс Calcaronea. класс Calcarea), обладающая эволюционно примитивным строением. Разработка этого модельного объекта способствует решению многих фундаментальных вопросов эволюционной морфологии, клеточной биологии и биологии развития животных, что предоставит СПбГУ и МГУ уникальную возможность оказаться на переднем крае этого домена науки.
Нами осуществлен основной и наиболее сложный этап разработки этого нового модельного объекта - адаптация к нему современных методов биологии развития (выделение тотальной РНК, количественный ПЦР с обратной транскрипцией, гибридизация in situ, фармакологические интервенции в работу сигнальных путей, иммуноцитохимия и конфокальная микроскопия). С помощью этих методов мы получили приоритетные фундаментальные результаты, касающиеся клеточных и молекулярных механизмов морфогенетических процессов, лежащих в основе нормального развития и регенерации губок; строения эволюционно примитивных эпителиев, включая структуру межклеточных контактов; впервые был секвенирован транскриптом Leucosolenia variabilis, обладающей эволюционно примитивным асконоидным планом строения и выявлены ортологи генов, вовлеченных у более сложно организованных губок и высших Metazoa в регуляцию развития и регенерации. Эти результаты помогут прояснить такие важные проблемы современной биологии, касающиеся происхождения и эволюции механизмов восстановительных процессов, клеточной дифференцировки, дедифференцировки, трансдифференцировки, а также становления плана строения.
Несмотря на высокое многообразие способов регенерации Leucosolenia, разнообразие морфогенетических механизмов, которые их сопровождают, весьма ограничено. Репаративная регенерация идет по типу морфаллаксиса. В основе этих механизмов, кроме случая восстановления губки из диссоциированных клеток, находятся перегруппировки неповрежденных тканей. Они сопровождаются многочисленными трансдифференцировками хоаноцитов. Основной вклад в образование РМ вносят клетки экзопинакодермы и хоанодермы. Роль клеток мезохила в регенерации остается неуточненной. Морфологические преобразования, происходящие при регенерации, укладываются в рамки понятия эпителиальных морфогенезов, в первую очередь, уплощение и растягивание эпителиев. Клеточными основами этого морфогенеза является изменение конфигурации элементов цитоскелета: актиновых филаментов и системы микротрубочек при распластывании Т-образных и кубических эпителиальных клеток в плоские, а также обратный процесс колумнаризации.
Количественный анализ интенсивности пролиферации при регенерации стенки тела L. variabilis указывает на отсутствие значимого вклада со стороны пролиферации в регенеративные процессы. Блокировка пролиферации клеток (в частности, синтеза ДНК), судя по всему, не оказывает какого-либо влияния на протекания регенерации стенки тела L. variabilis. Это подтверждает наше предположение о морфаллактической природе этого процесса.
Пространственное распределение апоптотирующих клеток в теле губки неравномерно – на всех стадиях они находятся непосредственно на краю раны. В тканях, удаленных от раны, и непосредственно в регенеративной мембране апоптотирующие клетки не были обнаружены ни на одной из изученных стадий регенерации.
Оценка морфологии и динамики клеток интактной стенке тела и клеток регенеративной мембраны, как абсолютная, так и сравнительная, позволяет предполагать, что основной вклад в образование регенеративной мембраны на раневой поверхности вносят клетки эпителиоподобных пластов губки: экзопинакодермы и хоанодермы. Роль клеток мезохила в регенерации пока остается неуточненной, можно предположить транспортную, сигнальную или синтетическую функции. Морфологические преобразования, происходящие при регенерации, укладываются в рамки понятия эпителиальных морфогенезов, в первую очередь, уплощение и растягивание эпителиев. Клеточными основами этого морфогенеза является изменение конфигурации элементов цитоскелета: актиновых филаментов и системы микротрубочек.
Наши исследования указывают на возможную роль Wnt в дифференцировке хоаноцитов, и требует дальнейшего изучения.
Путем секвенирования библиотек кДНК на одной дорожке ячейки типа SP секвенатора NovaSeq6000 (Illumina) было получено 1,097 млрд парно-концевых прочтений длиной 150 п.н. Всего было секвенировано 13 биологических повторностей. Получен транскриптом с BUSCO около 98%, содержащий 58141 открытую рамку считывания размером более 300 нуклеотидов.
Выявление и характеристика генов сигнальных путей Wnt и TGFb, генов зародышевой линии, основных молекулярных компонентов межклеточных контактов и генов, связанных с формированием эпителиев. Были идентифицированы 2 ортолога гена piwi - РНК-хеликазы, отвечающей за сайленсинг транспозонов и принятой в качестве маркера клеток половой линии. Нами были идентифицированы множественные ортологи DEAD-box хеликаз (более 15 белков), среди которых филогенетическими методами были определены 2 ортолога vasa и один ортолог pl10. Нуклеотидные последовательности piwi, vasa, pl10 будут использованы для подбора праймеров и клонирования фрагментов генов, с целью выявления их экспрессии.
Мы идентифицировали в транскриптоме и предсказали доменную организацию белков, участвующих в поляризации клетки, фокусируясь на адгезионных контактах. Было показано наличие ортологов белков Par-3, Par-6, Scribble, CDC42, атипичной протеинкиназы С. Несмотря на отсутствие классических кадгеринов, обеспечивающих адгезионные взаимодействия, обнаружены кадгерин-подобные белки, содержащие большее число кадгериновых повторов, чем Е-кадгерин позвоночных. Размер полипептида примерно втрое превышает размер Е-кадгерина, на С-конце его присутствует консервативный цитоплазматический домен, обеспечивающий за связывание кадгерина с цитоскелетными белками. Кроме того, участок полипептида с 2550 по 2572 а.к. предсказывается алгоритмом TMHMM как трансмембранный участок. В совокупности эти факты позволяют предположить наличие у L. variabilis функционального ортолога кадгеринов, отличающегося более длинным внеклеточным доменом. Таким образом, описаны транскрипты, кодирующие потенциальные ортологи белков, участвующих в формировании межклеточных контактов на разных уровнях – от взаимодействия клетка-клетка за счет внеклеточных доменов, до поляризации клеток за счет организации цитоскелета.
Исследование и анализ паттернов экспрессии ряда генов сигнальных путей Wnt и TGFb в интактных губках.
Изучена дифференциальная экспрессия генов в разных участках тела губки Leucosolenia variabilis путем анализа данных RNA-seq.
Проведена классификация морфогенезов при восстановительных процессах у L. variabilis. Все репаративные процессы, проходящие у животных, традиционно разделяют на: репаративную регенерацию, физиологическую регенерацию и на гипертрофии – компенсаторную и регенерационную. Репаративную регенерацию некоторые авторы подразделяют на регенерацию всего тела (whole body regeneration - WBR), структурную (например, регенерацию конечности), тканевую регенерацию и регенерацию клеток. В свою очередь, WBR можно разделить на (1) регенерацию из фрагмента тела с сохранением исходной полярности, (2) регенерацию из фрагмента тела с полной перестройкой полярностей и (3) восстановление из диссоциированных клеток. Последние два способа восстановления относятся к явлению соматического морфогенеза.
Заключение
В результате данного проекта все планируемые работы и запланированные научные результаты проекта успешно достигнуты. Получены новые фундаментальные знания о морфогенезах и их клеточных источниках, особенностях клеточного поведения и межклеточного взаимодействия при различных формах регенерации нового модельного объекта. Научная значимость полученных результатов состоит в том, что расширены наши знания о механизмах восстановительных процессов у животных. Комплексный анализ восстановительных морфогенезов новой модели позволяет приблизиться к пониманию проблемы происхождения и эволюционного изменения механизмов регенерации. Полученные в ходе выполнения проекта результаты также послужат базисом для дальнейших исследований структуры генетических сетей, вовлеченных в регуляцию регенерационных процессов, а также эволюции генетических регуляторных сетей у животных. Полученные результаты будут использованы для чтения теоретических курсов и проведения практических и лабораторных работ на биологических и медицинских факультетах университетов России.