1. Ассемблирование и аннотирование референсных транскриптомов.
Ассемблированы и проаннотированы референсные транскриптомы с использованием различных типов программ (использованы пакеты программного обеспечения «Trimmomatic», «Trinity», «CD-HIT»). Суммарно в референсные транскриптомы вошло: 286 507 261 пн для Dendrobeania fruticosa, 217 713 864 пн для Terminoflustra membranaceotruncata. Значения BUSCO: C:98.0%[S:42.1%,D:55.9%],F:1.0%,M:1.0%,n:978 для D.fruticosa, C:99.0%[S:33.5%,D:65.5%],F:0.5%,M:0.5%,n:978 для T.membranaceotruncata. Таким образом, нами получены транскриптомы очень высокого качества. Они были использованы при подготовке результатов для статьи «Polyzoa is back: The effect of complete gene sets on the placement of Ectoprocta and Entoprocta» (DOI: 10.1126/sciadv.abo4400). Референсный транскриптом D.fruticosa также использован для анализа дифференциальной экспрессии генов (данные включены в поданную в журнал «Scientific Reports» статью «Putative links between gene activity and morphology of polymorphic zooids in Dendrobeania fruticosa (Bryozoa: Cheilostomata)».
Для Caberea ellisii нами получено 297 534 880 ридов (целая колония, полипиды, аутозооиды, кенозооиды, вибракулярии, суммарные библиотеки «аутозооиды + авикулярии». Дальнейшая обработка данных для Caberea ellisii и Aquiloniella scabra оказалась затруднена по независящим от нас обстоятельствам: в ЦОД РЦ «Вычислительный центр СПбГУ» в течение первой половины 2022 года с практически раз в месяц происходили различные аварии, которые прерывали обработку данных (в общем доступе имеется новостная лента РЦ, ссылка <http://www.cc.spbu.ru/ru/news>), а с 5 августа по 14 декабря все виртуальные машины были недоступны. Выделенная под данный проект виртуальная машина до сих пор недоступна из-за ее нестандартной конфигураци, поскольку начатые 23.12.2022 ремонтные работы продолжаются.
В настоящий момент мы завершаем обработку данных с использованием вычислительных мощностей «compagen.unit.oist.jp» (Япония).
2. Деконтаминирование референсных транскриптомов Dendrobeania fruticosa и Terminoflustra memebranaceotruncata.
На первом этапе мы осуществляли проверку наличия контаминирующих сиквенсов от потенциальных пищевых объектов (или их таксономически близких родственников) мшанок. Созданная база данных включает в себя 9 геномов: Stylonychia lemnae, Oxytricha trifallax, Tetrahymena thermophila, Paramecium tetraurelia, Phaeodactylum tricornutum, Reticulomyxa filosa, Thalassiosira pseudonana, Vitrella brassicaformis. После blast -поиска (blastn, 1e-20) было показано, что контаминация транскриптомов сиквенсами потенциальных пищевых объектов пренебрежимо мала (<2%). Для следующего этапа деконтаминации была создана отдельная база данных на основе хорошо аннотированных последовательностей из БД SwissProt организмов из 13 «групп»: Viruses (taxid 10239), Bacteria (taxid 2), Fungi (taxid 4751), Amoebazoa (taxid 554915), Cryptophycea (taxid 3027), Discoba (taxid 2611352), Haptista (taxid 2608109), Hydrozoa (taxid 6074), Rhodophyta (taxid 2763), SAR (taxid 2698737), Spongia (taxid 6040), Viridiplantae (taxid 33090), Homo sapiens (taxid 9606). Мы проводили blast-поиск при разных пороговых значениях e-value для всех групп (1e-5, 1e-7, 1e-10, 1e-20). По результатам blast-поиска при разных пороговых значениях e-value мы определяли значения, при котором существенного изменения «best hits» не происходило. Так же мы принимали в расчет наличие сильных различий в последовательностях вирусов и прокариот от последовательностей эукариотических организмов. В результате, итоговый blast-поиск проводили при пороговых значениях e-value 1e-5 для вирусов, бактерий и архей, и 1e-20 для всех остальных видов и «групп». Эта стратегия позволила различить потенциально контаминирующие последовательности от консервативных, представленных во всех группах организмов. Все найденные «blast hits» при заданных порогах были удалены. На следующем этапе мы окончательно подтверждали отсутствие выраженной контаминации и присутствие консервативных «тринити-генов» в референсных транскриптомах при помощи скрининговой базы данных, собранной на основе протеомов следующих многоклеточных организмов: Ascaris suum, Branchiostoma florida, Capitella teleta, Clytia hemisphaerica, Crassostrea gigas, Daphnia pulex, Dendronephthya gigantea, Hydra magnipapillata, Lingula ungus, Mizuhopecten yessoensis, Nematostella vectensis, Oxytricha trifallax, Paramecium tetraurelia, Phaeodactylum tricornutum, Pristionchus pacificus, Reticulomyxa filosa, Stentor coeruleus, Stylonychia lemnae, Stylophora pistilata, Tetrahymena thermophila, Thalassiosira oceanica, Tribolium castaneum, Trichoplax adhaerens. Наши ожидания были следующие: если референсные транскриптомы очищены от контаминирующих последовательностей, то среднее число blast-хитов будет приблизительно одинаковым за пределами Lophotrochozoa и значительно выше в пределах Lophotrochozoa. В случае с T.membranaceotruncata, мы обнаружили значительно большее число соответствий между ее референсным предсказанных протеомом и протеомами клитии, гидры и стентора. Соответствующие последовательности были удалены без явного ущерба для референсного транскриптома (показатели BUSCO для протеома, предсказанного с деконтаминированного транскриптома, составили C:95.9%[S:80.6%,D:15.3%],F:1.6%,M:2.5%,n:978). Это единственный случай, потребовавший удаления дополнительных последовательностей на данном этапе.
В конечном итоге, у нас появилась возможность отбирать интересующие нас белок-кодирующие последовательности по специфичности экспрессии в разных типах библиотек/зооидах, доменной архитектуре белков, закодированных в транскриптах, наличию полной/неполной рамки считывания у транскрипта, принадлежности к тому или иному GO-термину. Так же, стал возможен прямой поиск по результатам аннотации (т.е. по названию белкового продукта) и бласт-поиск в ассемблированных транскриптомах.
3. Анализ дифференциальной экспрессии генов.
Столкнувшись с невозможностью проводить анализ данных в ЦОД РЦ «Вычислительный центр СПбГУ» в 2022 г. (см. Задачу 1), мы приняли решение провести анализ дифференциальной экспрессии генов, специфичных для ауто- и гетерозооидов для одного из исследуемых видов D.fruticosa. В связи с меньшим объем данных проведение данного анализа оказалось возможным с использованием обычного ПК.
Данный анализ был проведен с использованием 13 библиотек: целая колония, аутозооиды и кенозооиды (по 3 биологические повторности) и авикулярии (4 повторности). Мы использовали только транскрипты, кодирующие полные рамки считывания (всего 14860 транскриптов). Анализ главных компонент, проведенный с использованием шкалированных логарифмированных ТРМ, продемонстрировал четкую группировку библиотек по типу зооида как по первой, так и по второй компоненте. Вдоль PC1 (объясняющей 34,23% дисперсии) библиотеки аутозооидов и целой колонии сформировали кластер с очень низкими отрицательными нагрузками, в то время как библиотеки авикуляриев и кенозооидов получили очень высокие положительные нагрузки. Вдоль PC2 (14,32%) библиотеки авикуляриев получили самые низкие отрицательные нагрузки, а библиотеки кенозооидов – самые высокие положительные. Библиотеки автозооидов и целой колонии вновь сформировали компактную группу и заняли промежуточное положение.
Нами выявлено всего 1387 диффренциально экспрессирующихся генов (при пороге 1e-5). Библиотеки сформировали два кластера: один включает аутозооидов и целую колонию, а второй – авикулярии и кенозооиды.
Данный вариант кластеризации напрямую связан с особенностями анатомии разных типов зооидов. И авикулярии, и кенозооиды не имеют половых желез и пищеварительной системы и не могут питаться; особенности их строения были детально исследованы нами. Авикулярий является сильно модифицированным аутозооидом, хотя и содержит многие компоненты первого: оперкулюм, отверстие зооида, рудиментарный полипид, щупальцевое влагалище, мышечную систему, ганглий и некоторые другие элементы нервной системы и др. Что касается кенозооидов D. fruticosa, то у них отсутствуют все перечисленные выше структуры, а общими с аутозооидами остаются только два компонента: стенка тела и фуникулярная система.
Наибольшее количество «подавленных» (down-regulated) генов отмечено для пары «авикулярии и кенозооиды» – 833, кроме того, для каждого из типов гетерозооидов характерны уникальные «подавленные» гены: 214 выявлено у кенозооидов и 19 у авикуляриев. Модификация и упрощение строения как авикуляриев, так и кенозооидов хорошо согласуется с набором «подавленных» у них генов (при этом эти же гены имеют повышенный уровень экспрессии у аутозооидов).
Среди «подавленных» генов, общих для авикуляриев и кенозооидов, мы можем выделить несколько групп. (i) Несколько «подавленных» генов у обоих типов гетерозооидов вовлечены в процесс формирования внеклеточного матрикса (ВКМ) и участвуют в клеточной адгезии (например, fibrillin 1, fibronectin, nidogen 2, dentin sialophosphoprotein-like, sushi), что хорошо соотносится с отсутствием ВКМ в их стенке тела. Хотя авикулярии и содержат очень небольшое количество ВКМ вдоль стенки щупальцевого влагалища, тем не менее, его количество на несколько порядков меньше такового в пределах лофофора аутозооидов. (ii) Несколько «подавленных» генов как у кенозооидов, так и у авикуляриев связаны с цилиогенезом, структурой и функцией ресничек (например, trochin, lophotrochin, dynein_axonemal-associated_protein_1-like, dynein_heavy_chain_domain-containing_protein_1-like_isoform_X1, CFAP36, TTC29, AKAP14, LRRC56, C9orf135, C11orf63). Это неудивительно, поскольку кенозооиды полностью лишены ресничных образований, а рудиментарный полипид авикулярия снабжен лишь несколькими сенсорными ресничками. (iii) Несколько «подавленных» генов связаны с нервной системой (например, neurensin, NETO2, hemicentin-2, G-protein coupled receptors) и мускулатурой (HPGDS) – обе системы органов значительно редуцированы у авикуляриев и кенозооидов. (iv) Наконец, и авикулярии, и кенозооиды D. fruticosa лишены гонад и не способны отпочковываться от других зооидов, что хорошо согласуется с большим количеством подавленных генов, ассоциированных с различными аспектами размножения и развития.
Интересно, что для кенозооидов характерно наличие и уникальные «подавленных» генов, связанные с указанными выше морфологическими деталями: ВКМ (laminin_subunit_alpha-1), нервной системой (innexin_unc-9_isoform_X3, G-protein_coupled_receptor_Mth2, F-box/LRR-repeat_protein_fbxl-1_isoform_X2), мускулатурой (unc-15), ресничными образованиями (PPP1R32) и размножением (testis-expressed_protein_45). Несомненно, многие гены DE остаются не охарактеризованными, и дальнейший анализ, основанный на более полных данных, вероятно, выявит многие интересные детали.

Список обогащенных терминов GO, их p-значения и количество генов варьировали в зависимости от типа зооида. Однако есть несколько отчетливых паттернов, которые согласуются с морфологией и биологией D. fruticosa. В дополнение к различным метаболическим процессам мы обнаружили три группы обогащенных терминов GO, общие для всех типов зооидов. В первую группу входят несколько обогащенных терминов GO, связанных с реакцией на стресс. Мы предполагаем, что это может быть результатом содержания колоний мшанок в фильтрованной морской воде без пищи в течение 24 ч перед фиксацией. Отсутствие пищи требует изменений в различных метаболических процессах, включая инициацию использования запасенных питательных веществ и реструктуризацию транспорта питательных веществ по всей колонии. Вторая группа расширенных терминов GO, общая для всех типов образцов, связана с ангиогенезом и миграцией эндотелиальных клеток у модельных организмов. Мы предполагаем, что эти термины GO могут быть связаны с функционированием фуникулярной системы, которая присутствует у всех типов зооидов и отвечает за транспорт питательных веществ.
Третья группа обогащенных GO терминов, отмеченная во всех типах зооидов, связана с регуляцией клеточного старения, пролиферации и миграции. Интересно, что для кенозооидов зафиксирован как самый короткий список, так и самые низкие p-значения. Мы полагаем, что эти результаты хорошо согласуются с морфологией и биологией D. fruticosa. Так, кенозооиды являются единственным типом зооидов, лишенным полипида и, следовательно, повторяющихся циклов дегенерации и регенерации полипида, характерных для аутозооидов. Для авикуляриев ряд исследователей отмечает их возможность дегенерировать, а иногда даже и регенерировать. Однако какие-либо описания обоих процессов отсутствуют, а сведения о продолжительности жизни авикуляриев по отношению к таковой у всей колонии полностью отсутствуют. Важно отметить, что кенозооиды содержат минимум живых тканей (эпидермис и фуникулярную систему), но функционируют на протяжении всей жизни колонии. И, вероятно, дальнейший детальный анализ генов из этой группы терминов GО позволит понять, какие из них отвечают за долголетие, а какие, наоборот, за старение.
Очень многие обогащенные GO термины являются специфичными для аутозооидов. Часть из них ассоциирована с детерминацией пола и гаметогенезом. Это хорошо согласуется с жизненным циклом D. fruticosa. Колонии этого вида имеют продолжительность жизни не менее 3-4 лет, а основной пик выхода личинок приходится на Белое море ранней осенью, с менее обильным нерестом поздней весной (наши наблюдения). Хотя мы собирали пробы в июле, перед сезоном размножения, гаметогенез уже начался, и это хорошо видно на наших суммарных препаратах и срезах. Во-вторых, существует группа обогащенных терминов GО, связанных с антибактериальным иммунитетом. Бактериальные симбионты обнаружены у нескольких видов хейлостомных мшанок, главным образом в фуникулярной системе аутозооидов и у личинок. Однако роль бактериальных симбионтов для мшанок до сих пор неизвестна. У аутозооидов D. fruticosa недавно обнаружены фуникулярные тела, содержащие бактерий. Мы предполагаем, что обогащенные термины GO, связанные с антибактериальной активностью, вероятно, участвуют во взаимодействиях хозяина и симбионта.