Анализ полиморфизма генов PsSym29 и PsNRLK1 у гороха
Число клубеньков и уровень микоризной колонизации корней у бобовых растений контролируется системой авторегуляции (autoregulation of nodulation (AON)). В данной системе важную роль играют пептиды CLE (CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-RELATED), которые синтезируются в корнях при образовании клубеньков и транспортируются в побеговую часть, являясь сигналом о статусе клубенькообразования. В побегах пептиды CLE связываются с рецепторной киназой, гомологичной CLAVATA1 (CLV1) Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., что в дальнейшем приводит к ингибированию дальнейшего клубенькообразования в соответствии с пока неохарактеризованным механизмом.
У люцерны слабоусечённой (Medicago truncatula Gaertn.) киназа, гомологичная CLV1, кодируется геном MtSUNN (Super Numeric Nodules, Medtr4g070970). У гороха соответствующий ген носит название PsSym29. В геноме M. truncatula присутствует не менее 10 генов, гомологичных MtSUNN, среди которых один, Nodulation related LRR kinase 1 (MtNRLK1, Medtr5g090100), повышает свой уровень экспрессии при инокуляции ризобиями.
Полиморфизм генов, вовлечённых в AON, может оказывать влияние на урожай растений гороха, поскольку AON влияет на количество образующихся клубеньков, а это, в свою очередь, связано с количеством фиксированного азота. Для того, чтобы исследовать эту связь, мы изучили полиморфизм гена PsSym29 и его гомолога PsNRLK1, который характеризуется клубенёк-специфичной экспрессией, и провели анализ ассоциаций с параметрами урожайности 99 генотипов гороха, выращенных в условиях инокуляции клубеньковыми бактериями и арбускулярно-микоризными грибами.
Гены PsSym29 (Psat7g183240) и PsNRLK1 (Psat2g019520) состоят из двух экзонов, разделённых интроном, и кодируют белки с 20 доменами LRR (leucine rich repeat), трансмембранный домен и киназный домен. Белки PsSym29 и PsNRLK1 сходны на 57.6% по параметру «similarity» и на 44.1 % по параметру «identity». В соответствии с данными экспрессионного атласа гороха (Alves-Carvalho et al., 2015), максимальный уровень экспрессии PsSym29 наблюдается в листьях и усиках, а максимальный уровень экспрессии PsNRLK1 – в клубеньках.
В ходе работы кодирующие участки генов PsSym29 и PsNRLK1 были секвенированы на ДНК 99 генотипов гороха из коллекции ВИР, которые различаются по месту происхождения и таким образом представляют разнообразие вида горох посевной. На основании анализа полиморфизма были определены значения нуклеотидного разнообразия (π) для каждого из генов. Ген PsNRLK1 продемонстрировал более высокое нуклеотидное разнообразие, чем PsSym29. Нуклеотидное разнообразие, рассчитанное для синонимичных замен (πs) оказалось сопоставимым для обоих генов, но нуклеотидное разнообразие, рассчитанное для несинонимичных замен (πa), оказалось выше для PsNRLK1. Соотношение πa / πs также выше для PsNRLK1, чем для PsSym29, что отражает более сильное давление очищающего отбора, действующего на последовательность гена PsSym29. У M. truncatula, мутации в гене MtSUNN (ортологичном PsSym29) приводят к фенотипу суперклубенькообразования, а мутации в гене MtNRLK1 не влияют на фенотип клубенькообразования, что также указывает на более высокую важность MtSUNN для растений люцерны по сравнению с геном MtNRLK1.
С целью выявления специфических районов генов, которые могут содержать свидетельства давления отбора, был проведён анализ полиморфизма генов PsSym29 и PsNRLK1 методом «скользящего окна». Были определены значения нуклеотидного разнообразия (π) и критериев D Таджимы и H Фэя и Ву. Значение π для последовательности PsNRLK1 значительно увеличивается в интронной части гена 9что указывает на то, что интрон этого гена весьма полиморфен), в то же время значение π для гена PsSym29 одинаково в экзонах и в интроне. Значения критерия Таджимы D для полных последовательностей генов (0.023 для PsSym29 и -0,607 для PsNRLK1), а также определённые в «скользящем окне» размером 100 п.н., не указывает на какие-либо отклонения от модели нейтральной эволюции. В то же время, анализ критерия H Фэя и Ву позволил выявить признаки позитивного отбора в одном сайте гена PsSym29 и в трёх сайтах гена PsNRLK1. Таким образом, результаты анализа показывают, что гены PsSym29 и PsNRLK1 эволюционируют в настоящее время, и их новые аллели, возникшие относительно недавно в эволюционном смысле, замещают старые аллельные варианты. Выявленные полиморфные сайты с несинонимичными заменами находятся в первых экзонах генов, которые кодируют рецепторные домены белков, что указывает на возможность того, что рецепторы, кодируемые разными аллельными состояниями генов, могут иметь различную аффинность к своим лигандам (пептидам CLE).
В работе были выявлены несинонимичные замены в последовательностях генов (8 для PsSym29 и 20 для PsNRLK1). Анализ ассоциаций был проведён после исключения из рассмотрения редких аллельных вариантов (для шести сайтов в PsSym29 и семи в PsNRLK1). Согласно предсказанию, выполненному в программе SIFT, все аминокислотные замены, соответствующие выявленным полиморфным сайтам, не являются критичными для функционирования белка. В результате анализа не было выявлено статистически значимой ассоциации полиморфных сайтов с параметрами роста и урожайности растений 99 генотипов гороха, выращенных в условиях инокуляции клубеньковыми бактериями и грибами арбускулярной микоризы. Также не было выявлено влияния полиморфных сайтов на прибавки, вызванные действием грибов АМ.

Секвенирование генома мутанта гороха по гену fas, предположительно кодирующему компонент системы CLAVATA
Для выполнения данной задачи были выращены растения гороха посевного линии Штамбовый (несущей мутацию в гене fas). Из листьев одного растения были выделены ядра, а затем из полученных ядер была выделена ДНК (с использованием модифицированного СТАB-метода. Качественный и количественный анализ выделенной геномной ДНК был проведен с использованием системы NanoDrop OneC (Thermo Scientific). В результате проведенного выделения конечная концентрация ядерной ДНК составила 231 нг/мкл. Секвенирование геномной ДНК мутантного генотипа Штамбовый с использованием системы секвенирования нового поколения Illumina NovaSeq 6000 (две дорожки, ячейка SP, 2 x 150 нт).
В результате было получено 601 557 150 пар ридов для сорта Штамбовый (~ 1.2 миллиарда), прошедших контроль качество системой Illumina. Дополнительно анализ качества оценили в программе FASTQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), которая также подтвердила высокое качество секвенирования. После фильтрации ридов на предмет возможных технических последовательностей и удаления участков с низкой достоверностью при помощи программы Trimmomatic (http://usadellab.org/), риды картировали на геном гороха линии Cameor (https://doi.org/10.1111/tpj.13070) с использованием алайнера bowtie2 https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2). Общий уровень совпадений при картировании ридов для генотипа Штамбовый составил 93.1%. Выявление нуклеотидных вариантов в геноме анализируемого генотипа сортов, включая небольшие делеции и инсерции (менее 10 по), провели с использованием программы GATK (https://gatk.broadinstitute.org/).
Приблизительная локализация гена fas известна. В ходе анализе генома генотипа Штамбовый был изучен регион, фланкированный генетическими маркерами Pepcn и PK4, отдаленным друг на друга на расстояние 44.9 сМ. Данный регион содержит локус FAS и соответствуют участку от 474115077 нуклеотида до 547001760 нуклеотида 5-ой хромосомы гороха (III группа сцепления). В данном регионе было детектировано 54 нуклеотидных варианта в участках хромосомы, соответствующих аннотированным генам. Для одного гена Psat5g277640 (транскрипционный фактор семейства NAC) было обнаружено, что четыре варианта приводят к аминокислотной замене в белке: 541653901_A/G, 541654040_T/A, 541654052_C/T и 541654102_G/A.
Проделанная работа является заделом для идентификации молекулярной природы гена fas у гороха посевного. В дальнейшей работе необходимо провести более точное картирование гена fas в геноме гороха, а также секвенировать геном родительского сорта Немчиновский для поиска мутации, являющейся причиной мутантного фенотипа fas.

Анализ транскриптома мутанта гороха по гену fas в условиях образования симбиоза с клубеньковыми бактериями и при обработке нитратом
Эффект от действия нитрата калия на клубенькообразование гороха «дикого типа» сорта Немчиновский и мутанта по гену fas Штамбовый оценили в вегетационном эксперименте. Растения были выращены в сосудах с песком и при посадке были инокулированы штаммом клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM1026. Один раз в неделю растения поливали питательным раствором, который содержал KNO3 в концентрации 15 ммоль/л в варианте «обработка нитратом» и не содержал KNO3 в варианте «контроль». Через 4 недели после посадки растения были извлечены из субстрата, для них было оценено число клубеньков, и одновременно корневые системы трёх растений из одного сосуда (одна биологическая повторность) были зафиксированы замораживанием в жидком азоте для последующего выделения РНК и транскриптомного анализа.
Было проведено статистическое сравнение числа клубеньков, образованных мутантным генотипом Штамбовый и генотипом «дикого типа» Немчиновский (рисунок 24). Для статистического анализа влияния фактора генотипа и фактора доступного азота на число клубеньков использовали двухфакторный дисперсионный анализ с последующим проведением пост-хок тестов на значимость факторов. Анализ показал, что сорт Штамбовый образует примерно на 20% меньше клубеньков (t=-5.602, Pr(>|t|)=1.51e-07) по сравнению с Немчиновским. Присутствие доступного азота в субстрате ингибирует клубенькообразование примерно на 30% для обоих сортов (T=-9.134, Pr(>|t|)=3.08e-15). Значимого взаимодействия двух факторов не выявлено. Без учета взаимодействия факторов значение F3,112=38.18, что соответствует p-value= 2.2e-16. Таким образом, можно сделать вывод, что мутация в гене fas негативно влияет на клубенькообразование, и при этом не оказывает влияния на ответ растения на повышенное содержание нитрата в субстрате.
Корневые системы, содержащие клубеньки, были гомогенизированы в замороженном виде на шаровой мельнице, и из полученного материала была выделена РНК и использована для приготовления библиотек для секвенирования по протоколу МАСЕ. Библиотеки были секвенированы на приборе Illumina NovaSeq6000 в компании «Евроген» (Москва, Россия). Анализ данных секвенирования методом главных компонент продемонстрировал преобладание влияния на экспрессию генов мутации и в меньшей степени влияние KNO3.
При этом сорт Штамбовый демонстрирует более яркий ответ на воздействие KNO3: 979 генов с дифференциально повышенной экспрессией против 237 у Немчиновского. Можно заключить, что генотипы являются контрастными по ответу на воздействие KNO3, особенно по генам с повышающейся экспрессией.
Анализ дифференциально экспрессирующихся генов методом теста на обогащение в терминах Gene ontology показал высокую степень различий в группах генов, отвечающих на воздействие KNO3 у исследуемых генотипов. Наибольший контраст генотипы проявляют в различных биологических процессах, связанных с метаболизмом азота (эти процессы активируются только у Штамбового): «ответ на азотные соединения», «транспорт нитратов», «клеточный ответ на реактивные формы азота», «ответ на оксид азота», «транспорт нитрита». Кроме того, большие различия наблюдаются в процессах трансмембранного и ионного транспорта, клеточного ответа на гормональные стимулы, процессах гомеостаза, биогенеза клеточной стенки, ответом на осмотический стресс. Примечательно, что процессы, связанные с ответом на гиббереллин и биосинтез флавоноидов активируются только у Немчиновского.
Более того, у Штамбового наблюдается понижение экспрессии генов, связанных с биосинтезом флавоноидов, ряда симбиотических генов и генов реакции сверхчувствительности.
Дополнительно мы изучили экспрессию известных sym-генов у исследуемых генотипов. В ходе анализа были выявлены гены, уровень экспрессии которых различается у двух генотипов. Это, в частности, гены, кодирующие уриказу, нодулин-25, флотиллин-подобный белок-4, лигаза LIN-1, нодулин-13, ранний нодулин-12А и ранний нодулин-75.
Различия между генотипами также выявлены в уровнях экспрессии генов, кодирующих NCR-пептиды. В частности, у Штамбового под воздействием нитрата наблюдается подавление экспрессии у 310 генов, кодирующих NCR-пептиды, в то время как у Немчиновского экспрессия снижена лишь у 117 NCR-генов.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что мутация в гене fas негативно влияет на клубенькообразование, и в соответствии с этим экспрессия некоторых симбиотических генов у мутанта снижена. Примечательно, что экспрессия ключевого транскрипционного фактора NF-YA2 снижена у мутантной линии независимо от наличия или отсутствия нитрата в среде. Вероятно, ген FAS в норме является позитивным регулятором данного транскрипционного фактора. Тот факт, что Штамбовый более активно реагирует на внесение нитрата посредством изменения экспрессии генов может также свидетельствовать о том, что ген FAS в норме может быть негативным регулятором ответа растений на экзогенный нитрат.

Оценка уровня азотсодержащих соединений у растений со сверхэкспрессией гена MtCLE35
В ходе первого этапа реализации проекта нами было показано, что ген MtCLE35 является нитрат-активируемым системным ингибитором развития симбиотических клубеньков у люцерны. Экспрессия этого гена активируется как при обработке нитратом, так и при развитии симбиотических клубеньков, а усиление его работы в трансгенных корнях за счет сверхэкспрессии приводило к практически полному подавлению развития симбиотических клубеньков (Lebedeva et al., 2020). Мы предположили, что нитрат-активируемый ген MtCLE35 может быть задействован не только в контроле развития симбиотических клубеньков, но и в других нитрат-регулируемых процессах, в частности, процессах накопления азота в растениях. Для проверки этого предположения мы провели метаболомный анализ корней и побегов растений люцерны дикого типа (линия R108) и трансгенных растений люцерны со сверхэкспрессией гена MtCLE35 (содержат ген MtCLE35 под контролем конститутивного промотора 35S (p35S::MtCLE35)). В работу были взяты трансгенные растения люцерны поколения T1 – потомки двух растений поколения T0 (семьи CLE35oe-2 и CLE35oe-3), по четыре растения из каждой семьи. Растения выращивали в течение двух недель в аэропонной установке, после чего корни и побеги растений замораживали по отдельности до последующего анализа. Из замороженного растительного материала часть (100 мг) использовали для выделения РНК для оценки уровня экспрессии гена MtCLE35, и часть материала (200 мг) брали для оценки содержания метаболитов.
Для подтверждения того, что у трансгенных растений из семей CLE35oe-2 и CLE35oe-3, взятых в анализ, наблюдается сверхэкспрессия гена MtCLE35, мы провели оценку уровня экспрессии это гена в побеге с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Мы показали, что у всех растений из семей CLE35oe-2 и CLE35oe-3 уровень экспрессии гена MtCLE35 в 600-1400 раз превышает уровень его экспрессии у контрольных растений (исходная линия R108, дикий тип), что свидетельствует об эффективности работы конструкции, обуславливающей сверхэкспрессию (p35S::MtCLE35).
На следующем этапе проводили анализ содержания метаболитов в образцах корня и побега у растений со сверхэкспрессией гена MtCLE35 и у растений дикого типа. Были построены тепловые карты, иллюстрирующие содержание аминокислот и других азотсодержащих соединений в корнях и побегах растений дикого типа (R108) и растений двух семей со сверхэкспрессией MtCLE35 (CLE35-OE-2 и CLE35-OE-3). Можно отметить, что у растений обеих семей трансгенных растений наблюдается снижение уровня азотсодержащих соединений в побеге, по сравнению с линией R108. При этом в корнях, у растений со сверхэкспрессией MtCLE35, в особенности у растений семьи CLE35-OE-3, можно отметить повышенные уровни аминокислот и других азотсодержащих соединений (2-гидроксипиридина, первичных аминов, таких как этаноламин, фосфоэтаноламина), по сравнению с растениями дикого типа R108.
Кроме того, данные по содержанию метаболитов в образцах были проанализированы с помощью дискриминантного анализа методом OPLS-DA (Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, дискриминантный ортогональный анализ методом частных наименьших квадратов). Статистическая модель OPLS-DA выявила отклонения в распределении пула аминокислот и сахаров между корнем и побегом у растений со сверхэкспрессией гена MtCLE35, по сравнению с растениями дикого типа линии R108.
Анализ обогащения выявленных наборов метаболитов (MSEA, Metabolite Set Enrichment Analysis) показал, что у растений CLE35-OE содержание аминокислот увеличено в корнях, но снижено в побеге, по сравнению с линий дикого типа R108. При этом распределение сложных сахаров, пентоз и гексоз демонстрирует обратную картину: их количество снижено в корнях у растений CLE35-OE и увеличено в побеге, по сравнению с линией R108.
Таким образом, результаты метаболомного анализа показали, что сверхэкспрессия гена MtCLE35 приводит к общему увеличению содержания аминокислот и других азотсодержащих соединений в корнях, что может быть обусловлено усилением процессов поглощения азота и синтеза аминокислот. При этом наблюдаемое снижение уровня аминокислот в побеге у растений CLE35-OE, по сравнению с линий дикого типа R108, связано, вероятно, с нарушением транспорта аминокислот из корней в побег, который, как можно предположить на основании полученных нами данных, контролируется регуляторными путями, активируемыми MtCLE35. Результаты нашей работы расширяют представления о роли гена MtCLE35 у люцерны и указывают на его возможное участие в контроле процессов поглощения азота и синтеза аминокислот в корнях, в также в регуляции транспорта аминокислот из корней в побег.