Научная проблема, на решение которой направлен проект
Среди различных аспектов изучения феномена колониальности особый интерес вызывает проблема интеграции колоний. При анализе степени интеграции колоний значительное внимание привлекают морфологические и физиологические аспекты транспорта питательных веществ в пределах колонии, особенно у представителей, характеризующихся полиморфными колониями – т.е., включающих зооиды, отличающиеся по строению и выполняемым функциям. В большинстве случаев такие зооиды не способны питаться, и функционируют за счет поступления питательных веществ от других зооидов в колонии.
Научная проблема, на решение которой направлен предлагаемый проект, может быть сформулирована следующим образом: специфика организации и функционирования интегрирующей транспортной системы в полиморфных колониях с высокой степенью морфологической индивидуальности зооидов.
Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы
Колониальность широко распространена в разных филогенетических ветвях Metazoa, и ее изучение имеет длительную историю. Среди колониальных организмов наибольший интерес вызывают те представители, которые демонстрируют явление полиморфизма – в составе таких колоний присутствуют зооиды, отличающиеся по строению и выполняемым функциям. Данная особенность характерна для книдарий, мшанок и долиолид. В большинстве случаев полиморфные зооиды не способны питаться, и функционируют за счет питательных веществ, получаемых от питающихся зооидов колонии. Подобная специализация зооидов требует наличия эффективной общеколониальной транспортной системы.
Колониальные животные относятся к разным уровням организации и, соответственно, обладают разными морфологическими структурами, которые обеспечивают выполнение распределительной функции. Возможность задействовать те или иные конструкции для осуществления транспортной функции в пределах колонии напрямую определяется степенью морфологической изоляции зооидов, которая отличается у представителей разных таксонов. Так, колонии разных групп книдарий обладают единой гастро-васкулярной системой, колониальные камптозои обладают транспортной системой из трубчатых клеток и звездчатых комплексов, в разных же классах мшанок общеколониальный транспорт осуществляется разными способами – в зависимости от специфики организации стенки тела и полости тела зооидов (см. п. Современное состояние…).
Очевидно, что неравномерность имеющихся данных связана с техническими сложностями при изучении остальных таксонов: большие размеры (как колоний, так и зооидов), инкрустирующая форма роста, непрозрачные покровы, наличие минеральных скелетных образований и т.д. Например, принято считать, что в колониях мшанок из кл. Gymnolaemata транспорт питательных веществ осуществляемся посредством фуникулярной системы.
Существует всего три экспериментальных исследования, касающихся проблемы транспорта веществ в колониях мшанок, они были проведены с использованием метода авторадиографии (Best, Thorpe, 1985; Lutaud, 1985; Miles et al., 1995). Тем не менее, авторам удалось лишь подтвердить сам факт транспорта питательных веществ в пределах колонии и преимущественного их поступления к ее нарастающему краю. И только Люто (Lutaud, 1985) удалось показать, что фуникулярная система принимает участие в транспорте веществ, однако ни механизм, ни конкретные транспортируемые вещества до сих пор неизвестны.
Более того, тонкое строение фуникулярной системы описано всего для одного вида гимнолемат (Lutaud, 1982). Тем не менее, в литературе распространено представление, что организация фуникулярной системы у представителей разных групп гимнолетматных мшанок имеет значительные отличия (Mukai et al., 1997; Schwaha et al., 2020, 2021). Фуникулярные системы соседних зооидов контактируют друг с другом посредством коммуникационных пор, строение которых было исследовано для ограниченного круга видов в основном с помощью светооптических методов. Имеющиеся электронно-микроскопические данные (Carle & Ruppert, 1983; Gordon, 1974; Lutaud, 1991; Shunatova et al., 2021) ограничены и противоречивы. Мы предполагаем, что эти противоречия, с одной стороны, могут определяться видоспецифичными особенностями, а с другой – с разницей в строении поровых пластинок между зооидами разных типов: в одном случае были исследованы поровые пластинки между двумя аутозооидами, тогда как в других – между аутозооидом и кенозооидом (одним из типов гетерморфных зооидов). Для понимания механизма функционирования коммуникационных пор при передаче питательных веществ от одного зооида к другому представляется важным провести сравнительный анализ строения поровых пластинок между разными типами зооидов.
Таким образом, выявление специфики организации и функционирования интегрирующей транспортной системы в полиморфных колониях с высокой степенью морфологической индивидуальности зооидов представляется очень актуальным. Это вопрос исключительно важен для понимания как морфологических, так и физиологических аспектов функционирования колоний такого типа. Кроме того, подобная информация даст возможность выявить закономерности в проявлении интеграции колоний, относящихся к разным уровням организации, что подтверждает общий характер рассматриваемой проблемы.
Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект
Задача 1. Выявить особенности микроанатомии и тонкого строения фуникулярной системы у выбранных видов из отрядов Cheilostomata и Ctenostomata (кл. Gymnolaemata), обладающих как простыми коммуникационными порами, так и многопоровыми пластинками.
Выполнение данной задачи подразумевает сравнение паттерна расположения элементов фуникулярной системы у (i) представителей разных отрядов, (ii) с различной формой роста колоний (среди ктеностомат), (iii) с различными вариантами организации коммуникационных пор. Полученные данные позволят выявить общие закономерности в организации фуникулярной системы у представителей кл. Gymnolaemata.
Задача 2. Провести сравнительный анализ тонкого строения коммуникационных пор как между двумя аутозооидами, так и между аутозооидом и гетероморфными зооидами разных типов (авикулярии, кенозооиды) у выбранных видов с полиморфными колониями.
Решение данной задачи позволит выявить общий план строения коммуникационных пор и оценить вариабельность в их строении у зооидов разных типов (в зависимости от функции последних).
Задача 3. Экспериментально подтвердить, что транспорт веществ по фуникулярной системе и через коммуникационные поры осуществляется между клетками (на примере Electra pilosa). Наши предположения о том, что питательные вещества транспортируются между клетками фуникулярной системы и клеток, входящих в комплекс розетки (а не через них), основаны на полученных нами данных о тонком строении поровой пластинки между аутозооидом и кенозооидом Dendrobeania fruticosa (Shunatova et al., 2021). Решение данной задачи позволит подтвердить одну из высказанных ранее контрастных гипотез о механизме функционирования коммуникационных пор.
Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов
Имеющиеся в литературе сведения об общеколониальном транспорте питательных веществ у мшанок весьма скудны и разрозненны (см. п. Современное состояние…). Во многом это определяется методическими сложностями работы со мшанками. С другой стороны, разрешающая способность метода авторадиографии, использованного при исследовании общеколониального транспорта у мшанок, не дает ответа на вопросы: какие структуры задействованы в этом транспорте и каков механизм передачи питательных веществ между зооидами. К сожалению, после появления современного арсенала методов визуализации различных молекул никто не пробовал применить их для исследования проблемы общеколониального транспорта в колониях мшанок.
Нынешний проект подразумевает работу по двум направлениям: морфологическому (задачи 1 и 2) и экспериментальному (задача 3). Возможность реализации морфологического направления не вызывает сомнений: часть материала собрана и прошла первичную пробоподготовку, остальной материал легко доступен для сбора, приборный парк ресурсных центров СПбГУ в рабочем состоянии.
В ходе реализации проекта мы впервые выявим особенности микроанатомии и тонкого строения фуникулярной системы у выбранных видов из отрядов Cheilostomata и Ctenostomata, обладающих как простыми коммуникационными порами, так и многопоровыми пластинками. Нами впервые будет проведен сравнительный анализ тонкого строения коммуникационных пор как между двумя аутозооидами, так и между аутозооидом и гетероморфными зооидами разных типов (авикулярии, кенозооиды) у выбранных видов с полиморфными колониями. Полученные данные позволят выявить общие закономерности в организации фуникулярной системы у представителей кл. Gymnolaemata.
Экспериментальный блок (задача 3) является поисковым – впервые будет предпринята попытка отработать методику включения флуоресцентной метки в пищу и последующей визуализации метки при осуществлении общеколониального транспорта у мшанок. Несомненно, всегда существуют риски при проведении экспериментальных работ, однако мы постаралась учесть все обстоятельства, которые являются критичными для таких экспериментов. На основании наших данных по пищевому поведению этих животных (Шунатова, 1999; Shunatova, Ostrovsky, 2001), мы выбрали наиболее неприхотливый и активный вид хейлостомат, который в мессе встречается в окрестностях УНБ «Беломорская» - Electra pilosa. Кроме того, данный метод является менее трудоемким и затратным, нежели авторадиография или иммуноголд.
Современное состояние исследований по данной проблеме
Один из ключевых моментов в исследованиях колониальных организмов связан с проблемой интеграции колоний. Различным аспектам данной проблемы посвящена обширная литература. Несомненно, разные группы колониальных организмов исследованы в разной степени, и значительная часть работ выполнена на книдариях, особенно на представителях кл. Hydrozoa. Отчасти это связано с техническими сложностями при изучении остальных таксонов: большие размеры (как колоний, так и зооидов), инкрустирующая форма роста, непрозрачные покровы, наличие минеральных скелетных образований и т.д.
Транспорт питательных веществ в колониях мшанок исследован очень поверхностно; это касается как физиологических аспектов, так и морфологии структур, задействованных в обеспечении этого процесса. Транспорт питательных веществ по колонии гимнолемат осуществляется посредством специализированной фуникулярной системы – разветвленной системы тяжей мезодермального происхождения, начинающихся от слепого мешка (участка пищеварительной системы, где осуществляется всасывание питательных веществ) и достигающих коммуникационных пор (Ryland, 1970; Mukai et al., 1997). Зачастую в состав фуникулярной системы включают собственно фуникулюс (например, Carle, Ruppert, 1983; Mukai et al., 1997; Schwaha et al., 2020, 2021) – данная структура характерна для всех групп мшанок и представляет собой трубку, стенки которой содержат внеклеточный матрикс, продольные мышечные волокна и со стороны полости тела выстланы клетками мезодермального происхождения (Nielsen, Pedersen, 1979; Carle, Ruppert, 1983; Lutaud, 1982). Фуникулюс отходит от слепого мешка (часто терминально) и крепится к базальной (или к одной из латеральных) стенке зооида, с ним обычно ассоциированы развивающиеся сперматозооиды, а у представителей кл. Phylactolaemata еще и статобласты. Функциональная нагрузка фуникулюса до сих пор дискутируется в литературе (см., например, Schwaha et al., 2021).
Транспорт питательных веществ в колониях гимнолемат приобретает особое значение в связи с широким распространением полиморфизма и разнообразием гетероморфных зооидов, которые не способны питаться. Однако строение фуникулярной системы с использованием методов электронной микроскопии исследовано только у одного вида хейлостомат (Lutaud, 1982). Тем не менее, в литературе распространено представление, что организация фуникулярной системы у представителей отрядов Cheilostomata и Ctenostomata имеет значительные отличия (Mukai et
al., 1997; Schwaha et al., 2021).
Тяжи фуникулярной системы соседних зооидов контактируют посредством коммуникационных пор, которые могут быть либо одиночными, либо собраны в комплексы – поровые пластики. Строение коммуникационных пор было исследовано для очень ограниченного круга видов в основном с помощью светооптических методов. Отдельные аспекты тонкого строения коммуникационных пор освещены в значительно меньшем количестве работ (Carle & Ruppert, 1983; Gordon, 1974; Lutaud, 1991; Shunatova et al., 2021). Некоторые данные о структуре коммуникационных пор были получены и с применением методов конфокальной микроскопии (Decker et al., 2020; Prцts et al., 2019; Schwaha et al., 2011, 2020; Schwaha & Wanninger, 2015, 2018). Не смотря на небольшое количество исследованных видов и противоречивость данных разных авторов, можно выделить ряд общих черт в организации поровых пластинок. Тем не менее, очень многие детали, которые являются принципиальными для понимания механизма функционирования поровых пластинок, по сведениям разных авторов отличаются. Мы предполагаем, что эти противоречия, с одной стороны, могут определяться видоспецифичными особенностями, а с другой – с разницей в строении поровых пластинок между зооидами разных типов: в одном случае были исследованы поровые пластинки между двумя аутозооидами (питающимися зооидами), тогда как в других – между аутозооидом и кенозооидом (одним из типов гетерморфных зооидов). На наш взгляд, представляется особенно интересным сравнение строения поровых пластинок как между аутозооидами, так и между аутозооидом и разными типами гетероморфных зооидов, однако подобные сведения в литературе отсутствуют.
В литературе конкурируют две основные гипотезы, описывающие возможный механизм функционирования поровых пластинок. Согласно одной из них, транспорт питательных веществ осуществляется непосредственно через специальные клетки (Gordon, 1974; Bobin, 1977). Авторы второй гипотезы предполагают, что транспорт должен осуществляться по межклетникам, между специальными клетками, которые функционирую в качестве створок, а клетка цинктуры выполняет функцию сфинктера (Carle, Ruppert, 1983). Наши данные о тонком строении поровых пластинок между аутозооидами и кенозооидами одного из видов хейлостомных мшанок позволяют считать вторую гипотезу более реалистичной (Shunatova et al., 2021), однако необходимы дальнейшие исследования для ее полного (или частичного) подтверждения. В первую очередь, необходимы данные о строении клетки цинктуры, в частности, о составе и расположении цитоскелетных элементов в ней. Отрывочные и противоречивые сведения присутствуют в ряде работ, посвященных общей анатомии нескольких видов ктеностомат и выполненных с использованием конфокальной микроскопии: в некоторых из них отмечается наличие положительной окраски к тубулину (Prоts et al., 2019) и наличие f-актина (Schwaha & Wanninger, 2018; Prоts et al., 2019; Decker et al., 2020). Однако в перечисленных работах данные о тонком строении клеток цинктуры отсутствуют.
Существует всего три экспериментальных исследования, касающихся проблемы транспорта веществ в колониях мшанок, все они были проведены с использованием метода авторадиографии (Best, Thorpe, 1985; Lutaud, 1985; Miles et al., 1995). Тем не менее, авторам удалось лишь подтвердить сам факт транспорта питательных веществ в пределах колонии и преимущественного их поступления к ее нарастающему краю. И только Люто (Lutaud, 1985) удалось показать, что фуникулярная система непосредственно принимает участие в транспорте веществ, однако ни механизм, ни конкретные транспортируемые вещества до сих пор неизвестны.
Таким образом, предлагаемое исследование является уникальным. Комбинация разных методов (электронная и конфокальная микроскопия в совокупности с экспериментальным введением флуоресцентной метки) создаст методическую базу для работы с колониальными организмами с высокой степенью обособленности зооидов и приблизит нас к пониманию функционирования интегрирующих систем в колониях такого типа.
Предлагаемые методы и подходы
Задача 1. Для каждого выбранного вида мшанок будут детально исследованы особенности тонкого строения и выполнена пространственная реконструкция фуникулярной системы с помощью различных методов (световая и трансмиссионная электронная микроскопия). Оснащение ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» позволяет успешно провести все этапы исследования.
Задача 2. Для каждого выбранного вида мшанок будут детально исследованы особенности тонкого строения поровых пластинок и выполнена их пространственная реконструкция Имеющееся в ресурсном центре СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» оборудование позволяет успешно провести все этапы исследования. Кроме того, для визуализации цитоскелета клеток цинктуры предполагается использовать конфокальную лазерную сканирующую микроскопию (микроскоп Leica TCS SP5 доступен в ресурсном центре СПбГУ).
Задача 3. Экспериментально подтвердить, что транспорт веществ по фуникулярной системе и через коммуникационные поры осуществляется между клетками.
Данная задача является поисковой, в ходе ее выполнения мы планируем отработать методику включения флуоресцентной метки в пищу и впоследствии визуализировать ее в составе питательных веществ, транспортируемых в пределах колонии мшанок. Приготовление «меченных» пищевых пеллетов будет проведено на базе ресурсного центра «Культивирование микроорганизмов» СПбГУ.
Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту
Наш небольшой коллектив, включающий сотрудника (Н.Н.Шунатова) и студента (А.И.Филиппов) кафедры Зоологии беспозвоночных СПбГУ, обладает значительным опытом работы почти во всех методических блоках проекта. Руководитель проекта имеет 25-летний опыт работы с различными колониальными организмами, в том числе с разнообразными представителями типа Bryozoa, что отражено в публикациях: 15 из 29 статей и главы в двух коллективных монографиях освещают различные аспекты морфологии и биологии Bryozoa (см. список публикаций https://www.researchgate.net/profile/Natalia_Shunatova/research). Руководитель проекта владеет полным спектром морфологических методов исследования (гистология, гистохимия, электронная микроскопия, конфокальная микроскопия). Руководитель предлагаемого проекта – зоолог, основная область интересов которого – функциональная и эволюционная морфология. В 2018 году руководителем проекта была разработана и реализована единственная в России дополнительная образовательная программа ДОП «Биоразнообразие и эволюционные тенденции у колониальных беспозвоночных на примере мшанок (тип Bryozoa)// Bryozoa: Diversity and Evolutionary Trends in Colonial Animals» (шифр В 1.2183.2017; руководитель программы – Н.Н.Шунатова).
А.И.Филиппов в настоящий момент является студентом 3 курса кафедры Зоологии беспозвоночных СПбГУ. В ходе реализации совместного проекта РФФИ 20-04-01031 он освоил как содержание мшанок в культуре, так и методы электронной и конфокальной микроскопии. В настоящий момент А.И.Филиппов принимает активное участие в подготовки рукописи к печати.
В ходе реализации проекта РФФИ 20-04-01031 «Полиморфизм у морских мшанок: морфологиеские и молекулярные аспекты» нами было исследовано тонкое строение гетерозооидов 4 видов хейлостомат, в том числе описано строение фуникулярной системы у кенозооидов и авикуляриев Dendrobeania fruticosa, а также строение поровой пластинки между аутозооидом и кенозооидом (Shunatova et al., 2021, 2022). Параллельно нами были получены предварительные данные об организации фуникулярной системы аутозооидов данного вида. Предлагаемый проект является логическим продолжением завершаемого в этом году проекта РФФИ.
Для выполнения поставленных задач 1 и 2 часть материала уже собрана и зафиксирована: так, в распоряжении коллектива имеются фрагменты колоний двух видов, подготовленные для последующего изучения методом трансмиссионной электронной микроскопии.
В ходе выполнения проекта РФФИ 20-04-01031 нами были отработаны методы содержания мшанок в культуре, что является необходимым условием для выполнения Задачи 3.
Имеющееся в распоряжении коллектива оборудование, доступность приборного парка ресурсных центров СПбГУ, а также опыт совместной работы (в частности, по проекту РФФИ 20-04-01031), гарантируют решение поставленных задач и получение результатов в полном объёме в установленный Фондом срок.
