Проект направлен на решение вопроса о причинах подверженности заражению внутриклеточными эндосимбионтами (здесь и далее под эндосимбионтом мы понимаем любой микроорганизм, живущий в клетке-хозяине, независимо от типа отношений между партнерами - мутуализм, комменсализм или паразитизм) клеток одних линий и резистентности к заражению клеток близкородственных клеточных линий. Основным направлением исследования будет проверка рабочей гипотезы, согласно которой способность заражаться или резистентность клеток в первую очередь определяется наличием базовых различий в протеоме и в характере гликозилирования резистентных и подверженных заражению клеток, т.е. различий в статусе клеток до момента заражения. Другим аспектом данной проблемы является вопрос о механизмах проникновения в клетку-хозяина эндосимбионтов из порядка Rickettsiales, характеризующихся широким спектром хозяев, т.е. не обладающих строгой специфичностью к клетке-хозяину. Проблема подверженности заражению на клеточном уровне организации представляется чрезвычайно значимой особенно в настоящее время. Остается непонятной и причина специфичности заражения эндосимбиотическими микроорганизмами - почему одни микроорганизмы способны проникать лишь в одного хозяина, а другие, механизм проникновения которых в клетку до сих пор неизвестен, оказываются способны становиться эндосимбионтами самых разных видов. К числу последних относятся и близкие родственники риккетсий-патогенов человека Candidatus Trichorickettsia mobilis и Candidatus Megaira venefica, формирующие устойчивые симбиозы с инфузориями, которые будут исследованы в ходе выполнения проекта.
В качестве одного из партнеров в выбранных модельных системах выступают дрожжи вида Rhodotorula mucilaginosa, которые в настоящее время рассматриваются как оппортунистический патоген человека. В связи с этим предлагаемый проект приобретает особую актуальность. Поскольку значительная часть запланированных исследований будет выполняться на клонах, зараженных дрожжами, вызывающими оппортунистические заболевания у человека, и непатогенными риккетсиями, в ходе работы будут получены результаты, имеющие не только научное, но и прикладное значение. Исследование эндосимбиотических моделей у инфузорий может способствовать выявлению причин подверженности к заражению определенных клеточных линий и, возможно, наметить пути предотвращения заражения патогенными микроорганизмами. Полученные данные могут оказаться полезны для определения способов профилактики и борьбы с риккетсиозами и некоторыми микозами.
В рамках указанной проблемы можно выделить следующие задачи:
- подобрать близкородственные клеточные линии (среди видов-двойников комплекса Paramecium aurelia) и клоны одного вида (виды Paramecium bursaria и Paramecium caudatum), различающиеся по своей способности заражаться специфичным эндосимбионтом;
- выявить наличие или отсутствие различий в характере гликозилирования белков инфузорий близкородственных видов и клонов, различающихся по своей способности заражаться конкретным эндосимбионтом;
- выявить гликоконъюгаты и лектины, определяющие специфичность распознавания партнеров в различных эндосимбиотических системах у инфузорий (на моделях Paramecium caudatum/Holospora obtusa,P. caudatum/Holospora undulata, P. bursaria/Rhodotorula mucilaginosa)
- определить наличие или отсутствие различий в протеомах инфузорий близкородственных видов и клонов, различающихся по своей способности заражаться конкретным эндосимбионтом.
Новизна проекта заключается в том, что в предлагаемом проекте акцент ставится на определении базального уровня гликозилирования и возможных различий в протеоме резистентных и подверженных заражению клонов, в отличие от большинства исследований, проводящихся в этой области в настоящее время. Как правило, в подобных исследованиях внимание фокусируют на анализе изменений транскриптома клетки после заражения, при этом пренебрегая сравнительным анализом состояния подверженных заражению и резистентных клеток в момент, непосредственно предшествующий заражению. Таким образом, все результаты, полученные в ходе выполнения проекта, будут пионерскими.
Возможность получения предполагаемых результатов обусловлена высоким уровнем квалификации специалистов и хорошей материально-технический базой СПбГУ. Наличие прекрасно оснащенного Научного Парка с Ресурсными Центрами "Культивирование микроорганизмов", "Микроскопии и микроанализа", "Развитие молекулярных и клеточных технологий" делает решение поставленных задач достижимым. Часть планируемых экспериментов потребует применения уже хорошо разработанных методов, таких как экспериментальное заражение инфузорий, обработка клеток флуоресцентно меченными лектинами или ферментами, электрофорез белков в ПААГ. Метод лектинового блоттинга в настоящее время считается эффективным методом для оценки характера гликозилирования белков. Использование гликановых и лектиновых микрочипов, а также флуоресцентно меченных хитозана и декстрана может позволить оценить возможность специфического связывания эндосимбиотических микроорганизмов с теми или иными детерминантами (гликанами или распознающими гликан доменами белков) на поверхности клетки-партнера.
Несмотря на то, что сам феномен уязвимости одних клонов и резистентности других известен достаточно давно (Раутиан и др., 1990), причины таких различий остаются неизвестны. Подобный феномен наблюдается и у представителей видов-двойников группы P.aurelia: инфузории видов P.primaurelia и P. pentaurelia способны заражаться микроспоридиями Globosporidium paramecii, а клоны видов P.sonneborni, P.biaurelia, P.traurelia и P.novaurelia – нет, несмотря на то, что эти виды настолько близки, что имеют идентичные последовательности гена 18SрРНК, и их отличают по последовательностям митохондриальных генов (Yakovleva et al., 2020). Интересно, что процесс заражения у резистентных клонов может быть блокирован на самых ранних стадиях, образно говоря, инфузория бактерий «в рот не берет». Кроме того, экспериментаторам известно, что способность заражаться может меняться даже у подверженного заражению клона – в каких-то случаях экспериментальное заражение оказывается безуспешным, несмотря на высокую концентрацию инфекционных форм.
В современной мировой науке широкое распространение получают преимущественно геномные исследования, как бактериальных эндосимбионтов инфузорий (Dohra et al., 2014; Garushyants et al., 2018; Zaburannyi et al., 2018), так и самих инфузорий, способных вступать в симбиотические отношения, например, видов рода Paramecium (ParameciumDB, https://paramecium.i2bc.paris-saclay.fr). Кроме того, стали появляться исследования, направленные на выяснение тонких механизмов взаимодействия между партнерами и оценку влияния эндосимбионта на жизнеспособность клетки-хозяина (Bella et al., 2016; Potekhin et al., 2018). Большие надежды исследователи возлагают на анализ транскриптомов клеток на разных этапах процесса заражения (Grosser et al., 2018), однако базальный уровень гликозилирования белков и возможные различия протеомов подверженных заражению и резистентных клонов одного вида до сих пор не попадали в сферу интересов исследователей.
Работ по изучению роли лектин-гликоконъюгатных взаимодействий при первичном распознавании эндосимбионта инфузорией практически не проводилось. Известны только две попытки проведения подобных исследований. Первые результаты японских коллег говорили о том, что способность штамма хлорелл к установлению эндосимбиотических отношений с инфузорией зависит от присутствия глюкозамина в его клеточной стенке (Takeda et al., 1998), однако более поздние эксперименты поставили под сомнение полученные ранее результаты (Kodama, Fujishima, 2007). Другая попытка использования лектинов в анализе механизмов взаимодействия инфузории и ее эндосимбионта была предпринята немецкой группой. В этой работе путем обработки инфекционных форм бактерии Holospora obtusa лектином Con A, специфично распознающим маннозу, показано, что белок инфекционной формы с м.в. 25 кДа является гликопротеином и связывается с белками макронуклеуса инфузории (Ehrsam, Goertz,1999). Однако неизвестно, играет ли этот белок какую-либо роль в проникновении бактерии в ядро и в саму клетку. Интересно, что у инфузорий P. caudatum лектин-гликоконъюгатные взаимодействия участвуют в процессе спаривания партнеров при конъюгации, которая блокируется при обработке лектином WGA (Fuke, Sato, 2005). Вместе с тем показано, что по мере старения парамеций и при их голодании состав гликоконъюгатов на поверхности P. primaurelia меняется (Ramoino, 1997). Можно предположить, что эти изменения могут сказываться и на способности инфузорий заражаться эндосимбионтами.
Таким образом, сравнительный анализ протеомов и характера гликозилирования у подверженных заражению и резистентных клонов одного вида до сих пор никем не был предпринят, и, по-видимому, не планируется. Насколько нам известно, научных конкурентов в этой области исследования симбиотических систем, образованных инфузориями и другими микроорганизмами, в настоящий момент не существует.
В качестве моделей для исследования причин уязвимости одних клеток и резистентности других при заражении различными микроорганизмами будут использованы инфузории, поскольку для них, как и для всех протистов, клеточный и организменный уровни организации совпадают. Кроме того, клеточные линии инфузорий легко культивировать в лаборатории, и они легко поддаются различным манипуляциям.
В экспериментах, направленных на поиск различий уязвимых и резистентных клонов, будут использованы модельные системы со строго специфичными взаимодействиями партнеров, такие как как хорошо разработанные симбиотические системы инфузория Paramecium caudatum/бактерия Holospora obtusa (эндосимбионт макронуклеуса) и P. caudatum/бактерия Holospora undulata (эндосимбионт микронуклеуса) и новая, недавно обнаруженная нашей группой система с участием парамеций P. bursaria/дрожжи (Rhodotorula mucilaginosa). Для этих моделей будут проведены серии экспериментальных заражений для отбора клонов, проявляющих уязвимость или резистентность к заражению. Кроме того, в качестве объектов исследования выступят клоны видов-двойников из комплекса видов P.aurelia, для которых ранее нами была установлена способность заражаться микроспоридией Globosporidium paramecii (P. primaurelia, P. pentaurelia), и резистентность к заражению (P. biaurelia, P. triaurelia ,P. novaurelia, P. sonneborni) (Yakovleva et al., 2020). В результате массового культивирования отобранных клонов мы рассчитываем получить материал, пригодный для дальнейшего выделения тотального белка. Будет выделен белок и проведен электрофорез белков заражающихся и резистентных клонов с последующим лектиновым блоттингом (Cao et al., 2013). Последний отличается от Вестерн блоттинга тем, что в нем вместо антител используются лектины, белки, специфично связывающие концевые остатки сахаров гликоконъюгатов. В том случае, если лектиновые блоты тотального белка продемонстрируют слишком высокий уровень гликозилирования белков, малопригодный для сравнительного анализа, предварительно клетки будут разрушены с помощью детергента в мягких условиях, и электрофорез и лектиновый блоттинг будет проводиться не с использованием тотального белка в качестве пробы, а белков фракции, содержащей кортекс клеток инфузорий.
Для проверки нашей гипотезы о том, что уязвимость/резистентность клона определяется в первую очередь характером гликозилирования белков клеточной поверхности инфузорий, предполагается выполнить эксперименты по оценке влияния предобработки ферментами (нейраминидаза, N-ацетиглюкозаминидаза, маннозидаза), удаляющими концевые остатки сахаров гликоконъюгатов на процесс заражения. Кроме того, будет исследован характер гликозилирования белков клеточной поверхности различных клонов инфузорий путем обработки флуоресцентно меченными лектинами. В частности, в первую очередь будут использованы лектины WGA и ConA, проявляющие специфичность к N-ацетилглюкозамину и маннозе, соответственно. Такой выбор лектинов объясняется наличием литературных данных в пользу сродства этих лектинов к клеткам парамеций (Ramoino, 1997; Fuke, Sato, 2005). Наши предварительные эксперименты продемонстрировали, что наличие определенных концевых углеводов действительно влияет на интенсивность поглощения парамецией инфекционных форм бактерий Holospora obtusa. Следует отметить, что каждый из взаимодействующих партнеров может нести на своей поверхности как терминальные сахарные остатки в составе гликоконъюгата, так и лектины, способные их распознавать. Так, установлено, что некоторые патогенные бактерии, например, Pseudomonas aeruginosa, помимо большого количества пептидогликанов, несут на своей поверхности адгезины (лектины) (Grishin et al., 2015). Поэтому в работе мы предполагаем также проведение экспериментов по выявлению способности эндосимбионтов связывать как лектины, так и гликаны. Для этих целей мы планируем использование не только отдельных лектинов (WGA, ConA) и полисахаридов, таких как хитин, хитозан и декстран, но и в перспективе лектиновых и гликановых микрочипов (микроэррей). Для осуществления этих экспериментов предстоит отработать метод флуоресцентного мечения эндосимбиотических микроорганизмов. В планируемых экспериментах по конкурентному ингибированию распознавания эндосимбионта будут использованы декстран и хитозан; кроме того, эти флуоресцентно меченные соединения будут использованы для выявления соответствующих рецепторов у инфузории.
Другим направлением исследований будут первые эксперименты по анализу протеомов подверженных заражению и резистентных клонов. Исследование протеомов планируется с использованием дифференциального двумерного электрофореза (2D-DIGE).
Поскольку указанные направления исследований являются абсолютно новыми для группы и несут определенные риски, параллельно будет определен спектра хозяев для бактериальных эндосимбионтов рода Pseudolyticum. По нашим предварительным данным, круг их хозяев может быть шире, чем он считается в настоящее время. Кроме того, мы планируем осуществить серию экспериментов по выявлению инфекционного начала у эндосимбиотических бактерий Ca. Trichorickettsia mobilis и Ca. Megaira venefica, имеющих широкий спектр хозяев. Проведенные нами ранее эксперименты (Mironov, Sabaneyeva, 2020) позволяют предполагать, что образование инфекционных форм, по крайней мере, у Ca. Trichorickettsia mobilis, может происходить под действием некоторых антибиотиков, например, ампициллина. В связи с этим мы планируем проведение экспериментальных заражений клонов-реципиентов средой, полученной после культивирования зараженных клеток в присутствии антибиотика.
Общий план работ по проекту по годам.
1 год
1. Сравнительное исследование характера гликозилирования белков 8 клонов комплекса видов P.aurelia, различающихся по способности заражаться микроспоридией Globosporidium paramecii: выделение тотального белка, электрофорез в ПААГ и лектиновый блоттинг видов-двойников, подверженных заражению (3 клона P.primaurelia и клон P.pentaurelia) и устойчивых к заражению (по 1 клону P.sonnebornii, P.biaurelia, P.triaurelia, P.novaurelia).
2. Скрининг клонов P. bursaria на предмет способности заражаться дрожжами Rhodotorula mucilaginosa. Отбор резистентных и подверженных заражению клонов. Эксперименты по конкурентному заражению дрожжами и в норме присущими этому виду инфузорий эндосимбионтами, зелеными водорослями Chlorella sp. в присутствии декстрана, хитина и хитозана. Эксперименты по выявлению способности дрожжей Rhodotorula mucilaginosa и водорослей Chlorella sp. связываться с лектинами ConA и WGA.
3. Скрининг клонов P.caudatum на предмет способности заражаться бактериями Ноlospora obtusa и Holospora undulata. Отбор резистентных и подверженных заражению клонов. Эксперименты по выявлению роли концевых остатков сахаров на поверхности клетки в процессе заражения этими эндосимбионтами: экспериментальные заражения после обработки клеток инфузорий ферментами, специфично удаляющими концевые остатки сахаров гликоконъюгатов клеточной поверхности. Выявление на поверхности инфузории рецепторов, несущих определенные сахарные остатки путем обработки флуоресцентно меченными лектинами. Проведение экспериментов по выявлению способностей эндосимбионтов связывать гликаны.
4. Анализ спектра хозяев у эндосимбионтов рода Pseudolyticum.
5. Подготовка публикации.
6. Участие в работе 16-го Международного Конгресса по Протистологии (Корея, Сеул, 19-24 июня, 2022)
2 год
1. Сравнительное исследование характера гликозилирования белков клонов P.bursaria, различающихся по способности заражаться дрожжами Rhodotorula mucilaginosa, методом лектинового блоттинга. Разработка метода флуоресцентного мечения эндосимбионтов Эксперименты по выявлению способностей эндосимбионтов связывать лектины.
2. Сравнительное исследование характера гликозилирования белков клонов P. caudatum, различающихся по способности заражаться бактериями Holospora obtusa и Holospora undulata, методом лектинового блоттинга.
3. Сравнительное исследование протеомов резистентных и подверженных заражению клонов во всех трех симбиотических системах методом 2D-DIGE.
Поиск инфекционных форм эндосимбионта Ca. Trichorickettsia mobilis.
Выступление с докладом на IX Европейском Конгрессе по Протистологии (Австрия, Вена, 9-14 июля, 2023).
Подготовка 2-х публикаций.
