Реферат
Объектом настоящего исследования являлись мицеллярные экстракционные системы в контексте их применения для пробоподготовки проб пищевых продуктов. Целью исследования явилась разработка новых автоматизированных методов химического анализа пищевых продуктов, основанных на проведении мицеллярной микроэкстракции аналитов из проб сложного состава непосредственно в гидравлических схемах проточного анализа. В ходе работы был разработан новый метод автоматизированного предконцентрирования аналитов из пищевых продуктов, была реализована идея получения ионных ПАВ в режиме in-situ для мицеллярно-опосредованного извлечения аналитов из твердофазных объектов, была предложена схема миниатюризации процедуры мицеллярно-опосредованного извлечения путем отделения образующейся фазы на вращающийся пористый гидрофобный мембранный диск, была разработана автоматизированная схема on-line микроэкстракционного выделения и концентрирования аналитов из жидких пищевых продуктов, а также были впервые получены магнитные наночастицы, стабилизированные поверхностно-активными веществами и обеспечивающие эффективную сорбцию тетрациклинов. Предложенные в ходе выполнения НИР решения могут быть успешно применены для эффективного, экономически выгодного и безопасного контроля качества пищевых продуктов. Найденные решения имеют научную значимость, как в области проточных методов анализа, так и области методов разделения и концентрирования веществ. Предполагается, что дальнейший поиск мицеллярных экстракционных систем позволит расширить возможности методов пробоподготовки.

2

Введение
Определение содержания пищевых добавок и примесей в пищевых продуктах является неотъемлемой частью контроля их качества. Связанная с этим необходимость оперативного получения химико-аналитической информации в условиях увеличивающейся нагрузки на аналитические лаборатории требует повышения экспрессности анализа, снижения трудовых затрат и уменьшения объемов проб, растворов реагентов и отходов. Эти задачи решаются с помощью автоматизированных и миниатюризированных методов химического анализа, реализуемых, в том числе и на принципах проточных методов [Rocha F.R.P., Nóbrega J.A., Filho O.F. Green Chem. 3 (2001) 216–220]. Однако пищевые продукты представляют собой сложные по составу, многофазные, гетерогенные объекты, содержащие ряд микро- и макрокомпонентов, способных оказывать влияние на ход и результаты анализа. Вследствие этого особое внимание уделяется стадии пробоподготовки, благодаря которой удается выделить и сконцентрировать определяемый компонент, тем самым повысив селективность и чувствительность анализа. В последнее время активно развиваются микроэкстракционные методы, позволяющие эффективно и экспрессно проводить выделение и концентрирование целевых аналитов с низким расходом экстрагентов [Spietelun A., Marcinkowski Ł., de la Guardia M., Namieśnik J. Talanta 119 (2014) 34–45]. Основной фундаментальной научной задачей, которую предполагалось решить в исследовании, являлась разработка автоматизированных микроэкстракционных методов на принципах on-line мицеллярной микроэкстракции и проточного анализа для эффективного извлечения и концентрирования микрокомпонентов из проб пищевых продуктов.
Экстракция нашла широкое применение для анализа объектов различной природы в силу того, что она позволяет обеспечивать низкие пределы обнаружения и высокую селективность анализа. Однако традиционные варианты жидкостной экстракции обладают существенными недостатками, такими как значительные временные затраты, использование больших объемов пробы и токсичных органических растворителей, сложность автоматизации. В связи с этим актуальными тенденциями современного химического анализа являются миниатюризация и автоматизация методов пробоподготовки, в том числе и экстракции, ведущих к снижению объемов используемых токсичных органических растворителей; а также поиск новых экстрагентов, оказывающих минимальное негативное воздействие на окружающую среду [An J., Trujillo-Rodríguez M.J., Pino V., Anderson J.L. J. Chromatogr. A, 1500 (2017) 1–23]. Автоматизация микроэкстракционного процесса на принципах проточного анализа дает возможность совместить достоинства методов, позволяя не только минимизировать объем экстрагента и упростить выполняемую процедуру, но и увеличить воспроизводимость, экспрессность; снизить влияние применяемых экстрагентов на окружающую среду.
На основании имеющихся литературных данных можно утверждать, что до настоящего момента были разработаны методы микроэкстракционного концентрирования, которые основаны на различных принципах и были успешно применены для решения разнообразных аналитических задач, включая анализ пищевых продуктов [Asensio-Ramos M., Ravelo-Perez L.M., Gonzalez-Curbelo M.A., Hernandez-Borges J. J. Chromatogr. A, 1218 (2011) 7415–7437]. Автоматизированные схемы пробоподготовки, включающие стадию жидкостной микроэкстракции, были созданы, в основном, на принципах проточного анализа [Alexovič, M., Horstkotte, B., Šrámková, I., Solich, P., Sabo, J. Trends in Analytical Chemistry. 86 (2017) 39–55].
Капельная микроэкстракция осуществляется при погружении микрокапли экстрагента с помощью микрошприца в фазу пробы, что обеспечивает высокие коэффициенты концентрирования при высоких коэффициентах распределения. Данный метод был автоматизирован в статическом и динамическом режиме [Alexovic M., Horstkotte B., Solich P., Sabo J., Anal. Chim. Acta 906 (2016) 22–40]. Статический режим предполагает проведение извлечения из постоянного объема пробы при перемешивании водной фазы, необходимом для ускорения массопереноса. В динамическом режиме поток пробы непрерывно прокачивается через проточную ячейку, в которой находится капля экстрагента. Недостатком метода является необходимость поддержания стабильности капли, которая может срываться или частично растворяться в анализируемом растворе.
Дисперсионная микроэкстракция также позволяет достичь высоких коэффициентов концентрирования. В основе метода лежит образование мелкодисперсной эмульсии при вводе в пробу смеси экстрагента и диспергатора, смешивающегося и с пробой, и с экстрагентом. При этом межфазное равновесие устанавливается быстро за счет большой площади контакта фаз. Автоматизация метода была произведена в проточных системах последовательного инжекционного [Anthemidis A.N., Ioannou K.G. Talanta 84 (2011) 1215–1220] и циклического инжекционного [Bulatov A., Medinskaia K. Aseeva D., Garmonov D., Moskvin L., Talanta 133 (2015) 66–70] анализов. Недостаток метода заключается в снижении эффективности экстракции из-за того, что диспергатор увеличивает растворимость аналита и экстрагента в фазе пробы. В качестве альтернативы для диспергирования экстрагента применяются различные перемешивающие устройства и углекислый газ, получаемый in situ.
Недавно был предложен метод гомогенной микроэкстракции, который подразумевает образование фазы экстрагента из гомогенного раствора пробы при изменении химического состава системы или температуры [Anthemidis A.N., Ioannou K.G. Talanta 80 (2009) 413-421]. При этом микрокапли экстрагента образуются равномерно во всем объеме системы и дополнительное диспергирование не требуется. Гомогенная микроэкстракция была реализована в проточной системе [Vakh C., Pochivalov A., Andruch V., Moskvin L., Bulatov A. Anal. Chim. Acta. 907 (2016) 54-59]. Экстракционный процесс, происходящий в смесительной камере, включает в себя получение гидрофильной формы экстрагента (гексаноат-ионов) в фазе пробы в присутствии карбоната натрия и фазовое разделение при подкислении, обусловленное протонированием гексаноат-ионов с образованием фазы гексановой кислоты, в которую извлекается аналит. Выделяющийся углекислый газ способствует быстрому разделению фаз, что исключает необходимость центрифугирования. Однако для аналитов, способных переходить в ионную форму в кислой среде, необходимо обеспечить нейтральную среду в процессе экстракции путем оптимизации концентраций и объемов растворов реагентов.
Привлекательным является метод мицеллярной микроэкстракции, который сочетает в себе широкие возможности для извлечения и концентрирования аналитов различной природы за счет их солюбилизации внутрь мицелл с экологической безопасностью экстрагентов – неионогенных поверхностно-активных веществ (НПАВ) [Ojeda C.B., Rojas F.S. Anal. Bioanal. Chem 394 (2009) 759–782]. Образование мицеллярной фазы из раствора НПАВ происходит при температуре, называемой точкой помутнения (ТП), при условии достаточной концентрации НПАВ, называемой критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Эффекты высаливания и высахаривания позволяют снизить ТП, благодаря чему удается избежать стадии нагревания для выделения мицеллярной фазы. Для повышения эффективности экстракции полярных соединений применяют растворы НПАВ и анионных или катионных ПАВ, что приводит к образованию смешанных мицелл, солюбилизирующих аналиты, в том числе, за счет электростатических взаимодействий.
Для автоматизации мицеллярной микроэкстракции было предложено несколько схем. Одна из схем основана на принципах проточно-инжекционного анализа [Li Y., Hu D., Jiang Z. Anal. Chim. Acta 576 (2006) 207–214]. Смесь раствора пробы и НПАВ (Triton X-114) непрерывно направлялась с помощью перистальтического насоса в микроколонку, где происходило удерживание мицеллярной фазы с последующим элюированием для детектирования. Позднее данный подход был усовершенствован с применением мультинасосной проточной системы [Frizzarin R.M., Rocha F.R.P. Anal. Chim. Acta 820 (2014) 69–75]. Потоки пробы и смешанного раствора реагента и НПАВ объединялись в смесительной спирали, что вызывало фазовое разделение, далее смесь направлялась в проточный детектор, выходной канал которого был заполнен сорбентом для отделения мицеллярной фазы. Также возможно проведение экстракционного процесса в камере шприцевого насоса, посредством которого все необходимые растворы отбираются через многоходовой кран-переключатель [Frizzarin R.M., Portugal L.A., Estela J.M., Rocha F.R.P., Cerda V. Talanta 148 (2016) 694–699]. После образования двухфазной системы выдерживается пауза для достижения разделения фаз, после чего водная фаза направляется на сброс, а мицеллярная фаза – в детектор.
Разработанные автоматизированные методы, включающие мицеллярную микроэкстракцию, в первую очередь предназначены для анализа водных сред и не учитывают специфику выделения аналитов из сложных по составу проб, таких как пищевые продукты. Не предложено методов, предполагающих выделение аналитов на принципах мицеллярной микроэкстракции из твердофазных проб. Кроме того, круг применяемых НПАВ в проточном анализе не так широк и в основном ограничивается этоксилированными алкилфенолами (например, Triton X-114, Triton X-100, PONPE 7.5, ОП-7, ОП-10) и жирными спиртами (например, Brij-30), которые обладают высокой вязкостью, что существенно усложняет как ввод НПАВ в гидравлическую схему, так и выделение мицеллярной фазы в условиях проточного анализа.

Основная часть отчета о НИР
Целью исследования явилась разработка новых автоматизированных методов химического анализа пищевых продуктов, основанных на проведении мицеллярной микроэкстракции аналитов из проб сложного состава непосредственно в гидравлических схемах проточного анализа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать принципиальные гидравлические схемы для автоматизированного выделения и концентрирования аналитов из жидких и твердофазных проб пищевых продуктов на принципах мицеллярной микроэкстракции.
2. Экспериментально проверить возможность образования мицеллярной фазы в растворах ряда НПАВ, ранее не использовавшихся в мицеллярной микроэкстракции.
3. Исследовать возможность получения ионных ПАВ in-situ для мицеллярно-опосредованного извлечения аналитов из твердофазных образцов.
4. Изучить эффективность концентрирования целевых аналитов в системах, демонстрирующих фазовое разделение, для оценки их применимости для решения поставленных аналитических задач.
5. Выявить закономерности протекания экстракционного процесса в каждом конкретном случае и оптимизировать условия выделения аналитов для достижения максимальной чувствительности.
6. Разработать автоматизированные методики пробоподготовки пищевых продуктов для определения микропримесей, а именно пестицидов, синтетических красителей и антибиотиков группы тетрациклинов.
7. Апробировать разработанные методики при анализе реальных объектов; оценить правильность получаемых результатов путем сравнения с результатами, полученными при анализе референтными методами
В рамках данного проекта впервые изучена возможность применения первичных аминов в качестве экстрагентов для мицеллярной экстракции. Было обнаружено, что ряд первичных аминов (н-гептиламин, н-октиламин, н-нониламин, н-дециламин) смешиваются с водой с образованием изотропных растворов, точки помутнения которых наблюдаются при температурах несколько выше 250С. Это, в свою очередь, позволяет добиться фазового разделения путем введения раствора электролита для снижения точки помутнения. Так, с помощью метода динамического рассеяния света было установлено, что коэффициенты диффузии для водного раствора н-октиламина и мицеллярной фазы, выделяющейся при добавлении 20% раствора хлорида натрия, составили 0,8х10−7 и 1,8х10−7 см2/с соответственно. Данные значения ниже на 2 порядка по сравнению с чистыми компонентами: коэффициенты диффузии для н-октиламина и воды равны 3,7х10−5 и 2,3х10−5 см2/с соответственно. Это подтверждает образование супрамолекулярных структур (мицелл) в изучаемой системе.
На основании предварительных исследований было установлено, что н-октиламин обеспечивает минимальный объем образующейся фазы и как следствие максимальные коэффициенты концентрирования (Рис. 1). Изученная экстракционная система была применена для определения тетрациклинов (тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин) в пробах жидких пищевых продуктов в специально разработанной автоматизированной проточной системе, основанной на принципах циклического инжекционного анализа (Рис. 2). Разработана принципиальная гидравлическая схема проточной системы, которая включала два восьмиходовых крана-переключателя, шприцевой и перистальтический насос, а также смесительную спираль и смесительную камеру. На первом этапе с помощью шприцевого насоса в смесительную спираль последовательно отбирались 50 мкл н-октиламина и 1 мл пробы, образуя изотропный раствор в ходе продвижения по ней. Полученный раствор направлялся в смесительную камеру, после чего таким же образом в нее вводилось 300 мкл 20% раствора хлорида натрия и осуществлялось перемешивание газовой фазой с помощью перистальтического насоса. Через 1 мин водную фазу направляли на сброс, а к мицеллярной фазе производилось добавление 50 мкл метанола с последующим перемешиванием газовой фазой. Полученный раствор направляли в хроматографическую виалу для последующего ВЭЖХ-УФ анализа.
Были определены условия хроматографического разделения и детектирования тетрациклинов в образующейся мицеллярной фазе. Был выбран градиентный режим элюирования, а подвижная фаза состояла из 0,5% водного раствора муравьиной кислоты и смеси ацетонитрила и метанола (2:1). Оптимальная длина волны детектирования была равна 355 нм. В качестве экстрагентов для извлечения тетрациклинов, кроме н-октиламина, были изучены высшие карбоновые кислоты (нонановая и гексановая) и различные амины (дибензиламин, дибутиламин и 2-(4-аминобензил)-пиридин). Водный раствор тетрациклинов смешивали с экстрагентами в соотношении 1:1. Было установлено, что только н-октиламин обеспечивает максимальную степень извлечения тетрациклинов (90±5 %).
Отдельное внимание было уделено оптимизации условий микроэкстракции. Оптимальный объем экстрагента составил 50 мкл, так как при больших объемах наблюдается разбавление экстракта, а при меньших объемах ухудшается повторяемость. В этих условиях коэффициент концентрирования составил 18±1. Также были изучены различные высаливающие агенты (хлорид, сульфат, карбонат и дигидрофосфат натрия). При добавлении дигидрофосфата натрия происходило образование нерастворимой соли н-октиламина. Наибольший аналитический сигнал среди остальных агентов достигался при использовании хлорида натрия (Рис. 3). Его концентрацию варьировали от 5 до 30%, при этом наилучшие результаты были получены при добавлении 20% раствора хлорида натрия к изотропному раствору. Во всех экспериментах объем пробы составлял 1 мл, а объем раствора высаливающего агента 0,3 мл.
После оптимизации условий были определены аналитические характеристики методики. Для всех аналитов градуировочная зависимость была линейна в диапазоне от 0,3 до 20 мг/кг, а предел обнаружения (3σ) составил 0,1 мг/кг. Производительность методики составила 9 образцов в час. Разработанная методика была применена для анализа проб меда, предварительно растворенного в дистиллированной воде. По сравнению с существующими методиками ВЭЖХ [Wang L., Peng J., Liu L. Anal. Chim. Acta 630(1) (2008) 101–106] и хемилюминесцентного определения [Rodrıguez-Dıaz R.C., Aguilar-Caballos M.P., Gómez-Hens A. Anal. Chim. Acta 494(1) (2003) 55–62] предложенный метод позволяет автоматизировать стадию пробоподготовки, а линейный диапазон и предел обнаружения являются сопоставимыми. Следует отметить, что для проведения извлечения требуется всего 50 мкл н-октиламина, который был впервые предложен в качестве экстрагента для мицеллярной экстракции.
На следующем этапе проекта была подтверждена возможность in-situ генерирования ионных ПАВ для мицеллярно-опосредованного извлечения аналитов (синтетических красителей) из твердофазных проб (соленая рыба и специи). В качестве экстрагентов для извлечения ряда судановых красителей (Судан I, Судан II и Судан III) из твердофазных проб была изучена возможность применения высших карбоновых кислот, проявляющих свойства экстрагентов с переключаемой гидрофильностью [Vakh C. et al. Anal. Chim. Acta 907 (2016) 54–59]. В зависимости от рН раствора экстрагент проявляет гидрофильные или гидрофобные свойства. Схема пробоподготовки твердофазных проб пищевых продуктов включала две основные стадии. На первой стадии происходит конверсия нерастворимой в воде карбоновой кислоты при ее введении в водную щелочную суспензию пробы. При этом происходит образование водорастворимой соли карбоновой кислоты, выступающей в качестве анионного ПАВ, и процесс мицеллярного-опосредованного извлечения (МОИ) аналитов из пробы в ультразвуковом (УЗ) поле при нагревании. Использование МОИ является эффективной альтернативой применению органических растворителей для процесса извлечения. В данном случае раствор ПАВ, концентрация которого выше его критической концентрации мицеллобразования используется в качестве экстрагента. При такой концентрации молекулы ПАВ образуют мицеллы, которые способны извлекать из пробы целевые аналиты, предпочтительно неполярные. На второй стадии для последующего отделения аналитов от суспензии и концентрирования в систему вводится раствор минеральной кислоты. Уменьшение рН вызывает переход гидрофильной формы карбоновой кислоты в ее гидрофобную форму и, как следствие, образование дисперсной органической фазы, в которую экстрагируются целевые аналиты. Процесс МОИ в растворители с переключаемой гидрофильностью был впервые применен для пробоподготовки и не представлен в литературе.
Были найдены оптимальные хроматографические условия, обеспечивающие эффективное разделение аналитов и смешиваемость фазы экстрагента с подвижной фазой. Подвижная фаза представляла собой смесь ацетонитрила и метанола, подаваемых в градиентном режиме элюирования. Затем были определены оптимальные условия микроэкстракционного выделения аналитов, массы навесок проб составляли 200 мг, а объем раствора соли высшей карбоновой кислоты (гексановой, пивалевой или олеиновой) – 1 мл. Наибольшие степени извлечения были достигнуты при извлечении в раствор натриевой соли гексановой кислоты (2,5 моль/л) по сравнению с растворами солей пивалевой или олеиновой кислот (Рис. 4). Олеат натрия образовывал осадок, что в дальнейшем влияло на обратную конверсию органической фазы. Пивалевая кислота обладает большей растворимостью по сравнению с гексановой, что снижало коэффициенты распределения. Мицеллообразование в растворах гексаноата натрия (2,5 моль/л) было подтверждено с помощью метода динамического рассеяния света. Коэффициент диффузии для данного раствора составил 2,0х10−6 см2/с, что на порядок меньше, чем для воды (2,3х10−5 см2/с) и свидетельствует о наличии мицелл. Была изучена возможность использования серной, соляной и ортофосфорной кислот для образования органической фазы. Было установлено, что введение раствора серной кислоты обеспечивает максимальную эффективность извлечения красителей и низкие значения среднеквадратического отклонения (СКО) по сравнению с растворами ортофосфорной и соляной кислот. Полученные данные согласуются с рядом Гофмейстера, в соответствии с которым сульфат-ионы обладают максимальным высаливающим эффектом. В связи с этим, для дальнейших исследований использовали раствор серной кислоты. Было необходимо изучить влияние концентрации раствора серной кислоты для обеспечения максимально полной конверсии гексановой кислоты в ее гидрофобную форму. Оптимальная концентрация раствора серной кислоты (объем 0,2 мл) составила 6 моль/л. При более низких концентрациях органическая фаза выделялась неполностью, а при более высоких площади пиков аналитов снижались из-за разбавления. Было исследовано влияние массы навески в диапазоне от 50 до 200 мг для специй и пряностей и соленой красной рыбы. Масса навески, обеспечивающая эффективную экстракцию, составила 200 мг в обоих случаях, а дальнейшее увеличение массы не вело к улучшению получаемых результатов, поскольку была достигнута максимальная степень извлечения аналитов с учетом предельной емкости используемого экстрагента. На заключительном этапе были выбраны оптимальные температура и время нагревания смеси для микроэкстракционного извлечения судановых красителей. Было изучено два способа извлечения красителей из пищевых продуктов: извлечение с воздействием УЗ (130 Вт, 35 кГц) и без. Изучение проводили в диапазоне температур от 20 °C до 70 °C. Установлено, что процесс извлечения аналитов в УЗ-поле является более эффективным. В ходе экспериментов было установлено, что наиболее полное извлечение красителей Судан I-III из рыбы наблюдается при 60 оС, а из специй и пряностей при 70 оС. Оптимальным временем извлечения красителей из соленой рыбы было выбрано 20 мин, из специй и пряностей – 10 мин.
Были построены градуировочные зависимости, определенные следующими выражениями: [Площадь пика] = 2,22.104 [Концентрация Судана I, мкмоль/л], [Площадь пика] = 2,15×104 [Концентрация Судана II, мкмоль/л] и [Площадь пика] = 2,07.104 [Концентрация Судана III, мкмоль/л]. Данные зависимости являлись линейными в диапазоне от 0,45 до 450 мкмоль/л, от 0,06 до 320 мкмоль/л, от 0,30 до 190 мкмоль/л для Судана I, II и III соответственно. Коэффициенты корреляции составили 0,998, 0,999 и 0,998 для Судана I, II и III соответственно. Пределы обнаружения (3σ) составили 0,15 мкмоль/л (0,19 мг/кг), 0,02 мкмоль/л (0,028 мг/кг), 0,10 мкмоль/л (0,18 мг/кг) для Судана I, II и III соответственно. Степени извлечения (коэффициенты концентрирования) составили 85±4 % (3,4±0,2), 84±4 % (3,4±0,2) и 87±3 % (3,5±0,2).
Методика была апробирована на реальных образцах соленой рыбы и специй, а правильность полученных результатов была подтверждена референтным методом (ВЭЖХ-МС/МС). Было обнаружено отсутствие матричных эффектов, что позволяет применять методику для контроля качества пищевых продуктов. В двух исследованных образцах специй были обнаружены Судан I и II на уровне, превышающем предельно допустимые концентрации, установленные в нормативных документах.
Таким образом, в данной работе для пробоподготовки твердофазных объектов анализа было впервые предложено проведение извлечения в мицеллярные растворы солей высших карбоновых кислот. Предложенный метод позволяет значительно сократить объем экстрагента, необходимый для проведения экстракции, а также не требует применения токсичных органических растворителей по сравнению с существующими методиками [Khalikova M.A., Šatínský D., Šmidrkalová T., Solich P., Talanta 130 (2014) 433–441; Zhu Y. et al. Food Chem., 192 (2016), pp. 441–451; Zacharis C.K. et al. Talanta 84 (2011) 480–486]. Разработанный метод сочетает в себе простоту проведения микроэкстракционного процесса с предконцентрированием аналитов и устранением мешающего влияния компонентов матрицы. По результатам работы была опубликована статья в журнале Journal of Molecular Liquids (импакт-фактор 4,513) [Pochivalov A. , Davletbaeva P., Cherkashina K., Lezov A., Vakh C., Bulatov A. J. Mol. Liq. 271 (2018) 807-814].
Далее была впервые изучена возможность миниатюризации процедуры мицеллярно-опосредованного извлечения путем отделения органической фазы на вращающемся мембранном диске. Такой подход был впервые реализован в аналитической химии и позволяет проводить экстракцию в микролитровые объемы экстрагента с переключаемой гидрофильностью, что трудно осуществить в других схемах пробоподготовки. На первом этапе в раствор пробы вводится водный раствор соли высшей карбоновой кислоты и помещается мембранный диск с прикрепленным посередине металлическим стержнем. При этом аналиты извлекаются внутрь мицелл ионного ПАВ. На втором этапе происходит добавление раствора минеральной кислоты, что приводит к образованию гидрофильной эмульсии и концентрированию аналитов в полученную органическую фазу высшей карбоновой кислоты. Далее происходит отделение органической фазы на вращающийся мембранный диск, который приводится в движение под действием магнитной мешалки. После промывки диска водой проводят элюирование метанолом с последующим определением аналитов в элюате методом ВЭЖХ-МС/МС. На основе предложенной схемы была разработана методика определения тетрациклинов (тетрациклин, окситетрациклин и хлортетракциклин) в пробах молока. Перед проведением микроэкстракционного извлечения проводилось осаждение белков путем подкисления пробы и удаление жиров гексаном.
В качестве экстрагентов были исследованы высшие карбоновые кислоты (пивалевая, гексановая и нонановая). Наилучшие результаты показала гексановая кислота, которая обладает, с одной стороны, более низкой растворимостью в воде, чем пивалевая кислота, а с другой стороны, большей полярностью, чем нонановая кислота, что важно при извлечении относительно полярных аналитов (Рис. 5). Концентрацию раствора гексаноата натрия, добавляемого к пробе, варьировали от 1,6 до 3,6 моль/л. Было обнаружено, что оптимальной является концентрация равная 3,2 моль/л, так как при дальнейшем ее увеличении не происходит изменения аналитического сигнала. Влияние диаметра мембранного диска изучали в диапазоне от 6 до 17 мм. Диаметр равный 15 мм обеспечивал полное отделение органической фазы и требовал меньший объем элюента, поэтому был использован в дальнейших исследованиях. Оптимальный объем пробы составил 1 мл, так как при больших объемах не наблюдалось образования гидрофильной эмульсии при подкислении. Время, требуемое для отделения органической фазы на вращающемся мембранном диске, составило 5 мин, при дальнейшем его увеличении площади пиков оставались неизменными. В качестве элюентов были изучены метанол, ацетонитрил и растворы гидроксида натрия и соляной кислоты (0,5 моль/л). При элюировании метанолом наблюдались наибольшие площади пиков. Объем метанола, необходимый для элюирования, был также исследован и составил 0,1 мл. Использование больших объемов приводило к нежелательному разбавлению. Время элюирования варьировали в диапазоне от 2 до 15 мин. Было обнаружено, что для полного элюирования необходимо 5 мин. Разработанная методика позволяет провести концентрирование аналитов до 10 раз. По результатам работы была опубликована статья в журнале Journal of Chromatography A (импакт-фактор 3,858) [Lebedinets S., Vakh C., Cherkashina K., Pochivalov A., Moskvin L., Bulatov A. J. Chrom. A, 1615 (2020) 460743].
Высшие карбоновые кислоты были применены в качестве экстрагентов с переключаемой гидрофильностью в различных методах, предполагающих фазовое разделения путем центрифугирования [Shih H., Shu T., Ponnusamy V.K., Jen J. Anal. Chim. Acta 854 (2015) 70–77], образования газовой фазы [Vakh C. et al. Anal. Chim. Acta 907 (2016) 54–59], удерживания фазы экстрагента на колонке с гидрофобным сорбентом [Shishov A. et al. Talanta 181 (2018) 359–365] или ее замораживания [Hu L. et al. J. Chromatogr. A 1472 (2016) 1–9]. Недостатком данных схем является невозможность извлечения в фазу экстрагента, имеющую объем несколько микролитров в связи с возникающими трудностями с отбором фазы. Предложенный метод направлен на решение данной проблемы, так как он позволяет экспрессно проводить экстракцию в микролитровые объемы экстрагента (5 мкл и менее) с последующим отделением фазы экстрагента на мембранном диске, что выгодно отличает его от известных методов.
В ходе дальнейшей реализации проекта был предложен новый экстрагент для мицеллярной микроэкстракции из класса фосфорорганических кислот – ди-(2-этилгексил)фосфорная кислота. Было установлено, что данный растворитель подобно высшим карбоновым кислотам способен образовывать изотропные растворы при диссоциации в щелочной среде. Повышение кислотности вызывало образование органической фазы, экстрагирующей аналиты, при этом разделение фаз происходило самопроизвольно без необходимости центрифугирования. Данное преимущество позволило разработать автоматизированную схему, которая предполагает проведение микроэкстракционного выделения и концентрирования сульфаниламидов в камере шприцевого насоса проточного анализатора в режиме on-line (рис. 6). Такой подход отличается простотой и экспрессностью, так как проточная система состоит только из шприцевого насоса, оснащенного специальной магнитной мешалкой, который помимо своей основной функции обеспечивает протекание всех стадий процесса в расположенной внутри смесительной камере, и восьмиходового крана-переключателя. Сначала в камеру шприцевого насоса последовательно отбирались 1,5 мл щелочного раствора пробы (С (NaOH) = 0,4 моль/л), 175 мкл экстрагента и 1,5 мл щелочного раствора пробы (С (NaOH) = 0,4 моль/л). Далее в течение 15 с осуществлялось перемешивание с помощью магнитной мешалки до получения изотропного раствора ди-(2-этилгексил)фосфата натрия в пробе. В ходе этого процесса происходила солюбилизация аналитов внутрь мицеллярных агрегатов. Затем посредством шприцевого насоса отбиралось 210 мкл раствора серной кислоты (3 моль/л) при перемешивании магнитной мешалкой, вследствие чего происходило выделение и концентрирование аналитов в образующуюся органическую фазу фосфорорганической кислоты. Далее водная фаза направлялась на сброс, а органическую фазу переносили в хроматографическую виалу для последующего ВЭЖХ-УФ анализа.
На первоначальном этапе была обоснована возможность применения ди-(2-этилгексил)фосфорной кислоты для поставленной аналитической задачи. С этой целью экстрагенты разных классов были изучены с точки зрения их способности извлекать целевые аналиты из водных растворов при соотношении органической и водной фаз равном 1:5. Было обнаружено, что для неполярных растворителей (насыщенные и ароматические углеводороды, полностью галогенированные алканы) степени извлечения составили не более 5%, в то время как для относительно полярных растворителей (жирные спирты и кислоты, этилацетат) - от 20 до 70%, что соответствует природе аналитов, представляющих собой амфотерные соединения. Ди-(2-этилгексил)фосфорная кислота показала наилучшие результаты среди всех исследованных экстрагентов, что отражает целесообразность ее применения в данном исследовании.
Для дальнейшей работы представлялось важным подобрать условия хроматографического определения аналитов, а именно, состав подвижной фазы, обеспечивающий смешиваемость с фазой экстракта, и удовлетворительное разделение сульфаниламидов (сульфаметазина и сульфаметоксазола), а также длину волны поглощения для детектирования. Была исследована серия подвижных фаз, состоящих из органического модификатора (метанол, ацетонитрил) и фосфатного буферного раствора (рН от 6.0 до 8.0, концентрация от 20 до 50 мМ). Удовлетворительные результаты были получены для подвижной фазы, состоящей из метанола и 50 мМ фосфатного буферного раствора (рН 8.0). Элюирование осуществлялось в градиентном режиме, благодаря чему сначала осуществлялась диссоциация экстрагента в щелочной среде и его удаление из колонки, а затем разделение аналитов с их последующим детектированием. Оптимальная длина волны поглощения, соответствующая максимальной чувствительности, составила 263 нм.
Следующим этапом явилась оптимизация условий микроэкстракционного концентрирования аналитов. Объем экстрагента варьировали в диапазоне от 150 до 250 мкл. Оптимальный объем составил 175 мкл, так как он обеспечивал наибольший аналитический сигнал, а при дальнейшем увеличении объема влияние разбавления органической фазы преобладало. В качестве кислот, вызывающих фазовое разделение, были изучены соляная, серная и ортофосфорная. Существенных различий в величине хроматографических пиков не наблюдалось, поэтому для дальнейших экспериментов выбрали серную кислоту, так как в этом случае требуется наименьшая концентрация реагента. Учитывая амфотерные свойства аналитов, важным является объем раствора минеральной кислоты, добавляемый к изотропному раствору, так как он будет оказывать влияние на форму существования аналитов в растворе. Было обнаружено, что наиболее эффективное извлечение аналитов происходит при добавлении эквимолярного количества серной кислоты (210 мкл, 3 моль/л), в связи с их переходом в протонированные формы в кислых средах (рис. 7). Для достижения наивысших коэффициентов концентрирования варьировали объем пробы, и на основании полученных результатов было выявлено, что при увеличении объема пробы аналитические сигналы возрастают. В качестве оптимального объема выбрали 3 мл, что обусловлено ограничениями размеров камеры шприцевого насоса. Коэффициенты концентрирования составили 7,8±0,4 и 3,4±0,2 для сульфаметоксазола и сульфаметазина соответственно.
Предложенный метод лег в основу методики ВЭЖХ-УФ определения сульфаниламидов в меде. Диапазоны определяемых концентраций составили 40-1500 мкг/кг и 15-2000 мкг/кг, а пределы обнаружения 12 и 5 мкг/кг для сульфаметоксазола и сульфаметазина соответственно. Производительность методики составила 12 образцов в час. Полученные результаты были подтверждены референтным методом (ВЭЖХ-МС/МС). Разработанный метод по сравнению с представленными в литературе [Zhang et al. Trends Anal. Chem. 110 (2019) 344–356] обладает такими преимуществами, как экспрессность, автоматизация стадии пробоподготовки и низкий расход реагентов, не уступая при этом в чувствительности. Кроме того, в данной работе был исследован новый экстрагент для мицеллярной микроэкстракции.
Еще одним направлением работы явилась твердофазная экстракция, которая позволяет эффективно выделять целевые аналиты, устраняя матричные эффекты. Несмотря на то, что твердофазная экстракция нашла широкое применение для анализа пищевых продуктов, она требует использования дорогостоящих картиджей и больших объемов органических растворителей. Магнитная дисперсионная твердофазная микроэкстракция является одним из видов твердофазной микроэкстракции и предполагает диспергирование магнитных наночастиц в растворе пробы, что позволяет сократить время сорбции и объем элюента. Отделение сорбента от образца происходит под действием внешнего магнитного поля [Andrade-Eiroa A. et al., Trends Anal. Chem. 80 (2016) 641–654]. Магнитные наночастицы на основе магнетита имеют большую площадь поверхности, которая обеспечивает высокую сорбционную емкость и относительно короткое время экстракции, однако они характеризуются низкой стабильностью и склонны к агломерации. Для устранения данных недостатков и повышения эффективности сорбции применяется модификация наночастиц различными поверхностно-активными веществами [Herrera J.G.S.A.V., Hernández-Borges H.C.F.J., LC GC Eur. 29(4) (2016) 180–193].
В данной работе для извлечения тетрациклинов (тетрациклин, окситетрациклин и доксициклин) впервые были изучены магнитные наночастицы на основе магнетита, модифицированные различными катионными (додецилтриметиламмоний бромид, додецилпиридиний бромид, цетилтриметиламмоний бромид), анионными (додецилсульфат натрия, октилсульфат натрия) и неионогенными (Тритон Х-100, Твин 80) поверхностно-активными веществами. В результате была продемонстрирована возможность прямой модификации магнитных наночастиц поверхностно-активными веществами с целью их стабилизации. Стоит отметить, что предложенная схема является более простой и экспрессной (10 мин) по сравнению с разработанными ранее методиками, включающими магнитную твердофазную микроэкстракцию тетрациклинов (от 1 до 36 ч) [Rodriguez J. A. et al., Microchim. Acta 171(3) (2010) 407–413; Kaewsuwan W., Kanatharana P., Bunkoed O., J. Anal. Chem. 72(9) (2017) 957–965]. Было установлено, что магнитные наночастицы на основе магнетита с поверхностью модифицированной цетилтриметиламмоний бромидом обеспечивают наиболее эффективное выделение тетрациклинов (рис. 8), поэтому такой способ модификации был выбран в качестве оптимального. На основании экспериментальных данных можно заключить, что сорбция осуществляется за счет гидрофильных взаимодействий аналитов с поверхностью наночастиц и гидрофобных взаимодействий между неполярными частями молекул аналитов и цетилтриметиламмония бромида, который имеет достаточно низкое значение гидрофильно-липофильного баланса (7,3) за счет своих гидрофобных свойств, и в наибольшей мере способствует сорбции тетрациклинов.
Первоначально были найдены оптимальные условия ВЭЖХ-МС/МС анализа. Оптимальный состав подвижной фазы представлял собой смесь ацетонитрила и водного раствора муравьиной кислоты (0,1%) в градиентном режиме элюирования. В режиме мониторинга множественных реакций для каждого аналита были определены по два перехода для качественного и количественного анализа, а также значения инструментальных параметров, обуславливающих наибольшую чувствительность. С целью получения наилучших аналитических характеристик были оптимизированы условия сорбции и элюирования. Оптимальное количество сорбента при объеме пробы равном 1 мл составило 10 мг, а время сорбции – 10 минут, так как при дальнейшем увеличении массы сорбента и длительности процесса не наблюдалось изменений аналитического сигнала. В качестве элюентов были изучены полярные органические растворители (метанол, ацетонитрил) и водные растворы хелатирующих агентов (ЭДТА, лимонная кислота, оксиэтилидендифосфоновая кислота). Последние наилучшим образом элюировали аналиты, и в качестве элюента был выбран раствор оксиэтилидендифосфоновой кислоты. Минимальная концентрация хелатирующего агента в элюенте, достаточная для эффективного элюирования, составила 0,1 моль/л. В качестве объекта анализа было выбрано детское питание, так как контроль качества данного продукта представляет интерес в целях обеспечения его безопасности для потребителей. Перед проведением концентрирования с помощью магнитных наночастиц проводили извлечения аналитов в 20% водный раствор изопропилового спирта в ультразвуковом поле в течение 3 мин. Оптимальный объем навески пробы составил 250 мг.
Предложенный метод был успешно применен для ВЭЖХ-МС/МС анализа проб детского питания. Результаты были подтверждены с помощью референтного метода (ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием). Диапазоны определяемых содержаний составили 3-1000 мкг/кг для тетрациклина и 7-1500 мкг/кг для окситетрациклина и доксициклина. Пределы обнаружения были равны 1 и 2 мкг/кг, соответственно. Преимуществами разработанного метода является экспрессная процедура модификации сорбента, высокая эффективность сорбции и проведение элюирования без использования токсичных органических растворителей с помощью водных растворов хелатирующих агентов. Таким образом, предложенный метод является альтернативой представленным в литературе методам определения тетрациклинов в пищевых продуктах [Pérez-Rodrígueza M. et al., Talanta 182 (2018) 1–21].

3

Заключение
По результатам выполненной НИР можно сделать следующие выводы:
1. Был разработан новый метод автоматизированного предконцентрирования аналитов из пищевых продуктов на принципах сочетания проточного анализа и мицеллярной микроэкстракции. Для реализации метода изучена и обоснована возможность применения первичных аминов в качестве экстрагентов, образующих мицеллярные растворы. Возможности метода подтверждены на примере ВЭЖХ-УФ определения тетрациклинов в пробах меда с предварительным автоматизированным предконцентрированием.
2. Была реализована идея получения ионных ПАВ в режиме in-situ для мицеллярно-опосредованного извлечения аналитов из твердофазных объектов. Предложенная схема пробоподготовки основана на ионизации высшей карбоновой кислоты в щелочной суспензии пробы с последующим извлечением аналитов в образующуюся мицеллярную фазу. Разработанный метод пробоподготовки лег в основу схемы ВЭЖХ-УФ определения синтетических красителей в пищевых продуктах.
3. Была предложена схема миниатюризации процедуры мицеллярно-опосредованного извлечения путем отделения образующейся фазы на вращающийся пористый гидрофобный мембранный диск. Схема позволяет существенно сократить объемы экстрагента и увеличить коэффициенты концентрирования целевых аналитов. На основе предложенной схемы была разработана методика ВЭЖХ-МС/МС определения антибиотиков группы тетрациклинов в пищевых продуктах.
4. Разработана автоматизированная схема on-line микроэкстракционного выделения и концентрирования аналитов из жидких пищевых продуктов, предполагающая проведение всех стадий экстракционного процесса непосредственно в камере шприцевого насоса. Такой подход позволяет повысить экспрессность анализа и упростить процедуру пробоподготовки. Кроме того, в качестве нового экстрагента для мицеллярной микроэкстракции был предложен растворитель из класса фосфорорганических кислот. Предложенный метод нашел применение для ВЭЖХ-УФ определения сульфаниламидов в меде.
5. Для магнитной дисперсионной твердофазной микроэкстракции тетрациклинов были впервые получены магнитные наночастицы, стабилизированные поверхностно-активными веществами и обеспечивающие эффективную сорбцию аналитов. Процесс модификации наночастиц не требует дополнительной подготовки поверхности сорбента и протекает значительно быстрее по сравнению с ранее предложенными способами модификации. Разработанная схема легла в основу методики ВЭЖХ-МС/МС определения тетрациклинов в образцах детского питания.
Заявленный план исследований реализован в полном объёме, все идеи и замыслы отражены в докладах и публикациях. Данный проект был направлен на решение фундаментальной научной проблемы - автоматизацию и миниатюризацию методов пробоподготовки. Предложенные в ходе выполнения НИР решения могут быть успешно применены для эффективного, экономически выгодного и безопасного контроля качества пищевых продуктов.
Автоматизация химического анализа, в том числе стадии пробоподготовки, представляет собой один из трендов современной аналитической химии. Существующие подходы к автоматизации мицеллярной микроэкстракции, основанные на принципах проточно-инжекционного [Li Y., Hu D., Jiang Z. Anal. Chim. Acta 576 (2006) 207–214] и мультинасосного проточного [Frizzarin R.M., Rocha F.R.P. Anal. Chim. Acta 820 (2014) 69–75] анализа, а также на применении камеры шприцевого насоса как экстракционной емкости [Frizzarin R.M., Portugal L.A., Estela J.M., Rocha F.R.P., Cerda V. Talanta 148 (2016) 694–699], сосредоточены в основном на определении неорганических аналитов в природных водах и биологических жидкостях. Кроме того, применяемые ПАВ (например, Triton X-114) образуют вязкие изотропные растворы и мицеллярные фазы, что обуславливает трудности при их перемещении по каналам проточной системы, а также необходимость внедрения в гидравлическую схему микроколонок или фильтров для фазового разделения. В данном проекте были предложены новые мицеллярные системы на основе первичных аминов и солей фосфорорганических кислот, которые обладают низкой вязкостью и характеризуются самопроизвольным фазовым разделением, что позволило успешно применить их для проведения мицеллярной микроэкстракции в рамках проточного анализа. Были разработаны две принципиальные гидравлические схемы проточных систем. Первая из них основана на принципах циклического инжекционного анализа и обеспечивает экспрессное выполнение всех необходимых операций (смешение раствора пробы и амина, введение раствора высаливающего агента, разделение фаз, отбор мицеллярной фазы) для проведения микроэкстракционного извлечения. Во второй схеме была реализована идея проведения экстракционного процесса в камере шприцевого насоса, где осуществлялось образование изотропного раствора ПАВ в пробе, инициирование образования органической фазы путем изменения кислотности и фазовое разделение. Аналитические возможности разработанных систем были успешно продемонстрированы на примерах определения тетрациклинов и сульфаниламидов в пробах пищевых продуктов (молоко, мед) методом ВЭЖХ-УФ.
Следующим направлением работы явилась разработка метода мицеллярно-опосредованного извлечения гидрофобных аналитов из твердофазных пищевых продуктов. В качестве экстрагентов были изучены высшие карбоновые кислоты, которые ранее нашли применение как растворители с переключаемой гидрофильностью [Shih H.-K., Shu T.-Y., Ponnusamy V. K., Jen J-F., Anal. Chim. Acta 854 (2015) 70–77; Vakh C. et al. Anal. Chim. Acta 907 (2016) 54–59]. Принципиальным отличием предложенной схемы является проведение жидкостной экстракции из твердофазного образца в изотропный раствор соли высшей карбоновой кислоты. При последующем подкислении раствора происходит концентрирование аналитов в органическую фазу образующейся высшей карбоновой кислоты. Такой подход был успешно применен для ВЭЖХ-УФ определения синтетических красителей в пробах специй и соленой рыбы [Pochivalov A. , Davletbaeva P., Cherkashina K., Lezov A., Vakh C., Bulatov A. J. Mol. Liq. 271 (2018) 807-814].
С целью миниатюризации стадии пробоподготовки была предложена схема мицеллярно-опосредованного извлечения аналитов с последующим отделением образующейся фазы на вращающемся мембранном диске [Lebedinets S., Vakh C., Cherkashina K., Pochivalov A., Moskvin L., Bulatov A. J. Chrom. A, 1615 (2020) 460743]. Несмотря на то, что растворители с переключаемой гидрофильностью нашли применение для решения широкого круга аналитических задач, проведение извлечения в микролитровые объемы экстрагента до сих пор представляет собой сложную задачу из-за трудностей с отбором органической фазы [Hu L. et al., J. Chromatogr. A 1472 (2016) 1–9; Shishov A. et al., Talanta 181 (2018) 359–365]. Возможной альтернативой является мембранная жидкостная микроэкстракция, однако процесс диффузии аналитов в фазу экстрагента, расположенную в порах мембраны, является кинетически замедленным [Pochivalov A., Timofeeva I., Vakh C., Bulatov A., Anal. Chim. Acta 976 (2017) 35–44]. Предложены подходы для ускорения массопереноса за счет вращения импрегнированной мембраны, но замедленная кинетика процесса сохраняется, и экстракция протекает более 30 минут [Sajid M., Basheer C., Daud M., Alsharaaet A., J. Chromatogr. A 1489 (2017) 1–8]. Разработанная схема предполагает извлечение аналитов в мицеллы анионного ПАВ с их последующим концентрированием в органическую фазу, выделяющуюся после подкисления. Отделение органической фазы на вращающемся мембранном диске позволяет проводить экстракцию в несколько микролитров экстрагента, обеспечивая высокие коэффициенты концентрирования. При этом микроэкстракционный процесс протекает быстро (5 мин), что устраняет недостатки ранее представленных в литературе методов. Разработанный метод лег в основу методики ВЭЖХ-МС/МС определения тетрациклинов в пробах молока.
Магнитные наночастицы нашли применение в магнитной дисперсионной твердофазной микроэкстракции как эффективные сорбенты, что обусловлено большой площадью поверхности и возможностью магнитной сепарации. Тем не менее, они склонны к агрегированию, в результате чего может наблюдаться ухудшение их магнитного поведения и снижение адсорбционной емкости [J.G.S.A.V. Herrera, H.C.F.J. Hernández-Borges, LCGC Eur. 29 (4) (2016) 180-193]. Для стабилизации магнитных наночастиц обычно проводят модификацию их поверхности. К настоящему времени было предложено несколько типов модифицированных магнитных наночастиц на основе магнетита для сорбции тетрациклинов из проб воды и пищевых продуктов. Зачастую, наночастицы покрывают слоем силикагеля, который затем дополнительно модифицируют [W. Kaewsuwan, P. Kanatharana, O. Bunkoed, J. Anal. Chem. 72 (9) (2017) 957-965; L. Lian, J. Lili, X. Wang, D. Lou, J. Chromatogr. A 1534 (2018) 1-9]. При этом процесс модификации является достаточно длительным и занимает от 1 до 36 ч. Нами была предложен простой и экспрессный (10 мин) процесс стабилизации и модификации магнитных наночастиц различными катионными, анионными и неионогенными поверхностно-активными веществами с улучшением их сорбционных свойств. Аналитические возможности полученных сорбентов были продемонстрированы при ВЭЖХ-МС/МС определении тетрациклинов в пробах детского питания.