В отличие от нанокомпозитов, к которым, как правило, относят материалы, сформированные за счет введения наноразмерных элементов (наполнителей) в структурообразующую твердую фазу (матрицу), гибридные наноматериалы являются комбинацией различных по составу и типу наноструктур – наночастиц, нанотрубок, молекул и т.п. Интерес к таким неоднородным по составу и структуре материалам определяется новыми свойствами, которые приобретает гибридный материал в результате объединения исходных нанокомпонентов.
Наномедицина предлагает использовать для диагностики и лечения биосовместимые наночастицы (НЧ) размером около 100 нм с различными физическими, химическими и биологическими свойствами. Маленький размер НЧ позволяет преодолевать биологические барьеры, прикрепляться к клеткам и распределяться по всему организму через кровеносную систему. Прогресс в области создания гибридных наноструктур позволяет не только модифицировать поверхность НЧ для высокоспецифического связывания с определенными клетками, но и добавлять новые функциональные свойства, например, возможность измерять температуру непосредственно возле гибридной структуры. Таким образом, биосовместимые наночастицы являются главными кандидатами на роль диагностических и лечебных агентов.
Для диагностики заболевания достаточно измерить температуру, однако для его лечения необходимо иметь возможность управлять этой температурой. Хорошо известно, что повышение температуры выше 43 оС может нанести клетке непоправимый урон и привести к ее гибели. Гипертермия клетки может привести к ее апоптозу или некрозу. Оба процесса приводят к гибели клетки, но при апоптозе клетка распадается на отдельные апоптические тельца, ограниченные целостной плазматической мембраной, а при некрозе мембрана повреждается, что приводит к попаданию продуктов клеточной гибели во внеклеточное пространство. Такой процесс может инициировать воспалительную реакцию в окружающих тканях, что в конечном итоге приводит к накоплению разлагающейся мертвой ткани и остатков клеток. Если апоптоз является контролируемым и запрограммированным процессом клеточной гибели, зачастую благоприятно влияющим на организм, то некроз, как правило, несет за собой опасные побочные эффекты вплоть до летального исхода. На этом основывается метод лечения, называемый гипертермией или фототермической терапией (ФТТ). В работе [Y. Zhang, X. Zhan, J. Xiong. Temperature-dependent cell death patterns induced by functionalized gold nanoparticle photothermal therapy in melanoma cells. Scientific Reports. 2018 г., V. 8, 1] показано, что путь гибели клетки во время фототермической терапии сильно зависит от температуры нагрева пораженных тканей. Так, при температуре 43 °С или ниже большинство клеток в зоне воздействия выживают, что делает терапию в этом диапазоне неэффективной. При нагревании тканей до 49 °С становится слишком большим вклад некроза, представляющего опасность для окружающих здоровых клеток. Таким образом, при фототермической терапии онкологических заболеваний in vivo необходимо поддерживать температуру тканей в месте воздействия в диапазоне 44-48 °С, при этом оптимальное отношение апоптоза и некроптоза к некрозу и избытку выживших клеток наблюдается около 46 °С (рисунок 1). Создание инструмента, который позволил бы осуществлять термометрию самих наночастиц, а не окружающей ткани в среднем, поможет снизить вклад некротических процессов за счет измерения температуры ближайших к наночастице клеток. Снижение вклада некротических процессов необходимо для устранения нежелательных побочных эффектов, что позволит сделать фототермическую терапию более безопасной.
Таким образом для дальнейшего развития фототермической терапии необходима разработка новых гибридных наноструктур, позволяющих проводить локальный нагрев и, при этом, измерять температуру самих нагревательных элементов, а не среднюю температуру нагреваемой ткани.
Основная задача проекта заключается в создании гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур, позволяющих одновременно локально нагревать окружающую среду и осуществлять прецизионный контроль температуры.
Задача включает в себя:
- исследование энергетических спектров порфиринов, определение влияния состава и строения порфиринов на спектры поглощения, возбуждения люминесценци и люминесценции, а так же на температурную зависимость оптических переходов;
- разработку молекулярных люминесцентных термометров на основе порфиринов;
- разработку методики формирования гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур за счет электростатического механизма;
- исследование функциональных свойств гибридных наноструктур: лазерный нагрев наночастиц золота за счет плазмонного поглощения и одновременное измерение температуры гибридных наноструктур с использованием молекулярного люминесцентного термометра в режиме реального времени.
Научная новизна.
Гибридные наночастицы представляют собой класс структур, в которых комбинируются разнородные материалы. Под разнородными материалами часто понимают неорганические (полупроводниковые, магнитные или металлические наночастицы) и органические компоненты (молекулы, полимеры, белки и т.д.). Молекулярно-плазмонные наноструктуры представляют собой гибриды на основе органических молекул и металлических наночастиц, обладающих локализованным поверхностным плазмонным резонансом. Как правило, это частицы типа металлическое ядро-органическая оболочка. Синтез молекулярно-плазмонных наночастиц зависит от компонентов, по большей части от сродства молекулярного компонента к поверхности металла. Полученные гибридные структуры могут быть дополнительно модифицированы, например, их форма меняется под действием света для сдвига полосы резонансного поглощения в нужную область. Самым распространенным металлом для создания молекулярно-плазмонных наночастиц является золото. Это связано с его химической инертностью и, как правило, биосовместимостью. Участие порфиринов во многих жизненно-важных процессах в организме и уникальные оптические свойства делают их многообещающими кандидатами на роль молекулярного компонента молекулярно-плазмонных наноструктур.
Идея создания гибридных молекулярно-плазмонных наночастиц для одновременного прецизионного оптического нагрева и измерения температуры нанонагревателей предлагается в настоящем проекте впервые. Таким образом, данное направление является новым не только для научного коллектива проекта, но и для мирового научного сообщества в целом.
Для достижения поставленной в проекте цели авторы предлагают реализацию оригинальной научной идеи, заключающейся в использовании порфиринов, характеризующихся двумя различными излучательными центрами с различной температурной зависимостью излучения. Таким образом, точность определения температуры при помощи разрабатываемых молекулярных люминесцентных термометров будет не менее 0.2 оС. Авторский коллектив имеет богатый опыт синтеза золотых наночастиц методом лазерной абляции в жидкости, а так же владеет методиками формирования и исследования гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур и их физико-химических и функциональных свойств, что, наряду с имеющимися в Научном парке СПбГУ экспериментальными возможностями, гарантирует достижение поставленной в проекте цели.
Современное состояние исследований по данной проблеме.
Способность точно регистрировать температуру тканей в области воздействия наночастиц является принципиальной задачей для развития фототермической терапии. На сегодняшний день существует ряд методов, позволяющих приблизиться к решению этой задачи. Отдельное направление представляют расчетные методы, которые позволяют вычислить итоговую температуру в области воздействия исходя из различных параметров, таких как форма и размер частиц, мощность и длина волны излучения лазера, глубина проникновения фотонов в ткань [T. Grosges, D. Barchiesi. Gold Nanoparticles as a Photothermal Agent in Cancer Therapy: The Thermal Ablation Characteristic Length. Molecules. 2018 г., V. 23, 6]. Несмотря на то, что расчетные методы на сегодняшний день позволяют учитывать множество факторов, переход от модельных представлений к экспериментам in vivo остается затруднительным.
Экспериментальные методы определения температуры при фототермической терапии можно разделить на инвазивные и неинвазивные. Инвазивные методы термометрии, например, с использованием термопар и оптоволоконных датчиков, могут контролировать температуру окружающей среды опухоли. Однако применение инвазивных методов становится очень ограниченным, когда сама фототерапия проводится внутриклеточно. В настоящее время неинвазивные методы лечения требуют неинвазивного мониторинга в реальном времени, которого можно достичь с помощью магнитно-резонансной термометрии, компьютерной томографии и методов фотоакустической визуализации [C. West, A. Doughty, K. Liu et al. Monitoring tissue temperature during photothermal therapy for cancer. Journal of Bio-X Research. 2019 г., V. 2, 4].
Оптоволоконные сенсоры, такие как флуороптические датчики и волоконные брэгговские решетки, лишены многих недостатков металлических термопар. Флуороптические датчики регистрируют время затухания чувствительных к температуре флуоресцентных материалов, помещенных на волокно. Они работают в широком диапазоне температур (более 100 °C), имеют низкую погрешность (менее 0.2 °C) и короткое время отклика. Основной недостаток таких датчиков – склонность к нагреву из-за покрытия черным пигментом, что приводит к ошибкам измерения, если источник излучения расположен близко к волокну (S. Davidson, A. Vitkin, M. Sherar et al. Characterization of measurement artefacts in fluoroptic temperature sensors: Implications for laser thermal therapy at 810 nm. Lasers in Surgery and Medicine. 2005 г., V. 36, 4).
Самым недорогим и простым в эксплуатации устройством для неинвазивной термометрии является тепловизионная инфракрасная камера. Такие камеры широко используются для мониторинга температуры в реальном времени in vitro и in vivo во время исследований, касающихся фототермической терапии [ F. Zhou, S. Wu, B. Wu et al. Mitochondria‐Targeting Single‐Walled Carbon Nanotubes for Cancer Photothermal Therapy. Small. 2011 г., V. 7, 1]. Тем не менее, применение инфракрасных камер ограничено их способностью регистрировать температуру только на поверхности объектов.
Обычные техники теплового воздействия (микроволновой метод, инфракрасный, ультразвуковой) являются неизбирательными, так как действуют и на здоровые, и на больные ткани. Для повышения эффективности и улучшения избирательности ФТТ необходимо применять нанонагреватели. Нанонагревателями называются наночастицы, способные создавать тепло при определенном внешнем воздействии. Одними из таких нанонагревателей могут выступать наночастицы золота, которые приобрели большой интерес в биомедицинской области из-за их биосовместимости, легкому и универсальному синтезу, а также способности действовать как средства доставки лекарственных препаратов [T. Grosges, D. Barchiesi. Gold Nanoparticles as a Photothermal Agent in Cancer Therapy: The Thermal Ablation Characteristic Length. Molecules. 2018 г., V. 23, 6].
Одной из важнейших задач ратиометрических сенсоров является создание на их основе люминесцентных молекулярных термометров – аналитических инструментов нового поколения. С их помощью можно бесконтактно и неинвазивно измерять температуру в различных системах, в том числе in vivo. Люминесцентный сигнал обеспечивает высокую чувствительность даже при измерении температуры очень маленьких объектов. Принцип работы большинства ратиометрических люминесцентных термометров, как и ратиометрических сенсоров для других задач, основан на сравнении интенсивности излучения на двух разных длинах волн. Зависимость от температуры спектров излучения ратиометрических люминесцентных молекулярных термометров можно разделить на три типа (рисунок 2) [S. Uchiyama, C. Gota. Luminescent molecular thermometers for the ratiometric sensing of intracellular temperature. De Gruyter. 2016 г., V. 36, 1].
Порфирины и порфириновые диады являются перспективными системами для ратиометрических измерений, в частности, для создания на их основе молекулярных люминесцентных термометров. перспективность молекулярно-плазмонных систем золотые наночастицы/порфирин была теоретически отмечена в работе [ N. Hlapisi, T. Motaung, L. Linganiso et al. Encapsulation of Gold Nanorods with Porphyrins for the Potential Treatment of Cancer and Bacterial Diseases: A Critical Review. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2019 г., V. 1, 27]. Это подтверждает важность поиска и исследования новых систем золотые наночастицы/порфирин для потенциального применения в фотодинамической терапии.
Подавляющее большинство исследований, рассматривающих систему золотые наночастицы/порфирин, опубликовано в течение последних трех лет, что указывает на актуальность темы. На сегодняшний день существует множество работ, где данные структуры изучают как перспективные для применения в самых различных областях, таких как спектроскопия поверхностно-усиленного комбинационного рассеяния света [M. Trapani, M. Castriciano, A. Romeo et al. Nanohybrid Assemblies of Porphyrin and Au10 Cluster Nanoparticles. Nanomaterials. 2019 г., V. 9, 7], фотокатализ [Y. Wang, H. Yang, S. Chen et al. Fabrication of Hybrid Polymeric Micelles Containing AuNPs and Metalloporphyrin in the Core. Polymers. 2019 г., V. 11, 3], биовизуализация [ S. Li, X. Shen, Q. Xu et al. Gold Nanorods Enhanced Conjugated Polymer/Photosensitizer Composite Nanoparticles for Simultaneous Two-photon Excitation Fluorescence Imaging and Photodynamic Therapy. Nanoscale. 2019 г., V. 11, 41], целевая доставка лекарств [K. Bera, S. Maiti, M. Maity et al. Porphyrin–Gold Nanomaterial for Efficient Drug Delivery to Cancerous Cells. ACS Omega. 2018 г., V. 3, 4], создание pH-сенсоров [P. Mineo, A. Abbadessa, A. Rescifina et al. PEGylate porphyrin-gold nanoparticles conjugates as removable pH-sensor nano-probes for acidic environments. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and . 2018 г., V. 546], маркеров для иммуноферментного анализа [M. Wang, S. Meng, M. Gu et al. An Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for C-Reactive Protein Based on Gold Nanoparticles@Metal Porphyrin Porous Compound. Journal of Biomedical Nanotechnology. 2019 г., V. 15, 10], антибактериальных составов [ L. Salageanu, D. Muntean, M. Licker et al. Symmetrical and asymmetrical meso-substituted porphyrins and zn-metalloporphyrins in gold colloid environment. Optical properties and evaluation of antibacterial activity. Farmacia. 2020 г., V. 68, 2], колориметрических иммуносенсоров [Y. Zhou, X. Huang, W. Zhang et al. Multi-branched gold nanoflower-embedded iron porphyrin for colorimetric immunosensor. Biosensors and Bioelectronics. 2018 г., V. 102, 15], солнечных батарей [Y. Wang, H. Yang, S. Chen et al. Fabrication of Hybrid Polymeric Micelles Containing AuNPs and Metalloporphyrin in the Core. Polymers (Basel). 2019 г., V. 11, ], катализаторов окисления глюкозы [K. Elouarzaki, A. Le Goff, M. Hoizinger et al. From gold porphyrins to gold nanoparticles: catalytic nanomaterials for glucose oxidation . Nanoscale. 2014 г., V. 6, 15], а также сенсоров ДНК [B. Kaur, K. Malecka, D. Cristadli et al. Approaching single DNA molecule detection with an ultrasensitive electrochemical genosensor based on gold nanoparticles and cobalt-porphyrin DNA conjugates. Chemical Communications. 2018 г., V. 54, 79], анионов солей [J. Santos, S. Toma, R. Yatsuzuka et al. Gold Nanoparticle/Tetrapyridylporphyrin Hybrid Material: Spectroscopic and Electrocatalytic Properties and Sensor Application. Journal of the Brazilian Chemical Society. 2020 г., V. 31, 11], катехола [L. Sousa, L. Vilarihno, G. Ribeiro et al. An electronic device based on gold nanoparticles and tetraruthenated porphyrin as an electrochemical sensor for catechol. Royal Society Open Science. 2017 г., V. 4, 12] и токсичности диклофенака [A. Palade, A. Lascu, I. Fringu et al. Comparative diclofenac detection for chronic toxicity levels using water soluble Zn-metalloporphyrin, gold nanoparticles and their hybrid. Farmacia. 2018 г., V. 66, 3].
На сегодняшний день не существует гибридных наносистем, позволяющих осуществлять одновременный локальный нагрев тканей и измерение температуры в области воздействия посредством молекулярной люминесцентной термометрии. Современные способы термометрии при фототермической терапии ограничиваются измерением средней температуры ткани, а не самих золотых наночастиц, в результате чего ближайшие к наночастицам клетки могут перегреваться и вносить свой вклад в некротические процессы. Кроме того, имеющиеся в настоящее время методы контроля температуры либо инвазивные, либо дорогостоящие, либо не обладают достаточной точностью. Молекулярно-плазмонные наноструктуры на основе порфиринов и золотых наночастиц могут позволить измерять температуру тканей при фототермической терапии неинвазивно, бесконтактно, прецизионно, а создание самих систем и процесс регистрации температуры не требуют больших финансовых затрат.
Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта.
Проект направлен на решение одной из задач в области разработки молекулярно-плазмонных наноструктур био-медицинского назначения, а именно, на разработку люминесцентных молекулярных термометров, обладающих высокой точностью бесконтактного измерения температуры непосредственно в области проведения фототермической терапии.
Проведение научно-исследовательской разработки люминесцентных молекулярных структур для задач фототермической терапии планируется по технологии «снизу-вверх», которая подразумевает синтез и изучение отдельных фрагментов и последовательное объединение в гибридную структуру. Непосредственная сборка сопровождается исследованием электронно-возбужденных состояний порфиринов.
Реализация проекта рассчитана на два года.
Первый год посвящен исследованию водорастворимых порфиринов, наночастиц золота и гибридных наноструктур на их основе.
1. Строение используемых порфиринов будет установлено совокупностью спектроскопических методов: спектроскопией ЯМР, КРС и ИК, масс-спектрометрией высокого разрешения.
2. Порфирины будут исследованы оптическими методами для определения их энергетических спектров, времени жизни возбужденных состояний и квантового выхода люминесценции, в том числе: спектроскопия поглощения, спектроскопия люминесценции, спектроскопия возбуждения люминесценции, кинетические измерения интенсивности люминесценции, прямой метод измерения квантового выхода люминесценции с использованием интегрирующей сферы.
3. Наночастицы золота планируется синтезировать методом лазерной абляции в жидкости (в данном случае в воде). Преимуществами данного метода являются высокая химическая чистота (в коллоидном растворе нет абсолютно никаких примесей), что особенно важно для дальнейшего формирования гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур, и возможность получать наночастицы различного размера в зависимости от параметров лазерного излучения, что позволяет изменять положение максимума плазмонного поглощения в сторону ИК диапазона.
4. Коллоидные растворы наночастиц золота будут исследованы методами динамического светорассеяния и дзета потенциала, а так же электронной микроскопии и энергетической дисперсии, что позволит получить данные о распределении наночастиц по размерам, состав и величину потенциала двойного слоя, характеризующего стабильность коллоидного раствора.
5. Формирование гибридных наноструктур планируется осуществлять за счет электростатического механизма взаимодействия и контролировать методом тушения люминесценции. Для этого будут построены зависимости люминесценции порфиринов от концентрации золотых наночастиц в координатах Штерна-Фольмера и определены константы связывания, а так же измерены времена жизни возбужденных состояний порфиринов для определения типа тушения. Если время жизни зависит от концентрации тушителя, то тушение динамическое, т.е. определяется столкновительными процессами порфиринов и золотых наночастиц. Если время жизни не меняется, то тушение статическое, т.е. все молекулы порфирина связались с наночастицами золота, сформировав гибридные наноструктуры.
6. Измерение температуры гибридных наночастиц будет осуществляться ратиометрическим люминесцентным методом.
В результате выполнения работ первого года панируется получение следующих результатов:
- Результаты исследования электронно-возбужденных состояний синтезированных порфиринов.
- Результаты изучения функциональных свойств синтезированных порфиринов для реализации ратиометрической люминесцентной термометрии. Полученные данные будут использованы для выбора порфиринов, перспективных для формирования порфириновых диад в качестве люминесцентных термометров.
- Экспериментальные образцы гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур на основе золотых наночастиц и водорастворимых порфиринов.
- Калибровочные кривые измерения температуры гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур на основе золотых наночастиц и водорастворимых порфиринов.
Второй год проекта направлен на разработку гибридных молекулярных наноструктур на основе золотых наночастиц и двух типов порфиринов.
1. Строение используемых порфиринов будет установлено совокупностью спектроскопических методов: спектроскопией ЯМР, КРС и ИК, масс-спектрометрией высокого разрешения.
2. Порфирины будут исследованы оптическими методами для определения их энергетических спектров, времени жизни возбужденных состояний и квантового выхода люминесценции, в том числе: спектроскопия поглощения, спектроскопия люминесценции, спектроскопия возбуждения люминесценции, кинетические измерения интенсивности люминесценции, прямой метод измерения квантового выхода люминесценции с использованием интегрирующей сферы.
3. Наночастицы золота планируется синтезировать методом лазерной абляции в жидкости (в данном случае в воде).
4. Коллоидные растворы наночастиц золота будут исследованы методами динамического светорассеяния и дзета потенциала, а так же электронной микроскопии и энергетической дисперсии.
5. Формирование гибридных наноструктур планируется контролировать методом тушения люминесценции.
6. Измерние температуры гибридных наночастиц будет осуществляться ратиометрическим люминесцентным методом. Измерения позволят получить калибровочные кривые для измерения температуры.
7. Полученные калибровочные кривые будут использоваться для исследования зависимости температуры гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур от мощности возбуждающего излучения в водной среде и в интралипиде для проверки работоспособности разработанных гибридных наноструктур in vitro.
В результате выполнения работ второго года панируется получение следующих результатов:
- Результаты исследования электронно-возбужденных состояний порфириновых диад.
- Результаты изучения функциональных свойств порфиринов для реализации люминесцентной термометрии.
- Теоретическая модель люминесцентных термометров, в основе которых лежит использование двух типов излучающих центров в паре порфиринов.
- Экспериментальные образцы люминесцентных молекулярных термометров на основе порфиринов.
- Методика синтеза гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур на основе порфиринов и наночастиц золота.
- Экспериментальные образцы гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур на основе порфиринов и наночастиц золота.
- Результаты исследования функциональных свойств люминесцентных молекулярных термометров в составе гибридных молекулярно-плазмонных наноструктур. Полученные результаты будут использованы для создания гибридных наноструктур, обеспечивающих одновременно прецизионный оптический нагрев и регистрацию температуры наноразмерных нагревателей для задач фототермической терапии.
Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту.
Научная группа обладает необходимым для выполнения проекта научным заделом, в том числе по исследованию порфиринов и порфириновых диад [A.A. Strelnikov, D.V. Androsov, A.S. Konev, D.A. Lukyanov, A.F. Khlebnikov, A.V. Povolotskiy, K. Yamanouchi, Triaryl-substituted pyrrolo-p-phenylene-linked porphyrin-fullerene dyads: Expanding the structural diversity of photoactive materials // Tetrahedron, 2018, 74(24), P. 3007–3019, DOI: 10.1016/j.tet.2018.04.084, IF = 2.233; D.A. Lukyanov, L.D. Funt, A.S. Konev, A.V. Povolotskiy, A.A. Vereshchagin, O.V. Levin, A.F. Khlebnikov, Novel homogeneous photocatalyst for oxygen to hydrogen peroxide reduction in aqueous media // Photochemical and Photobiological Sciences, 2019, 18(8), P. 1982–1989, DOI: 10.1039/c9pp00206e, IF = 2.831].
Солдатова Д.А. под научным руководством Поволоцкого А.В. (руководитель проекта) работает над выпускной квалификационной работой магистра, связанной с исследованием оптических свойств наноструктурированных материалов. Кроме того, обучаясь на образовательной программе магистратуры "Фундаментальные и прикладные аспекты наноматериалов и нанотехнологий", Солдатова Д.А. получила опыт синтеза наноразмерных гибридных структур.
Шеремет Т.И. под научным руководством Поволоцкого А.В. (руководитель проекта) работает над выпускной квалификационной работой бакалавра, активно используя методы лазерной спектроскопии с временным разрешением. Освоил оптические методы исследования физико-химических и функциональных свойств наноструктурированных материалов.
