В ходе третьего года выполнения проекта были достигнуты следующие результаты:

1. Оптимизированы и протестированы в растворах искусственного пота индикаторные натрий- и хлорид-селективных оптоды массива
На втором этапе выполнения проекта путем использования теоретических закономерностей, связывающих состав и аналитические характеристики полимерных оптических сенсоров, были отобраны несколько составов, обеспечивающих медиану отклика (точку перегиба, область наибольшей чувствительности) в диапазоне биологических значений pH и активности ионов натрия и хлорида. На третьем этапе выполнения проекта отобранные композиции были апробированы экспериментально.
В качестве матрицы для приготовления градуировочных растворов использовали выбранные на втором этапе выполнения проекта модельные среды, имитирующие потовую жидкость. Оптоды были протестированы в чистых растворах и в модельных образцах потовой жидкости, был оценен гистерезис отклика и его аналитические характеристики. По аналитическим характеристикам и минимальному гистерезису для каждого из модельных составов пота были отобраны по два состава оптодных композиций. В большинстве случаев степени извлечения в образцах составили более 95% в логарифмической шкале, что позволяет сделать вывод о потенциальной применимости исследованных составов для определения катиона натрия и хлорид-аниона при проведении потового теста.

2. Теоретически и экспериментально выявлена роль липофильных электролитов в отклике оптических сенсоров, независимых от фоновой концентрации водного электролита
На основании теоретической модели, разработанной на первом этапе выполнения проекта, был рассчитан отклик систем, содержащих умеренно-липофильный электролит (QB) для создания сенсоров независимого определения pH (оптодов индивидуальной ионной активности). Было показано, что отклик оптода, содержащего умеренно липофильный электролит, не зависит от фоновой активности парного иона I+ при его содержании менее чем 10-2 М. Для этих же систем был смоделирован потенциал на границе фаз раствора и оптодной мембраны. Зависимость межфазного потенциала от активности парного иона для оптодов, содержащих QB, имеет горизонтальный участок, что коррелирует с независимостью оптического сигнала от концентрации фонового электролита.
Предположение о частичной стабилизации межфазного потенциала для оптодов, содержащих липофильный электролит, было подтверждено при помощи родственного класса сенсоров – ионоселективных электродов (ИСЭ). Был теоретически предсказан отклик электродов, состоящих только из пластифицированного ПВХ и соли (либо ионной добавки KTpClPB, либо QB ETH 500 или TBATBB). Для экспериментального подтверждения расчетных данных была исследована стабильность разности потенциалов электродов с добавкой QB со стандартным Ag/AgCl-электродом при ее измерении в растворах с электролитами различной природы и концентрации. Электроды с высоким содержанием QB показали достаточно высокую стабильность по сравнению с электродами с низким содержанием соли. Также было показано, что добавление сухого KCl в мембрану способствует стабилизации межфазного потенциала.
Таким образом, можно сделать вывод, что при внесении в мембрану умеренно липофильного электролита потенциал на границе фаз действительно частично стабилизируется, благодаря чему возможно создание оптодов, чувствительных только к изменению pH раствора.
Было исследовано влияние природы катиона и аниона липофильного электролита на диапазон отклика оптода. Для этого была смоделирована зависимость медианы pH-отклика от липофильности катиона и аниона QB и были экспериментально зарегистрированы зависимости отклика оптодов, содержащих QB с ионами различной липофильности, на pH и содержание фонового электролита в растворе.
Теоретически было показано, что увеличение липофильности катиона Q+ при фиксированном logkB приводит к смещению отклика в более кислую область, а увеличение липофильности аниона B– при постоянном logkQ приводит к сдвигу в сторону более щелочных растворов. Большинство экспериментально изученных оптодных композиций не имело натриевой функции, но при этом все еще имело pH-функцию. Кроме того, диапазон отклика сдвигался в более кислую область при увеличении липофильности электролита.
Так как QB различной природы можно приготовить в мембране in situ, т.е. добавлением аликвот липофильного иона в паре с гидрофильным противоионом, то возможности настройки диапазона отклика сенсоров таким методом значительно выше.

3. Разработаны и протестированы в искусственных и реальных образцах оптоды на основе липофильных электролитов для независимого определения pH
Для исследования применимости таких оптодов для определения pH образцов на практике была приготовлена оптодная композиция, содержащая QB TOctBArF. Данные оптоды были апробированы в модельных образцах методом «введено-найдено». Для всех образцов наблюдалось совпадение в пределах погрешности измеренных потенциометрически и оптически значений рН. Дополнительно была проведена кросс-валидация полученных сенсоров. Результаты кросс-валидации подтверждают результаты апробации методом «введено-найдено».
Для определения возможности применения оптодов в объектах со сложной матрицей была проведена апробация сенсоров в образцах яблочного сока. Было обнаружено совпадение в пределах погрешности результатов потенциометрических и оптических измерений.
Это позволяет говорить о возможности применения модифицированных умеренно липофильными электролитами оптодов в качестве альтернативы классическим потенциометрическим средствам измерений в образцах как с простым составом, так и со сложной матрицей.

4. Отработана методология проведения измерений и анализа данных ЯМР диффузометрии для исследования электролитических и транспортных свойств липофильных электролитов in situ в полимерной сенсорной фазе на примере ИЖ C6MeimNTf2.
Для приближения к количественному соответствию между расчетными и экспериментальными данными было продолжено развитие метода ЯМР-диффузометрии для оценки транспортных (коэффициенты диффузии) и электролитических (степень диссоциации) свойств электролитов в полимерных мембранах. На предыдущем этапе работы было показано, что диффузометрия ЯМР с импульсным градиентом поля применима для исследования таких сложных матриц, как пластифицированные полимеры. На данном этапе работы методология была оптимизирована для применения в ПВХ-мембранах и применена в широком диапазоне концентраций модельного мембранного электролита – ИЖ C6MeimNTf2 – в ПВХ матрицах, содержащих также классический пластификатор ДОС. Немонотонный характер зависимости и порядок полученных значений совпадает с данными, полученными ранее хронопотенциометрическим методом. Максимум коэффициентов диффузии (D = 1.286×10-7 см2/с) и степени диссоциации (α = 90%) находится между 30 и 40 масс.% ИЖ в мембране.

5. Создано устройство для автоматического нанесения сенсоров
Было разработано и протестировано настольное устройство для микропечати, представляющее собой 3D принтер для точной печати капель объёмом от 100 нл. Были достигнуты необходимые параметры воспроизводимости геометрии (менее 4% относительного разброса по площади и менее 2% – по диаметру) и сигнала получаемых пленок (менее 10% разброса). Толщина пленок составляет 5-10 мкм в зависимости от вязкости исходной сенсорной композиции, индивидуальные оптодные пленки имеют диаметр 0.2-0.3 мм. Были оптимизированы протоколы работы с устройством: подготовка поверхности для нанесения, чтобы избежать оседания пыли и накопления статического заряда; заполнение экструдера, позиционирование щупа экструдера по трем координатным осям; настройка управляющего ПО (программы печати). Таким образом были получены массивы оптических сенсоров, имеющих стандартизированные размеры на небольшой площади подложки.

6. Оптимизированы материалы подложки и защитного покрытия сенсорных массивов
Для основы платформы был выбран водонепроницаемый полиуретановый пластырь, т.к. он обладает достаточной прозрачностью для регистрации оптического сигнала контактирующих с кожей оптодов и препятствует испарению потовой жидкости с поверхности кожи. На клейкий слой пластыря наносилась подложка для размещения сенсоров. В качестве материала подложки были исследованы полупрозрачный политетрафторэтилен (TF) толщиной 20 мкм, полипропилен двух типов (PP), полиэтилентерефталат (PET), полиэфир (3М). Для оценки их применимости было изучено взаимодействие носителя с оптодным составом. Для этого оценивалась воспроизводимость спектров поглощения пленок в видимой области на протяжении 12 дней.
Исходя из полученных результатов, был сделан вывод, что наиболее оптимальными материалами для дальнейшего изучения являются полиэфир и тефлон, поскольку для них наблюдается достаточно высокое значение амплитуды сигнала в начале эксперимента и незначительное ее падение в первые дни. Также малое смещение медианы отклика в начальный период является значительным преимуществом, позволяющим использовать данные материалы в дальнейшей работе.
Было исследовано время отклика оптодов на различных подложках. Отклик на полиэтилентерефталате был продолжительным, что связано частичным растворением полимера в тетрагидрофуране, используемом как растворитель в жидком оптодном составе. Для полиэфира время отклика значительно меньше, чем на тефлоне, что связано с лучшей смачиваемостью материала подложки и, соответственно, меньшей толщиной получающейся пленки. В качестве наиболее оптимальных материалов согласно критерию времени отклика были выделена полиэфир и полипропилен.
Для защиты сенсоров от прямого соприкосновения с кожей и загрязнения кожным жиром было предложено использовать защитный гидрофильный слой (мембрану): армированный ацетат целлюлозы, нитроцеллюлозу или поликарбонатную трековую мембрану. Было оценено время отклика оптодов под защитными пленками. Время отклика ожидаемо увеличилось по сравнению с сенсорами без покрытия из-за наличия дополнительной преграды между раствором и оптодной мембраной и составило около 11 мин. Для уменьшения времени отклика оптодов под подложкой была разбавлена непосредственно оптодная композиция, что уменьшило время отклика до 1 мин за счет утончения самих полимерных сенсорных пленок.

7. Массивы индикаторных оптодов протестированы в условиях измерений на коже при помощи смартфона
Массив для безградуировочного определения ионов Na+, Cl- в поте был протестирован непосредственно на кожном покрове. Для этого был сфотографирован участок кожи предплечья и дальнейшие градуировки проводили на его фоне.
Для оценки применимости камеры смартфона было проведено две градуировки с одинаковыми параметрами, но с различными устройствами для фотографирования: цветной камерой микроскопа и мобильным телефоном. Несмотря на произведенную цветокоррекцию, изменение цвета фона по сравнению с белым привело к небольшому увеличению погрешности. Динамический диапазон остался прежним. Чувствительность регистрации смартфоном несколько снижена относительно камеры микроскопа, но в целом регистрация оптического сигнала на коже достаточна для диагностических целей.

8. Полученные безградуировочные устройства были протестированы в образцах биологических жидкостей
Готовый массив сенсоров состоял из градуировочных сенсоров и индикаторных, по которым происходит определение содержания натрия и хлорида в исследуемых образцах. Градуировочные оптоды (стандарты) имели постоянное значение сигнала, не зависящее от содержания аналитов в исследуемых растворах.
Сигнал градуировочных оптодов варьировался незначительно (отклонение до 4%). Отклонения сигнала индикаторных сенсоров были еще меньше и составили менее 1.5 %. Полученные массивы были протестированы для определения содержания аналитов в реальных образцах биологических жидкостей: мочи, разбавленной 0.01 M HEPES, и потовой жидкости. Содержание аналитов было определено при помощи классической градуировочной зависимости для индикаторного оптода, и при помощи встроенной градуировочной шкалы. Для оценки работоспособности градуировочных массивов для определения содержания натрия в образцах без проведения предварительной градуировки индикаторных оптодов была построена корреляция цвета градуировочных оптодов и логарифма концентрации катионов натрия в растворе, исходя из точек пересечения линий отклика градуировочных и индикаторного сенсоров. Содержание катионов натрия в образце, определенное по данной зависимости, оказалось близким к значению, полученному из традиционного градуировочного графика для индикаторных оптодов. Хорошая сходимость полученных значений позволяет сделать вывод о работоспособности методики с использованием массива градуировочных сенсоров без предварительной градуировки индикаторных оптодов.