Сборка векторов для доставки терапевтического гена в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
С помощью методов молекулярного клонирования нами были получены генетические вектора для доставки гена FVIII в альфоиднуюTetO-ИХЧ (конструкции CMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII). Элементы, общие для обоих конструкций – это: ориджин репликации, необходимый для наработки данных векторов в бактериальных клетках; ген устойчивости к ампициллину для отбора на селективной среде бактериальных клонов, содержащих такие плазмиды; сайт loxP для сайт-специфичного встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ; 3’ фрагмент гена гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы (HPRT), который после встраивания векторов в альфоиднуюTetO-ИХЧ в правильной ориентации, обеспечивает восстановление функциональной формы гена HPRT, что позволяет отбирать клоны клеток линии CHO, нокаутные по гену HPRT, но несущие его восстановленную форму в ИХЧ, на селективной НАТ среде (Holliday & Ho, 1998); ген зелёного флуоресцентного белка GFP под контролем повсеместного промотора CAG (Hitoshi et al., 1991), как дополнительный маркер селекции клеток; кДНК гена фактора свёртывания крови VIII; кластеры тДНК в качестве инсуляторов (Ebersole et al., 2011; Lee et al., 2013; Raab et al., 2012), которые фланкируют гены GFP и FVIII, для предотвращения ингибирующего влияния на транскрипцию трансгенов со стороны центрохроматина, после встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
Конструкции различаются между собой по промоторам, контролирующим экспрессию гена FVIII, а именно в векторе pCMV-tDNA-optFVIII – это промотор цитомегаловируса (CMV), а в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII – это повсеместный промотор гена альфа субъединицы фактора элонгации 1 человека (EF1-α). Также в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII между промоторами генов GFP и FVIII, которые расположены в ориентации «голова к голове» находится дополнительный инсулятор cHS4 куриного β-глобулинового кластера генов, необходимый для разграничения их активности.

Встраивание трансгенов в альфоиднуюTetO-ИХЧ с помощью cre/lox-рекомбинации.Генетические векторные конструкции pCMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII были встроены в альфоиднуюTetO-ИХЧ, находящуюся в HPRT-/- клетках линии СНО, с помощью сайт-специфичной Cre/lox-рекомбинации. Для этого HPRT-/- клетки линии СНО, несущие альфоиднуюTetO-ИХЧ, были транфицированы с помощью липофекции вектором pMC-Cre, содержащим ген Cre-рекомбиназы, а также конструкциями pCMV-tDNA-optFVIII или EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII. При встраивании трансгена в альфоиднуюTetO-ИХЧ в правильной ориентации, происходит соединение 3’-фрагмента гена HPRT, находящегося в векторной конструкции с 5’-фрагментом, находящимся в альфоиднойTetO-ИХЧ. После этого в клетках происходит восстановление функции гена HPRT, что позволяет производить отбор клеточных клонов с корректной вставкой трансгена.После Cre/lox – рекомбинации генетического вектора pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII и альфоиднойTetO-ИХЧ, на селективной НАТ-среде нами было отобрано 15 клонов клеток линии СНО, содержащих терапевтическую альфоиднуюTetO-ИХЧ и позитивных по флуоресцентному зелёному GFP-сигналу. С образцами ДНК из этих клеточных клонов был проведен ПЦР анализ, который показал наличие в них гена FVIII под контролем промотора EF1-α. Также с помощью ПЦР анализа было показано, что у 3 из 15 клеточных клонов произошло спонтанное встраивание гена Cre-рекомбиназы в геном, что свидетельствовало о непригодности данных клонов для последующих экспериментов.  Также были получены лизаты всех 15 клонов и проведён Вестерн-блот анализ, который показал, что в 12 клеточных клонах присутствует белковый продукт гена FVIII. На основании этих данных, а также учитывая темпы роста полученных клеточных клонов в культуре, было отобрано 4 клона для оценки автономности терапевтической альфоиднойTetO-ИХЧ. Из данных клеточных клонов были получены препараты метафазных пластинок, которые анализировали с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Было показано, что во всех четырёх клонах терапевтическая альфоиднаяTetO-ИХЧ присутствует в одной копии и находится в автономном состоянии. В результате, для дальнейших экспериментов был отобран клон №2, для которого было отмечено наличие гена FVIII под контролем промотора EF1-α, отсутствие в геномной ДНК спонтанно встроенного гена Cre-рекомбиназы, наличие белкового продукта гена FVIII, автономность терапевтической альфоиднойTetO-ИХЧ и её присутствие в виде одной копии на клетку, а также устойчиво высокий темп роста в культуре, нормальная клеточная морфология и высокий процент GFP-позитивных клеток. Также после Cre/lox рекомбинации плазмиды pCMV-tDNA-optFVIII и альфоиднойTetO-ИХЧ был отобран клон клеток СНО, содержащий терапевтическую альфоиднуюTetO-ИХЧ с геном FVIII под контролем промотора CMV.  

Получение ИПС клеток из фибробластов мышей нокаутной по гену FVIII линии.Для получения ИПС клеток использовали фибробласты, полученные из кончика хвоста мутантных мышей линии, нокаутной по гену FVIII (Bi et al., 1995). После выведения таких фибробластов в культуру их трансдуцировали лентивирусными доксициклин-индуцибельными полицистронными конструкциями, содержащими гены Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (OSKM), а также rtTA-активатор. Через 16-20 дней после лентивирусной трансдукции были отобраны 8-10 клонов ИПС клеток. Клетки выращивали до необходимого количества и оценивали их рост и морфологию в условиях in vitro, экспрессию ими генов факторов плюрипотентности Oct4 и Nanog, а также способность формировать тератомы в бестимусных мышах линии NUDE с тканями всех трёх зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы). Таким образом нами было отобрано 2 клона ИПС клеток, нокаутных по гену FVIII.

Перенос терапевтической альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ из клеток линии СНО в FVIII-/--ИПС клетки мыши с помощью метода ММСТ.Для переноса терапевтической альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ из клеток линии СНО в      FVIII-/--ИПС клетки мыши (клон №2) мы использовали метод ретро-ММСТ (T. Suzuki et al., 2016) с модификациями, используемыми в нашей лаборатории (S. A. Sinenko et al., 2020), а также метод ММСТ (Liskovykh et al., 2016). Подготовленные микроклетки перед слиянием с клетками-реципиентами хранились в замороженном при температуре -80°С виде. После переноса альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ в мышиные FVIII-/--ИПС клетки, их выращивали в течение недели на среде с бластисидином, в концентрации 2 мкг/мл. После появления клеточных клонов, выживающих в присутствии антибиотика, бластисидин убирали из среды и давали клонам дорасти до размера, позволявшего произвести их отбор. Выросшие, позитивные по зелёному флуоресцентному GFP сигналу клеточные клоны отбирали вручную с помощью микропипетки, переносили в 96-луночный планшет и выращивали до необходимого количества. Также нами был произведён перенос альфоиднойTetO-CMV-FVIII-ИХЧ в мышиные FVIII-/--ИПС клетки с помощью методов ММСТ (Liskovykh et al., 2016) и ретроММСТ и было получено несколько клеточных клонов. Несмотря на то, что дальнейший анализ данных клонов показал автономность альфоиднойTetO-CMV-FVIII-ИХЧ в данных клетках, Вестерн-блот анализ не выявил в них экспрессии гена FVIII, несмотря на наличие экспрессии гена GFP, находящегося в этой же ИХЧ.  Таким образом, дальнейшая работа была сосредоточена на мышиных FVIII-/--ИПС клетках с альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.

Характеристика мышиных FVIII-/--ИПС клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.Всего было отобрано 8 клонов мышиных FVIII-/--ИПС клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ, позитивных по флуоресцентному зелёному GFP сигналу. После дальнейшего изучения выяснилось, что клетки только 2 клонов, в которые ИХЧ была перенесена с помощью метода ретроММСТ, способны экспрессировать ген фактора свёртывания крови VIII (клоны №1 и 2). С помощью иммуноцитохимического окрашивания было показано, что данные клеточные клоны содержат маркеры плюрипотентности Nanog и Oct4. Также, полученные клетки были подкожно инъецированы бестимусным мышам линии NUDE и сформировали тератомы, содержавшие ткани всех трёх зародышевых листков (эктодерма, мезодерма и энтодерма). Были получены препараты метафазных пластинок данных клеток и с помощью флуоресцентной гибридизации in situ было показано, что альфоиднаяTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ присутствует в этих клетках в автономной форме. Чтобы определить стабильность экспрессии гена FVIII в обоих клонах мышиных    FVIII-/--ИПС клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ, клетки выращивали до 5 и 10 пассажа, затем анализировали клеточные лизаты методом Вестерн-блот. Поскольку клетки выращивали на среде без бластисидина, в культуре происходило постепенное накопление клеток, теряющих ИХЧ, поэтому перед приготовлением лизата, отбирали только клетки, позитивные по флуоресцентному зелёному GFP сигналу с помощью проточного флуоресцентного сортера. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что уровень экспрессии гена FVIII в обоих из полученных клеточных клонов не отличается на 5 и 10 пассажах, и, таким образом, экспрессию можно характеризовать как стабильную. Также стоит отметить, что экспрессия гена FVIII в клетках СНО-ИХЧ-EF1-α-FVIII (клон №2) оказалась в несколько раз выше, чем в FVIII-/--ИПС клетках мыши (обе содержали одну копию альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.  

Анализ функциональной активности белка FVIII, экспрессирующегося с ИХЧ.
Также нами был проведён функциональный тест для определения активности белка FVIII в культуральной среде при содержании клеток в условиях in vitro и в плазме крови мышей при подкожных трансплантациях полученных нами клеточных клонов, содержащих ИХЧ-EF1-α-F8. Для измерения активности белка FVIII в культуральной среде, на чашки одновременно высевали одинаковое количество клеток CHO-ИХЧ-EF1-α-F8, CHO-ИХЧ-CMV-F8, ИПСК-ИХЧ-EF1-α-F8 (кл. №1), ИПСК-ИХЧ-EF1-α-F8 (кл. №2), а также исходные клоны СНО 38.18 и FVIII-/- ИПСК в качестве отрицательного контроля. Через двое суток отбирали образцы культуральной среды и с помощью специального фирменного набора Chromogenix Coamatic Factor VIII (Diapharma, Уэст Честер, США) измеряли активность белка FVIII, используя спектрофотометр. С помощью данного подхода нам удалось зарегистрировать активность белка FVIII в культуральной среде из чашек с клетками CHO-ИХЧ-EF1-α-F8, однако показатели других образцов не превышали показателей отрицательных контролей (данные не представлены). Эти данные могут указывать, что данный трансген, являющейся секретируемым растворимым белком, не секретируется плюрипотентными стволовыми клетками в связи с отсутствием у них данной функции или разрушается как чужеродный белок. Дальнейшие исследования будут направлены на исследование секреции FVIII в дифференцированных клетках полученных из данных ИПСК.

Анализ митотической стабильности FVIII-альфоиднойTetO-ИХЧ в ИПСК
Митотическая стабильность ИХЧ является одним из важных характеристик требуемых для использования в качестве генотерапевтических векторов, и представляет собой частоту потери хромосомных единиц ИХЧ в процессе клеточного деления. В связи с этим мы провели оценку показателя потери альфоиднойTetO-ИХЧ за день в клетках ИПСК-ИХЧ-EF1-α-FVIII (клоны 1 и 2), ИПСК-ИХЧ-CMV-FVIII, а также мышиных эмбриональных стволовых клетках, содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ с геном GFP под контролем промотора CAG в качестве трансгена (ЭС-ИХЧ-GFP), полученных ранее в нашей лаборатории (Liskovykh et al., 2015) (Рис. 3). Для оценки данного показателя использовался стандартный протокол (Ikeno et al., 1998)(Pesenti et al., 2018). Клетки выращивали в течение 20 суток на среде с добавлением бластисидина (4 мкг/мл), после этого, когда большая часть клеток, не содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ оказывается элиминирована из культуры, отбирали часть клеточного материала для его анализа с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и проточной цитофлуориметрии (FACS), остальные клетки продолжали выращивать на среде без бластисидина. Через 15 дней ещё раз отбирали клетки для их анализа теми же методами (Рис. 3). С помощью проточной цитофлуориметрии определяли процент позитивных по зелёному флуоресцентному GFP сигналу клеток в культуре (соответственно тех клеток, в которых содержится альфоиднаяTetO-ИХЧ с активным GFP-трансгеном) (Табл. 1). С помощью флуоресцентной гибридизации in situ зондов, специфичных к альфоиднойTetO-ДНК и препаратов метафазных пластинок, определяли процент клеток, содержащих в геноме альфоиднуюTetO-ИХЧ (Табл. 2). Полученные показатели позволили рассчитать показатель суточной потери клетками альфоиднойTetO-ИХЧ (Табл. 1 и 2).
Дополнительно, мы оценивали динамику накопления GFP-негативных клеток в клонах ИПСК-ИХЧ-EF1-α- FVIII (клоны № 1 и 2), культивируемых в среде без добавления бластисидина, таким образом косвенно анализируя динамику спонтанной потери клетками альфоиднойTetO-ИХЧ. Для этого, с помощью флуоресцентного сортера, мы отбирали только GFP-позитивные клетки и высевали их на чашки. В процессе культивирования с помощью проточной цитофлуориметрии оценивали количество GFP-позитивных клеток через 8, 18 и 22 дней после изначального посева на чашку (Рис. 4, а). По полученным данным был построен график (Рис. 4, б). На основании полученных Исходя из данных, видно, что в ходе культивирования клеток на среде, не содержащей селективного агента, в обоих рассматриваемых клонах происходит постепенная потеря экспрессии гена ЕGFP с искусственной хромосомы. Причинами являются (1) потеря ИХЧ в процессе деления клеток, (2) эпигенетическое «глушение» трансгена и (3) перестройки ИХЧ или встраивание ИХЧ в геном хозяина (хромосомные аберрации).

Отбор линий ИПСК с повышенной стабильностью ИХЧ.
Одним из подходов улучшения характеристик ИХЧ применимых для генотерапевтических целей является поиск наиболее стабильной ИХЧ или ИХЧ содержащего клона с помощью раундов субклонирования. С этой целью мы субклонировали две клона ИПСК-ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP, содержащих промотор EF1α, обеспечивающий достаточную экспрессию целевого трансгена.
В процессе субклонирования из популяции клеток клона 1 линии ИПСК-HAC-EF1α- FVIII-ЕGFP было отобрано 9 клонов с максимальной светимостью EGFP. Данный показатель мы рассматривали как индикатор наличия ИХЧ и отсутствия глушения трансгенов. Отметим, что клон Е2 светился наиболее ярко, а клоны А1, А9 и Е1 к концу эксперимента имели наиболее слабое свечение.
Из популяции ИПСК клона 2 линии PS-HAC-EF1α-FVIII-ЕGFP было отобрано 8 клонов с максимальной светимостью. Наибольшей светимостью обладал клон В6. Из каждого отобранного клона был получен препарат метафазных пластинок и проведена флуоресцентная in situ гибридизация для оценки качества искусственной хромосомы в полученных клонах.
В субклонах А5 и А9 клона 1 ИПСК-ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP не наблюдалось светимости, однако содержали интактную ИХЧ и приближенный к норме кариотип. Были отобраны клоны Е2 и В6, обладающие стабильной экспрессией GFP и повышенной стабильностью ИХЧ (64% и 57% соответственно). Кроме того интересно заметить значительную вариацию в наборе хромосом между разными субклонами, что может говорить о генетической нестабильности ИПСК в культуре а также не исключает возможной ограниченностью данного метода анализа кариотипа. Таким образом, на сновании вышеприведенных данных можно заключить, что ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP не отвечает требованиям терапевтического вектора, а именно не обладает митотической и структурной стабильностью и устойчивой экспрессией трансгена.
Публикации:
 
1. Пономарцев С. В., Синенко С. А., Томилин А. Н. Искусственные хромосомы человека и способы их доставки в клетки-мишени. Acta Naturae, 2022, № 3(54), Vol. 14. DOI:10.32607/actanaturae.11670; Q4. IF=2.2 
2. Sinenko S.A., Ponomartsev S.V., Tomilin A.N. Pluripotent stem cell‑based gene therapy approach: human de novo synthesized chromosomes.
Cellular and Molecular Life Sciences. 2020 Oct 3. doi: 10.1007/s00018-020-03653-1; Q1. IF=9.26

3. Ponomartsev S.V.; Sinenko S.A.; Skvortsova E.V.; Liskovykh M.A.; Voropaev I.N.; Savina M.M.; Kuzmin A.A.; Kuzmina E.Y.; Kondrashkina A.M.; Larionov V.; Kouprina N.; Tomilin A.N. Human alphoid-tetO artificial chromosome as a gene therapy vector for the developing hemophilia A model in mice.
Cells. 2020 Apr 3;9(4):879. doi: 10.3390/cells9040879; Q2. IF=6.6