Проведены экспериментальные ЯМР исследования систем, состоящих из лизинсодержащих дендримеров, Lys-2His и Lys-2Arg, и коротких терапевтических пептидов ED (Glu-Asp), AED (Ala-Glu-Asp) и AEDG (Ala-Glu-Asp-Gly). Установлено, что для всех исследованных систем характерно образование комплексов “дендример+пептид”. О формировании комплексов свидетельствуют результаты проведенного спектрального анализа, в ходе которого было установлено изменение химических сдвигов протонов связанных химически CH и CH2 групп в терминальных лизиновых сегментах Lys-2Arg дендримера; протонов CH групп имидазольного кольца и боковых CH2-(N) групп в Lys-2His дендримере. Оценка размеров (гидродинамического радиуса, Rh) формирующихся комплексов показала, что Rh комплексов Lys-2Arg дендримера со всеми лекарственными пептидами больше, чем Rh отдельного дендримера. В случае комплексов Lys-2His дендримера с ED и AEDG пептидами размер комплексов уменьшается по сравнению с Rh дендримера, в то время как Rh комплекса Lys-2His с AED увеличивается.
Полученные экспериментальные результаты для комплекса Lys-2His с AEDG согласуются с данными моделирования, проведенного в отчетном году. При моделировании данной системы: (а) были построены начальные молекулярные структуры для моделирования методом молекулярной динамики образования комплексов между поверхностно заряженным Lys-2His дендримером (с нейтральными гистидиновыми развязками и общим зарядом +16) и объемно заряженным Lys-2Hisp дендримером (с протонированными гистидиновыми развязками и общим зарядом +44) и лекарственным пептидом AEDG (Ala-Glu-Asp-Gly). Каждая система представляла собой водный раствор дендримера, в который были добавлены 16 AEDG пептидов. Для обеих систем: (а) проведена минимизация энергии начальных структур с добавленными пептидами и контрионами с их последующим уравновешиванием методом МД в водном растворе; (б) методом МД рассчитаны траектории длиной 250 нс для исследования процесса комплексообразования в обеих системах; (в) на основе проведенных расчетов вычислены характеристики системы “дендример+пептиды” (радиус инерции, расстояние и число водородных связей между дендримером и пептидами), которые позволили оценить времена образования комплексов “дендример+пептиды”; (г) для получения равновесных характеристик комплекса было проведено дополнительное моделирование обеих систем в течение 250 нс; (д) из этих траекторий были получены структурные характеристики и диффузионные свойства комплекса; (е) полученные результаты были сопоставлены с данными экспериментальных исследований, проведенных в рамках данного проекта.
Получены следующие научные результаты: (а) установлено, что оба рассмотренных дендримера образуют комплексы с лекарственными пептидами AEDG; однако число пептидов в комплексе отличается (б) в частности, для поверхностно заряженного Lys-2His дендримера в среднем только 9 из 16 пептидов участвует в образовании комплекса; при этом флуктуации числа пептидов в комплексе очень велики (от 5 до13 пептидов), а для Lys-2Hisp практически все 16 пептидов входят в комплекс, и флуктуации количества пептидов в нем, обычно, не превышают одного пептида; (в) показано, что размеры дендримеров в комплексах уменьшаются по сравнению с размерами отдельных дендримеров в водном растворе; (г) в частности, получено, компактизация дендримера в комплексе в случае Lys-2Hisp, отношение размера Lys-2Hisp дендримера в комплексе к размеру одиночного дендримера в воде 1,63/2,05 = 0,8, а для Lys-2His это отношение 1,22/1,32 = 0,92; (д) размеры Lys-2His количественно совпадают с экспериментом, проведенным в рамках данного проекта; (е) среднеквадратичное смещение центров инерции Lys-2His и Lys-2Hisp и коэффициенты поступательной диффузии этих отдельных дендримеров близки, в то же время, для комплексов Lys-2His поступательная диффузия ускоряется, а для Lys-2Hisp практически не меняется по сравнением с поступательной диффузией отдельного дендримера в воде; (ж) вращение пептидов в обоих комплексах существенно замедляется по сравнению с вращением одиночного пептида в разбавленном растворе. Полученные результаты для поступательной диффузии комплекса объясняются более сильной компенсацией полного заряда Lys-2His (+16) дендримера пептидами с зарядом (+9), находящимися в комплексе (+16-9=+7), в то время как полный заряд дендримера Lys-2Hisp (+44) компенсируется в комплексе в меньшей степени (+44-16=+28).
III.a) Были синтезированы образцы лизинсодержащих дендримеров (Lys-2Arg и Lys-2His) и коротких терапевтических пептидов (ED, AED и AEDG) в количестве достаточном для проведения экспериментальных исследований.
III.б)
(i) Были получены спектральные и диффузионные характеристики комплексов коротких пептидов (ED, AED и AEDG) с дендримерами (Lys-2Arg и Lys-2His), а также каждого компонента в отдельности. Установлено, что для всех исследованных системах образуются комплексы “дендример+пептиды”.
(i-2) Дополнительно было установлено, что ориентационная подвижность и ЯМР релаксация внутренних групп замедляется в коллапсированной глобальной конформации Lys-2His дендримера. Этот эффект был подтверждён данными ЯМР эксперимента и МД моделирования. Доказано, что это вызвано тем, что основной вклад в случае коллапсированного дендримера дает вращение дендримера, которое практически не влияет на ЯМР релаксацию групп набухшего дендримера. Также показано несоответствие сегментальной подвижности и подвижности СН2 групп и подвижности сегмента, содержащего данную группу. Этот вывод не позволяет применять традиционный подход, в котором ЯМР релаксация групп отождествляется с сегментальной подвижностью. Материалы были опубликованы в нашей статье [Macromolecules 2021, published online; https://10.1021/acs.macromol.8b02250].
(ii) Исследования фотометрическими методами азобензольных дендримеров при комнатной температуре позволили установить, что молярные коэффициенты экстинкции транс- и цис-форм азобензольных групп в 3 раза превышают коэффициенты чистого азобензола; константа скорости (k= 0,00002 с-1) перехода азобензольных концевых групп из цис-в транс-форму в темноте при Т=293 К, совпадение которой с константой скорости подобного перехода в чистом азобензоле позволяет сделать предположение о том, что концевые азобензольные группы не проникают внутрь дендримера и, следовательно, затрудняют эффект бэкфолдинга; кинетика перехода описывается моноэкспоненциальной функцией, при этом константа скорости фотостимулированного перехода «цис-транс» линейно зависит от интенсивности света в диапазоне интенсивностей до 10 мВт/см3, что позволяет в будущем исследовать этот процесс с точностью до 1 азобензольной группы; для азобензольных концевых групп карбосиланового дендримера определена величина квантового выхода фотоиндуцированного перехода c-AzoCSD – t-AzoCSD равная 0.25±0.02, тогда как для азобензола квантовый выход получился равным 0.40±0.05.
(iii) Исследования азобензольных дендримеров в растворе толуола методом малоуглового рассеивания позволили установить, что, как и в моделировании, радиус инерции (Rg) c-AzoCSD больше, чем t-AzoCSD. Установлено, что размер обоих дендримеров существенно больше в хлороформе. Этот факт косвенно указывает, что в случае кабосиланового дендримера с концевыми азобензольными группами толуол более подходящий растворитель, чем хлороформ в (отличие от кабосилановых дендримеров с цианбифенильными концевыми группами).
III.в)
(i)-(ii) С помощью данных компьютерного моделирования был установлен факт и механизм образования комплекса Lys-2His и Lys-2Hisp дендримерами с молекулами короткого биоактивного пептида (AEDG). Причем образование комплексов приводило к уменьшению размера агрегата по сравнению с размерами отдельных дендримеров. Материалы были опубликованы в нашей недавней статье [Molecules 2021, 26(21), 6552; https://doi.org/10.3390/molecules26216552].
(iii) Результаты моделирования подтвердили, что процесс образование полости в AzoCSD G4 происходит в области более низких температур по сравнению с аналогичным процессом в карбосилановом дендримере с цианбифенильными группами, что, по всей видимости, связано с меньшей жесткостью азобензольных групп. Также установлено, что цис-конформация азобензольных концевых групп способствует образованию полости в отличие от транс-конформации.
