Сборка векторов для доставки терапевтического гена в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
С помощью методов молекулярного клонирования нами ранее были получены генетические вектора для доставки гена FVIII в альфоиднуюTetO-ИХЧ (конструкции CMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII) (Рис. 1). Элементы, общие для обоих конструкций – это: ориджин репликации, необходимый для наработки данных векторов в бактериальных клетках; ген устойчивости к ампициллину для отбора на селективной среде бактериальных клонов, содержащих такие плазмиды; сайт loxP для сайт-специфичного встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ; 3’ фрагмент гена гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы (HPRT), который после встраивания векторов в альфоиднуюTetO-ИХЧ в правильной ориентации, обеспечивает восстановление функциональной формы гена HPRT, что позволяет отбирать клоны клеток линии CHO, нокаутные по гену HPRT, но несущие его восстановленную форму в ИХЧ, на селективной НАТ среде (Holliday & Ho, 1998); ген зелёного флуоресцентного белка GFP под контролем повсеместного промотора CAG (Hitoshi et al., 1991), как дополнительный маркер селекции клеток; кДНК гена фактора свёртывания крови VIII; кластеры тДНК в качестве инсуляторов (Ebersole et al., 2011; Lee et al., 2013; Raab et al., 2012), которые фланкируют гены GFP и FVIII, для предотвращения ингибирующего влияния на транскрипцию трансгенов со стороны центрохроматина, после встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
Конструкции различаются между собой по промоторам, контролирующим экспрессию гена FVIII, а именно в векторе pCMV-tDNA-optFVIII – это промотор цитомегаловируса (CMV), а в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII – это повсеместный промотор гена альфа субъединицы фактора элонгации 1 человека (EF1-α). Также в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII между промоторами генов GFP и FVIII, которые расположены в ориентации «голова к голове» находится дополнительный инсулятор cHS4 куриного β-глобулинового кластера генов, необходимый для разграничения их активности.

Встраивание трансгенов в альфоиднуюTetO-ИХЧ с помощью cre/lox-рекомбинации.
Генетические векторные конструкции pCMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII были ранее встроены в альфоиднуюTetO-ИХЧ, находящуюся в HPRT-/- клетках линии СНО, с помощью сайт-специфичной Cre/lox-рекомбинации (детали в отчете 2020) (Рис. 2).
После Cre/lox рекомбинации генетического вектора pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII и альфоиднойTetO-ИХЧ, на селективной НАТ-среде нами было ранее получено 2 клона клеток линии СНО, содержащих терапевтическую альфоиднуюTetO-ИХЧ, и экспрессирующих флуоресцентный зелёный протеин GFP, и белковый продукт гена FVIII. Было показано с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), что в обоих клонах терапевтическая альфоиднаяTetO-ИХЧ присутствует в одной копии и находится в автономном состоянии. Также ранее с помощью Cre/lox рекомбинации был получен и аналогично охарактеризован СНО клон, содержащий альфоиднуюTetO-ИХЧ с pCMV-tDNA-optFVIII конструкцию.

Мышиные FVIII-/--ИПСК, содержащие альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.
Ранее с помощью метода ММСТ было получено 8 клонов мышиных FVIII-/--ИПСК клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ, позитивных по флуоресцентному зелёному GFP сигналу (отчет 2020г). Мы установили, что клетки только 2 клонов, которые были получены с помощью метода ретроММСТ, способны экспрессировать ген фактора свёртывания крови VIII (клоны №1 и 2). На основе анализа метафазных пластинок с помощью флуоресцентной гибридизации in situ было показано, что альфоиднаяTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ присутствует в этих клетках в автономной форме. Ранее проведенный анализ также показал, что данные ИПСК остаются полностью плюрипотентными, экспрессируют Nanog и Oct4 и образуют полноценные тератомы в иммуно-дефицитных мышах.

Анализ функциональной активности белка FVIII, экспрессирующегося с ИХЧ.
Также нами был проведён функциональный тест для определения активности белка FVIII в культуральной среде при содержании клеток в условиях in vitro и в плазме крови мышей при подкожных трансплантациях полученных нами клеточных клонов, содержащих ИХЧ-EF1-α-F8. Для измерения активности белка FVIII в культуральной среде, на чашки одновременно высевали одинаковое количество клеток CHO-ИХЧ-EF1-α-F8, CHO-ИХЧ-CMV-F8, ИПСК-ИХЧ-EF1-α-F8 (кл. №1), ИПСК-ИХЧ-EF1-α-F8 (кл. №2), а также исходные клоны СНО 38.18 и FVIII-/- ИПСК в качестве отрицательного контроля. Через двое суток отбирали образцы культуральной среды и с помощью специального фирменного набора Chromogenix Coamatic Factor VIII (Diapharma, Уэст Честер, США) измеряли активность белка FVIII, используя спектрофотометр. С помощью данного подхода нам удалось зарегистрировать активность белка FVIII в культуральной среде из чашек с клетками CHO-ИХЧ-EF1-α-F8, однако показатели других образцов не превышали показателей отрицательных контролей (данные не представлены). Эти данные могут указывать, что данный трансген, являющейся секретируемым растворимым белком, не секретируется плюрипотентными стволовыми клетками в связи с отсутствием у них данной функции или разрушается как чужеродный белок. Дальнейшие исследования будут направлены на исследование секреции FVIII в дифференцированных клетках полученных из данных ИПСК.

Анализ митотической стабильности FVIII-альфоиднойTetO-ИХЧ в ИПСК
Митотическая стабильность ИХЧ является одним из важных характеристик требуемых для использования в качестве генотерапевтических векторов, и представляет собой частоту потери хромосомных единиц ИХЧ в процессе клеточного деления. В связи с этим мы провели оценку показателя потери альфоиднойTetO-ИХЧ за день в клетках ИПСК-ИХЧ-EF1-α-FVIII (клоны 1 и 2), ИПСК-ИХЧ-CMV-FVIII, а также мышиных эмбриональных стволовых клетках, содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ с геном GFP под контролем промотора CAG в качестве трансгена (ЭС-ИХЧ-GFP), полученных ранее в нашей лаборатории (Liskovykh et al., 2015) (Рис. 3). Для оценки данного показателя использовался стандартный протокол (Ikeno et al., 1998)(Pesenti et al., 2018). Клетки выращивали в течение 20 суток на среде с добавлением бластисидина (4 мкг/мл), после этого, когда большая часть клеток, не содержащих альфоиднуюTetO-ИХЧ оказывается элиминирована из культуры, отбирали часть клеточного материала для его анализа с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и проточной цитофлуориметрии (FACS), остальные клетки продолжали выращивать на среде без бластисидина. Через 15 дней ещё раз отбирали клетки для их анализа теми же методами (Рис. 3). С помощью проточной цитофлуориметрии определяли процент позитивных по зелёному флуоресцентному GFP сигналу клеток в культуре (соответственно тех клеток, в которых содержится альфоиднаяTetO-ИХЧ с активным GFP-трансгеном) (Табл. 1). С помощью флуоресцентной гибридизации in situ зондов, специфичных к альфоиднойTetO-ДНК и препаратов метафазных пластинок, определяли процент клеток, содержащих в геноме альфоиднуюTetO-ИХЧ (Табл. 2). Полученные показатели позволили рассчитать показатель суточной потери клетками альфоиднойTetO-ИХЧ (Табл. 1 и 2).
Дополнительно, мы оценивали динамику накопления GFP-негативных клеток в клонах ИПСК-ИХЧ-EF1-α- FVIII (клоны № 1 и 2), культивируемых в среде без добавления бластисидина, таким образом косвенно анализируя динамику спонтанной потери клетками альфоиднойTetO-ИХЧ. Для этого, с помощью флуоресцентного сортера, мы отбирали только GFP-позитивные клетки и высевали их на чашки. В процессе культивирования с помощью проточной цитофлуориметрии оценивали количество GFP-позитивных клеток через 8, 18 и 22 дней после изначального посева на чашку (Рис. 4, а). По полученным данным был построен график (Рис. 4, б). На основании полученных Исходя из данных, видно, что в ходе культивирования клеток на среде, не содержащей селективного агента, в обоих рассматриваемых клонах происходит постепенная потеря экспрессии гена ЕGFP с искусственной хромосомы. Причинами являются (1) потеря ИХЧ в процессе деления клеток, (2) эпигенетическое «глушение» трансгена и (3) перестройки ИХЧ или встраивание ИХЧ в геном хозяина (хромосомные аберрации).

Отбор линий ИПСК с повышенной стабильностью ИХЧ.
Одним из подходов улучшения характеристик ИХЧ применимых для генотерапевтических целей является поиск наиболее стабильной ИХЧ или ИХЧ содержащего клона с помощью раундов субклонирования. С этой целью мы субклонировали две клона ИПСК-ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP, содержащих промотор EF1α, обеспечивающий достаточную экспрессию целевого трансгена.
В процессе субклонирования из популяции клеток клона 1 линии ИПСК-HAC-EF1α- FVIII-ЕGFP было отобрано 9 клонов с максимальной светимостью EGFP. Данный показатель мы рассматривали как индикатор наличия ИХЧ и отсутствия глушения трансгенов. Отметим, что клон Е2 светился наиболее ярко, а клоны А1, А9 и Е1 к концу эксперимента имели наиболее слабое свечение.
Из популяции ИПСК клона 2 линии PS-HAC-EF1α-FVIII-ЕGFP было отобрано 8 клонов с максимальной светимостью. Наибольшей светимостью обладал клон В6. Из каждого отобранного клона был получен препарат метафазных пластинок и проведена флуоресцентная in situ гибридизация для оценки качества искусственной хромосомы в полученных клонах.
В субклонах А5 и А9 клона 1 ИПСК-ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP не наблюдалось светимости, однако содержали интактную ИХЧ и приближенный к норме кариотип. Были отобраны клоны Е2 и В6, обладающие стабильной экспрессией GFP и повышенной стабильностью ИХЧ (64% и 57% соответственно). Кроме того интересно заметить значительную вариацию в наборе хромосом между разными субклонами, что может говорить о генетической нестабильности ИПСК в культуре а также не исключает возможной ограниченностью данного метода анализа кариотипа. Таким образом, на сновании вышеприведенных данных можно заключить, что ИХЧ-EF1α-FVIII-ЕGFP не отвечает требованиям терапевтического вектора, а именно не обладает митотической и структурной стабильностью и устойчивой экспрессией трансгена.

Разработка модифицированной конструкции FVIII-IRES-GFP.
В связи с низким уровнем экспрессии FVIII в ИПСК и ИПСК-производных тканях мы решили модифицировать вектор EF1α-FVIII-ЕGFP путем инактивации CAG промотора и встраивания сразу за FVIII последовательностью IRES-EGFP последовательность, что позволит экспрессироваться обоим трансгенам FVIII и EGFP с одного сильного и повсеместного промотора EF1α. Данная конструкция позволит наблюдать совместную экспрессию данных трансгенов в различных типах клеток и оценить специфичность или способность экспрессии фактора FVIII в данных клетках. На рисунке 5 приведены карты исходного - pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII и модифицированного векторов - pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII-IRES-GFP-bov-glo-polyA2A (CAG-).