Разработка тканезаместительной геннотерапевтической модели на основе альфоидных искусственных хромосом человека (альфоидные-ИХЧ) и плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) для лечения моногенных наследственных заболеваний, таких как гемофилия, имеет важное научно-практическое значение в современной биомедицине.
Разработка и усовершенствование новых ММСТ методов переноса альфоидных-ИХЧ в клетки млекопитающих, а также альтернативных методов переноса хромосом является приоритетом в данной области. Ограниченное количество лабораторий в мире владеет техникой создания терапевтических альфоидных-ИХЧ и методами переноса и манипуляции искусственными хромосомами.
Используемый нами вид ИХЧ, имеющих в своих центромерных областях встроенные tetO-связывающие сайты (это позволяет обеспечить индуцируемую потерю ИХЧ), не был детально охарактеризован на предмет их использования в генотерапевтических целях.
Данный проект нацелен на разработку и создание новых генотерапевтических конструкций на основе ИХЧ, оценки эффективности их работы в модельной системе мыши, тканезаместительной генотерапии гемофилии.
В результате проведенных исследований на данном этапе получены следующие результаты:
1 Получены конструкты на основе альфоидных-ИХЧ, несущие следующие трансгены: кДНК фактора FVIII и кДНК дисферлина человека под контролем промотора EF1-alpha. Клонированные последовательности кДНК FVIII и дисферлина вставлены в альфоидные-ИХЧ с помощью Cre/lox системы в клетках СНО.
2) Из фибробластов мышей мутантных по гену фактора FVIII получены иПСК мыши, подтверждена их плюрипотентность. Приготовлены лентивирусы, кодирующие полицистронную OKSM и rT-TA репрограммирующие конструкции.
3) Отработаны методы ММСТ для переноса альфоидных-ИХЧ; и произведен перенос альфоидных ИХЧ, несущих FVIII трансген, в иПСК гемофильных мышей.
4) Проведены эксперименты, подтверждающие эффективную экспрессию трансгенов в целевых иПСК, несущие соответствующие ИХЧ конструкты, охарактеризована митотическая стабильность полученных ИХЧ.
Однако в связи с недостаточным и нестабильным уровнем экспрессии трансгена был сделан вывод, что необходимо значительное изменение конструкции, включая выбор более сильных регуляторных промоторов и возможно увеличение копий трансгена. Наибольшим проблемным участком является структура альфоиднойTetO-ИХЧ. Так было замечено, что данная ИХЧ имеет тенденцию к спонтанной полимеризации, а также к встраиванию в хромосомы клеток хозяина. Данные свойства ставят серьёзные вопросы использования альфоиднойTetO-ИХЧ в ткнезаместительной генотерапии. В связи с этим одной ИХЧ данного типа недостаточно для полноценных исследований и применения в качестве генотерапевтического вектора. Создание новых альфоидных кольцевых и линейных ИХЧ, не содержащих TetO последовательностей, критически необходимо для данной области исследования. Технология новосинтезированных искусственных хромосом человека имеет ряд серьёзных проблемных участков, которые пока не находят решения. В первую очередь – это технология синтеза/получения ИХЧ и методы переноса ИХЧ в целевые клетки. Совершенствование и стандартизация данных процессов даст возможность более эффективному использованию данной технологии в создании генотерапевтических векторных систем для современной регенеративной медицины.
Сборка векторов для доставки терапевтического гена в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
С помощью методов молекулярного клонирования нами были получены генетические вектора для доставки гена FVIII в альфоиднуюTetO-ИХЧ (конструкции CMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII). Элементы, общие для обоих конструкций – это: ориджин репликации, необходимый для наработки данных векторов в бактериальных клетках; ген устойчивости к ампициллину для отбора на селективной среде бактериальных клонов, содержащих такие плазмиды; сайт loxP для сайт-специфичного встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ; 3’ фрагмент гена гипоксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы (HPRT), который после встраивания векторов в альфоиднуюTetO-ИХЧ в правильной ориентации, обеспечивает восстановление функциональной формы гена HPRT, что позволяет отбирать клоны клеток линии CHO, нокаутные по гену HPRT, но несущие его восстановленную форму в ИХЧ, на селективной НАТ среде (Holliday & Ho, 1998); ген зелёного флуоресцентного белка GFP под контролем повсеместного промотора CAG (Hitoshi et al., 1991), как дополнительный маркер селекции клеток; кДНК гена фактора свёртывания крови VIII; кластеры тДНК в качестве инсуляторов (Ebersole et al., 2011; Lee et al., 2013; Raab et al., 2012), которые фланкируют гены GFP и FVIII, для предотвращения ингибирующего влияния на транскрипцию трансгенов со стороны центрохроматина, после встраивания векторных конструкций в альфоиднуюTetO-ИХЧ.
Конструкции различаются между собой по промоторам, контролирующим экспрессию гена FVIII, а именно в векторе pCMV-tDNA-optFVIII – это промотор цитомегаловируса (CMV), а в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII – это повсеместный промотор гена альфа субъединицы фактора элонгации 1 человека (EF1-α). Также в конструкции pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII между промоторами генов GFP и FVIII, которые расположены в ориентации «голова к голове» находится дополнительный инсулятор cHS4 куриного β-глобулинового кластера генов, необходимый для разграничения их активности.
Встраивание трансгенов в альфоиднуюTetO-ИХЧ с помощью cre/lox-рекомбинации.Генетические векторные конструкции pCMV-tDNA-optFVIII и EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII были встроены в альфоиднуюTetO-ИХЧ, находящуюся в HPRT-/- клетках линии СНО, с помощью сайт-специфичной Cre/lox-рекомбинации. Для этого HPRT-/- клетки линии СНО, несущие альфоиднуюTetO-ИХЧ, были транфицированы с помощью липофекции вектором pMC-Cre, содержащим ген Cre-рекомбиназы, а также конструкциями pCMV-tDNA-optFVIII или EF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII. При встраивании трансгена в альфоиднуюTetO-ИХЧ в правильной ориентации, происходит соединение 3’-фрагмента гена HPRT, находящегося в векторной конструкции с 5’-фрагментом, находящимся в альфоиднойTetO-ИХЧ. После этого в клетках происходит восстановление функции гена HPRT, что позволяет производить отбор клеточных клонов с корректной вставкой трансгена.После Cre/lox – рекомбинации генетического вектора pEF1-alpha-cHS4-tDNA-optFVIII и альфоиднойTetO-ИХЧ, на селективной НАТ-среде нами было отобрано 15 клонов клеток линии СНО, содержащих терапевтическую альфоиднуюTetO-ИХЧ и позитивных по флуоресцентному зелёному GFP-сигналу. С образцами ДНК из этих клеточных клонов был проведен ПЦР анализ, который показал наличие в них гена FVIII под контролем промотора EF1-α. Также с помощью ПЦР анализа было показано, что у 3 из 15 клеточных клонов произошло спонтанное встраивание гена Cre-рекомбиназы в геном, что свидетельствовало о непригодности данных клонов для последующих экспериментов. Также были получены лизаты всех 15 клонов и проведён Вестерн-блот анализ, который показал, что в 12 клеточных клонах присутствует белковый продукт гена FVIII. На основании этих данных, а также учитывая темпы роста полученных клеточных клонов в культуре, было отобрано 4 клона для оценки автономности терапевтической альфоиднойTetO-ИХЧ. Из данных клеточных клонов были получены препараты метафазных пластинок, которые анализировали с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Было показано, что во всех четырёх клонах терапевтическая альфоиднаяTetO-ИХЧ присутствует в одной копии и находится в автономном состоянии. В результате, для дальнейших экспериментов был отобран клон №2, для которого было отмечено наличие гена FVIII под контролем промотора EF1-α, отсутствие в геномной ДНК спонтанно встроенного гена Cre-рекомбиназы, наличие белкового продукта гена FVIII, автономность терапевтической альфоиднойTetO-ИХЧ и её присутствие в виде одной копии на клетку, а также устойчиво высокий темп роста в культуре, нормальная клеточная морфология и высокий процент GFP-позитивных клеток. Также после Cre/lox рекомбинации плазмиды pCMV-tDNA-optFVIII и альфоиднойTetO-ИХЧ был отобран клон клеток СНО, содержащий терапевтическую альфоиднуюTetO-ИХЧ с геном FVIII под контролем промотора CMV.
Получение ИПС клеток из фибробластов мышей нокаутной по гену FVIII линии.Для получения ИПС клеток использовали фибробласты, полученные из кончика хвоста мутантных мышей линии, нокаутной по гену FVIII (Bi et al., 1995). После выведения таких фибробластов в культуру их трансдуцировали лентивирусными доксициклин-индуцибельными полицистронными конструкциями, содержащими гены Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (OSKM), а также rtTA-активатор. Через 16-20 дней после лентивирусной трансдукции были отобраны 8-10 клонов ИПС клеток. Клетки выращивали до необходимого количества и оценивали их рост и морфологию в условиях in vitro, экспрессию ими генов факторов плюрипотентности Oct4 и Nanog, а также способность формировать тератомы в бестимусных мышах линии NUDE с тканями всех трёх зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и энтодермы). Таким образом нами было отобрано 2 клона ИПС клеток, нокаутных по гену FVIII.
Перенос терапевтической альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ из клеток линии СНО в FVIII-/--ИПС клетки мыши с помощью метода ММСТ.Для переноса терапевтической альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ из клеток линии СНО в FVIII-/--ИПС клетки мыши (клон №2) мы использовали метод ретро-ММСТ (T. Suzuki et al., 2016) с модификациями, используемыми в нашей лаборатории (S. A. Sinenko et al., 2020), а также метод ММСТ (Liskovykh et al., 2016). Подготовленные микроклетки перед слиянием с клетками-реципиентами хранились в замороженном при температуре -80°С виде. После переноса альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ в мышиные FVIII-/--ИПС клетки, их выращивали в течение недели на среде с бластисидином, в концентрации 2 мкг/мл. После появления клеточных клонов, выживающих в присутствии антибиотика, бластисидин убирали из среды и давали клонам дорасти до размера, позволявшего произвести их отбор. Выросшие, позитивные по зелёному флуоресцентному GFP сигналу клеточные клоны отбирали вручную с помощью микропипетки, переносили в 96-луночный планшет и выращивали до необходимого количества. Также нами был произведён перенос альфоиднойTetO-CMV-FVIII-ИХЧ в мышиные FVIII-/--ИПС клетки с помощью методов ММСТ (Liskovykh et al., 2016) и ретроММСТ и было получено несколько клеточных клонов. Несмотря на то, что дальнейший анализ данных клонов показал автономность альфоиднойTetO-CMV-FVIII-ИХЧ в данных клетках, Вестерн-блот анализ не выявил в них экспрессии гена FVIII, несмотря на наличие экспрессии гена GFP, находящегося в этой же ИХЧ. Таким образом, дальнейшая работа была сосредоточена на мышиных FVIII-/--ИПС клетках с альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.
Характеристика мышиных FVIII-/--ИПС клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.Всего было отобрано 8 клонов мышиных FVIII-/--ИПС клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ, позитивных по флуоресцентному зелёному GFP сигналу. После дальнейшего изучения выяснилось, что клетки только 2 клонов, в которые ИХЧ была перенесена с помощью метода ретроММСТ, способны экспрессировать ген фактора свёртывания крови VIII (клоны №1 и 2). С помощью иммуноцитохимического окрашивания было показано, что данные клеточные клоны содержат маркеры плюрипотентности Nanog и Oct4. Также, полученные клетки были подкожно инъецированы бестимусным мышам линии NUDE и сформировали тератомы, содержавшие ткани всех трёх зародышевых листков (эктодерма, мезодерма и энтодерма). Были получены препараты метафазных пластинок данных клеток и с помощью флуоресцентной гибридизации in situ было показано, что альфоиднаяTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ присутствует в этих клетках в автономной форме. Чтобы определить стабильность экспрессии гена FVIII в обоих клонах мышиных FVIII-/--ИПС клеток, содержащих альфоиднуюTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ, клетки выращивали до 5 и 10 пассажа, затем анализировали клеточные лизаты методом Вестерн-блот. Поскольку клетки выращивали на среде без бластисидина, в культуре происходило постепенное накопление клеток, теряющих ИХЧ, поэтому перед приготовлением лизата, отбирали только клетки, позитивные по флуоресцентному зелёному GFP сигналу с помощью проточного флуоресцентного сортера. С помощью Вестерн-блот анализа было показано, что уровень экспрессии гена FVIII в обоих из полученных клеточных клонов не отличается на 5 и 10 пассажах, и, таким образом, экспрессию можно характеризовать как стабильную. Также стоит отметить, что экспрессия гена FVIII в клетках СНО-ИХЧ-EF1-α-FVIII (клон №2) оказалась в несколько раз выше, чем в FVIII-/--ИПС клетках мыши (обе содержали одну копию альфоиднойTetO-EF1-α-FVIII-ИХЧ.
