Предлагаемый научный проект направлен на решение фундаментальной проблемы биологии, связанной с выявлением новых биохимических и эволюционных аспектов метаболизма аргинина у представителей архепластид, а также с выяснением новых молекулярных механизмов, которые обеспечивают эффективный контроль биосинтеза этой аминокислоты у различных представителей зеленых водорослей.
Следует особо отметить, что пока нет ни одной работы, в которой, анализировались бы свойства NAGK и возможные пути регуляции синтеза аргинина и формирования его продуктов у тех представителей, которые утратили в процессе эволюции белки семейства PII. Особую актуальность и значимость представляет выяснение механизмов контроля синтеза аргинина у представителей класса Mamiellophyceae (Ostreococcus, Bathycoccus), включающих наименьшего из всех известных свободноживущих эукариот – зеленую водоросль Ostreococcus tauri. Исследования Ostreococcus и Bathycoccus расширят наши представления о ключевых особенностях метаболизма, которые позволяют клеткам около 1 мкм в диаметре функционировать как отдельные свободноживущие эукариотические организмы. Следует также подчеркнуть, что еще одна уникальная зеленая водоросль - Prasinoderma coloniale - представитель Prasinodermophyta, дивергировавший до разделения в эволюции Chlorophyta и Streptophyta (Li et al., 2020), также утратила белок PII, и в этой связи представляет собой перспективную модель для изучения эволюции процессов метаболизма аргинина растений в целом.
В заключении следует отметить, что не только представители Rhodophyta, Chlorophyta и Prasinodermophyta, но также некоторые Streptophyta не содержат PII-белок (например, Chara braunii) (Selim et al., 2020), что, свидетельствует об актуальности запланированных нами исследований, поскольку они могут послужить основой для установления причинно-следственных связей изменения механизмов контроля биосинтеза незаменимой аминокислоты аргинина, которые произошли в процессе эволюции у Archaeplastida в целом.

Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб:
Выявленные нами утрата генов, кодирующих PII-белки, в геномах ряда зеленых водорослей из Chlorophyta, Prasinodermophyta и Streptophyta, и как следствие - отсутствие у них PII-зависимого контроля могло привести в процессе эволюции к значительным изменениям регуляции биосинтеза аргинина у представителей Archaeplastida по сравнению с цианобактериями.
В качестве объектов исследования будут использованы уникальные представители без PII, которые имеют NAGK, различающиеся по наличию аминокислотных остатков, вовлеченных у этих ферментов других фотосинтезирующих организмов во взаимодействие с PII: (1) трех представителей Mamiellophyceae (диаметр клеток сопоставим с бактериями) Ostreococcus tauri, Ostreococcus lucimarinus, и Bathycoccus prasinos; (2) представителя Prasinodermophyta, Prasinoderma coloniale (диаметр клеток сопоставим с бактериями), который дивергировал до разделения в эволюции Chlorophyta и Streptophyta; Кроме того, будут проанализированы NAGK модельной галофильной зеленой водоросли Dunaliella salina и пиководоросли Micromonas pusilla (Mamiellophyceae), которые сохранили PII-белок.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов:
Как отмечалось выше, во всех проанализированных до сих пор представителях Chloroplastida взаимодействие ферментов NAGK и белков PII является ключевым этапом регуляции синтеза аргинина, который обеспечивает в условиях достаточного содержания доступного азота увеличение выработки аргинина, а при ограничении азота приводит к снижению синтеза этой аминокислоты (Maheswaran et al., 2004; Slocum, 2005 ; Chen et al., 2006; Llacer et al., 2008). Однако, проведенный нами анализ регуляции NAGK Chlamydomonas reinhardtii in vivo (Vlasova et al., IJMS, 2023) показал, что в отличие от цианобактерий контроль фермента с помощью белка PII представляет собой интегральную часть более сложной регуляторной сети. Насколько выявленный многоуровневый контроль NAGK характерен для других зеленых водорослей с PII-белком пока неясно. Кроме того, анализ геномов Archaeplastida, имеющихся в базах данных, позволил нам выявить отсутствие белка PII у целого ряда представителей красных водорослей и зеленых водорослей из Chlorophyta, Streptophyta и Prasinodermophyta. В этой связи возникает несколько фундаментальных вопросов, ответы на которые пока никто в мире не дал: (1) как осуществляется регуляция биосинтеза аргинина в отсутствии PII; (2) почему в процессе эволюции утрата генов, кодирующих PII-белки, происходила неоднократно у представителей разных классов и в этой связи какие преимущества могли получить разные представители, зеленых водорослей, утратившие консервативный сигнальный белок PII; Отсутствие ответов на эти вопросы существенно ограничивает наши представления о путях эволюции ключевых компонентов (ферментов и регуляторных белков) метаболизма аргинина.
Предлагаемый проект будет первым фундаментальным исследованием, в котором планируется провести комплексный сравнительный анализ каталитических свойств и механизмов контроля экспрессии и активности N-ацетил-L-глутаматкиназ, уровней метаболитов в пути биосинтеза аргинина у зеленых водорослей, утративших PII, и близкородственных им представителей с функциональными сигнальными PII-белками.
Ожидается, что в ходе выполнения проекта нами будут получены принципиально новые знания о механизмах регуляции метаболизма аргинина у водорослей разного уровня организации, что может привести к пониманию путей эволюции структурно-функциональной организации ферментов биосинтеза аргинина и способов их контроля у фотосинтезирующих организмов в целом.

Достижимость решения поставленных задач и возможность получения запланированных результатов связаны с:
1. Выбором в качестве объектов исследования одноклеточных водорослей, культивирование и работа с которыми налажена в лаборатории адаптации микроорганизмов СПбГУ, включая такие уникальные объекты как Ostreococcus tauri и Prasinoderma coloniale;
2. Использованием для анализа экспрессии и активности N-ацетил-L-глутаматкиназ, уровней метаболитов в пути биосинтеза аргинина и образующихся из аргинина продуктов отработанных ранее методов.
3. Составом коллектива сотрудников, которые обладают высокой квалификацией и опытом работы с выбранными объектами и рекомбинантными белками, включая NAGK и PII.

Современное состояние исследований по данной проблеме:
Поскольку реакции ассимиляции азота имеют решающее значение для роста и развития любого фотосинтезирующего организма, изучение механизмов их регуляции привлекает особое внимание во всем мире. В цикле GS-GOGAT, 2-оксоглутарат (2-OG) вместе с аммонием, АТФ и двумя электронами (от NADH или 2 Fdred) приводит к формированию одной молекулы глутамата. Глутамат является предшественником нескольких аминокислот, включая наиболее «богатую» азотом аминокислоту аргинин. Неудивительно, что синтез аргинина неразрывно связан с процессами ассимиляции азота, которые должны эффективно контролироваться (Slocum 2005; Winter et al., 2015; Forchhammer, 2022). Клеточные уровни 2-OG, который может формироваться при фиксации CO2 и используется в реакции GOGAT, зависят от поступления азота в организм, который часто лимитирован в естественных условиях. Поэтому уровни 2-OG отражают внутриклеточный баланс углерода / азота клетки (Huergo, Dixon, 2015; Forchhammer, Selim, 2019). У цианобактерий, метаболизм азота и углерода координируется сложными регуляторными сетями, контролируемыми различными сигналами, и сигнальные белки из семейства PII играют при этом центральную роль (Forchhammer, Lüddecke, 2016; Forcada-Nadal et al., 2018, Selim et al., 2018; Forchhammer, Selim, 2019; Forchhammer et al., 2021). Гомологи цианобактериального белка PII широко распространены в царстве растений (Archaeplastida) (Uhrig et al., 2009; Winter et al., 2015).
У фотосинтезирующих эукариот, также как и у цианобактерий, активность фермента второго этапа в пути биосинтеза аргинина - N-ацетил-L-глутаматкиназы (NAGK) ингибируется аргинином. Кроме того, дополнительный уровень контроля обеспечивается через взаимодействие NAGK с белком PII (Chellamuthu et al., 2013, 2014). По последним данным NAGK – это наиболее консервативная мишень PII у Cyanobacteria и Archaeplastida (Selim et al., 2020). Белок PII активирует NAGK и тем самым предотвращает ингибирование фермента аргинином (Llácer et al., 2007, Chellamuthu 2014). На основе анализа различных кристаллических структур показано, как именно осуществляется регуляции NAGK при формировании комплекса с PII (Forcada-Nadal et al., 2018).
У некоторых красных водорослей, как и у цианобактерий, взаимодействие PII-NAGK в основном определяется соотношением АТФ/АДФ и взаимодействием с PII Mg2+-АТФ-2OG (Fokina et al., 2011; Lapina et al., 2018; Forchhammer, Selim, 2019). Снижение уровней 2-OG из-за увеличения метаболизируемого азота позволяет PII связывать NAGK и тем самым усиливать его активность. Как показано для цианобактерий, это повышает клеточный уровень аргинина и позволяет хранить азот в форме цианофицина, содержащего аргинин (Maheswaran et al., 2006; Llácer et al., 2008; Watzer et al., 2015). Сходные результаты были получены при анализе PII-мутанта A. thaliana, который имел пониженные по сравнению с диким типом уровни аргинина, орнитина и цитруллина (Ferrario-Méry et al., 2006). В отличие от цианобактерий и представителей сем. Brassicaceae (включая Arabidopsis) у Chloroplastida нами выявлен дополнительный PII-контролируемый регуляторный механизм, с помощью которого высокие уровни доступного азота активируют NAGK и за счет этого запускают синтез аргинина: связывание глутамина изменяет конформацию PII, способствуя его взаимодействию с NAGK и активации последнего (Chellamuthu et al., 2014).
Проведенный в последние годы анализ NAGK у разных зеленых водорослей (Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella variabilis и Myrmecia incisa) (Chellamuthu et al., 2014; Minaeva et al., 2015; Li et al., 2017) показал, что хотя каталитические свойства ферментов были сходными, однако они количественно различались по степени каталитической активации белком PII, ингибирующим концентрациям аргинина и концентрации глутамина, необходимой для активации NAGK. Как правило, образование комплекса PII-NAGK строго зависит от АТФ и глутамина. У C. reinhardtii 2-OG не предотвращал образование комплекса, но ингибировал PII-опосредованную активацию NAGK, указывая на то, что 2-OG оказывает пост-связывающий регуляторный эффект (Chellamuthu et al., 2014). Сходный антагонистический эффект 2-OG на активацию NAGK с помощью PII был отмечен для C. variabilis и M. incisa (Minaeva et al., 2015; Li et al., 2017). Наиболее заметные различия были обнаружены для действия аргинина. Так, NAGK из C. reinhardtii и M. incise были очень чувствительны к аргинину (IC50 составили около 0,1 мМ), тогда как NAGK из C. variabilis демонстрировал меньшую чувствительность к конечному продукту и в этом отношении напоминал NAGK из A. thailiana (IC50 - около 1 мМ). Во всех случаях активирующие концентрации глутамина находились в миллимолярном диапазоне (ЕС50 для глутамина составлял 2-6 мМ). Количественные различия в отношении эффекторных молекул глутамина, аргинина и 2-OG, вероятно, отражают метаболические адаптации различных организмов. Следовательно, анализ системы PII-NAGK дает ключ к пониманию особенностей метаболизма организма. Диагностическая ценность действия эффекторных молекул на PII-NAGK была использована, чтобы получить новое представление о метаболических адаптациях нефотосинтезирующей водоросли Polytomella parva (Selim et al., 2019). P. parva близкородственна Chlamydomonas, но характеризуется гетеротрофным образом жизни с полной потерей фотосинтеза. Пластиды водоросли лишены какой-либо ДНК, но были сохранены для специфических метаболических задач, выполняемых энзимами с ядерной локализацией их генов. Оказалось, что у P. parva PII образует очень стабильный комплекс с NAGK, независимый от каких-либо эффекторных молекул (Selim et al., 2019). В отсутствие глутамина PII увеличивает чувствительность NAGK к аргинину приблизительно в 4 раза по сравнению со свободным ферментом, тогда как уже относительно низкие концентрации глутамина противодействуют ингибиторному действию аргинина. Более того, никакого ответа на 2-OG обнаружено не было. Дополнительный метаболомный анализ показал, что P. parva, по сравнению с C. reinhardtii, накапливает значительно более высокие количества аргинина и глутамата, тогда как клеточные уровни глутамина были относительно низкими. Кроме того, мы показали, что независимое взаимодействие между эффекторными молекулами не является свойством только одного из двух белков-партнеров, но должно объясняться взаимной адаптацией обоих белков к образованию стабильных комплексов PII-NAGK. В целом, по-видимому, белки PII и NAGK в P. parva совместно эволюционировали в направлении образования стабильного гетероолигомерного комплекса для настройки активности NAGK исключительно в ответ на низкий уровень глутамина и высокий уровень аргинина.
Т.о., современные данные ясно указывают на доминирующую роль PII в контроле биосинтеза аргинина у всех изученных цианобактерий, высших растений и некоторых зеленых водорослей, где четко выявляется тесная взаимосвязь между метаболической адаптацией и контролем NAGK с помощью PII. Вместе с тем, неясно, насколько широко у эукариотических водорослей в отличие от цианобактерий используются дополнительные к PII механизмы контроля NAGK (Vlasova et al., 2023). Вопросы о причинах утраты контроля PII над активностью NAGK и анализе механизмов контроля, которые могут заменять и/или компенсировать отсутствие PII у ряда представителей красных и зеленых водорослей, пока никем не анализировались. Последнее обстоятельство существенно ограничивает наши представления о путях эволюции ключевых компонентов (ферментов и регуляторных белков) метаболизма аргинина.

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта:
В ходе реализации Проекта впервые будет использован комплексный междисциплинарный подход, который будет включать в себя разнообразные методы исследования: микробиологические, физиологические, биохимические, молекулярно-генетические, , а также спектрофлуориметрический метод. Использование такого подхода в одном проекте является оригинальным, уникальным и опирается на опыт экспериментальных исследований коллектива СПбГУ, представляющего данный проект.
Для характеристики каталитических параметров NAGK in vitro у выбранных объектов, имеются синтетические гены для соответствующих ферментов NAGK с кодонами, оптимизированными для экспрессии в Escherichia coli LEMO-21 (DE3). Гены будут клонированы в вектор pET15b, для получения рекомбинантных белков с His6 на N-конце. Затем рекомбинантные белки будут очищены на колонках Ni-NTA в соответствии с отработанной нами ранее методикой (Lapina et al., 2018) и полученные ферменты охарактеризованы следующим образом: (1) будут определены каталитические свойства NAGK (каталитические константы NAGK по отношению к NAG и ATP в качестве субстратов), (2) будет проверена возможность ингибирования NAGK аргинином; (3) проверено действие разных соотношений АДФ / АТФ; оценено потенциальное действие промежуточных метаболитов синтеза аргинина и ЦТК.
Каталитическая активность очищенных His6-NAGK будет измерена в сопряженных реакциях фосфорилирования NAG с окислением NADH (Lapina et al., 2018). В присутствии ATP одна единица NAGK катализирует превращение 1 mmol NAG min-1. Генерируемый в ходе фосфорилирования ADP используется пируваткиназой, приводящей к формированию пирувата, на который далее действует лактатдегидрогенза, что в свою очередь приводит к окислению NADH. В результате сопряженных реакций фосфорилирование одной молекулы NAG ведет к окислению одной молекулы NADH, что вызывает линейное снижение поглощения при 340 нм.
Анализ активности NAGK in vivo будет проводится на клеточных экстрактах выбранных для анализа водорослей как нами описано для Chlamydomonas (Vlasova et al., 2023).
Уровни аргинина в клетках будут оценены с помощью метода Сакагучи как описано (Lapina et al., 2019).
Проверка уровней экспрессии генов, кодирующих NAGK, будет проведена отработанным ранее методом ПЦР в режиме реального времени (Ermilova et al., 2007, 2010, 2013, Filina et al., 2019).
Для характеристики PII-белков M. pusilla и D. salina будут получены рекомбинантные PII, содержащие С-концевой пептид Strep-tag II, который будет экспрессирован в PII-мутанте E. coli RB906048 и очищен с помощью аффинной хроматографии на колонке Strep-Tactin Superflow (IBA), как описано нами ранее (Lapina et al., 2018).
Общий план работы на весь срок выполнения проекта
1. Анализ регуляции биосинтеза аргинина (транскрипции генов, кодирующих ферменты, и промежуточных метаболитов), контроля активности (in vitro и in vivo) и экспрессии NAGK у галофильной модельной водоросли Dunaliella salina при разном содержании NaCl в среде.
2. Клонирование генов argB в вектор pET15b с последующим выделением и очисткой N-ацетилглутаматкиназ представителей Mamiellophyceae (OtNAGK, OlNAGK, BpNAGK, МрNAGK). Проведение сравнительного анализа кинетических параметров полученных ферментов.
3. Выяснение возможности контроля МрNAGK белком PII с дополнительным удлинением в Т-петле .
4. Подбор условий для проведения сравнительного анализа метаболитов биосинтеза аргинина, экспрессии генов, кодирующих NAGK, а также активности ферментов NAGK in vivo у представителей Ostreococcus tauri, Ostreococcus lucimarinus, Bathycoccus prasinos и Micromonas pusilla при росте на разных источниках азота и в условиях голодания по азоту.

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту.
Проводимые в лаборатории СПбГУ, возглавляемой проф. Е.В. Ермиловой, многолетние исследования одноклеточных водорослей позволили расшифровать многие аспекты регуляции метаболизма азота и показать, что зеленые водоросли могут служить удобной экспериментальной системой для изучения фундаментальных аспектов биологии растений в целом (Chellamuthu, Ermilova, Lapina et al., Cell, 2014). Ранее в лаборатории был получен фактический материал, впервые показывающий, что PII-зависимые сигнальные системы функционируют у представителей Chlorophyta (Ermilova et al., 2013; Minaeva et al., 2015; Minaeva, Ermilova, 2017). Нами охарактеризована регуляция синтеза PII-белков Chlorophyta (Ermilova et al., 2013; Zalutskaya et al., 2019; Lapina et al., 2020). Впервые проведенный комплексный анализ структуры и функций PII-белка модельной красной водоросли Porphyra purpurea показал, что PII-зависимая сигнальная система красных водорослей по своей организации занимает промежуточное эволюционное положение между PII-системами цианобактерий и Chlorophyta (Lapina et al., 2019). Кроме того, экспериментально доказано, что PII-белки зеленых и красных водорослей формируют тримеры и структурно сходны с бактериальными гомологами.
Нами установлено, что на протяжении всей эволюции фототрофов с оксигенным типом фотосинтеза – от цианобактерий до Archaeplastida – наиболее консервативной клеточной мишенью PII-белка оказался контролирующий биосинтез аргинина фермент, N-ацетил-L-глутаматкиназа (Lapina et al., 2019; Selim et al., 2019). Впервые показано, что в отличие от цианобактерий контроль фермента NAGK модельной водоросли Chlamydomonas reinhardtii in vivo происходит как на уровне транскрипции, так и на посттрансляционном уровне, и т.о. регуляция с помощью белка PII представляет собой интегральную часть более сложной регуляторной сети (Vlasova et al., 2023). Кроме того, последние данные позволили нам поставить вопрос о пересмотре PII-зависимой регуляции биосинтеза аргинина у Chloroplastida как единственно возможной (Selim et al., 2020).
За время исследования коллективом лаборатории механизмов рецепции, передачи и интеграции экзо- и эндогенных сигналов, которые позволяют зеленым водорослям оптимизировать использование имеющихся в окружающей среде питательных субстратов, были разработаны оригинальные микробиологические и молекулярно-генетические подходы (Ermilova et al., 1993, 1998, 2000, 2004, 2007, 2009, 2010, 2013, 2014). Отработан ряд методов, включая Pull-Down-метод с последующей тандемной масс-спектрометрией, методику изучения взаимодействия белков на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса, конфокальную микроскопию, спектрофлуориметрию и анализ нитрозирования белков.
Краткий обзор результатов авторского коллектива показывает, что они внесли заметный вклад в изучение PII-белков и регуляцию метаболизма азота водорослей, владеют многими методами анализа белков и все это, а также наличие в лаборатории коллекции одноклеточных водорослей и необходимой приборной базы позволяет надеяться, что программа проекта будет успешно выполнена.