Итоговый отчет по гранту No (17-02-00313)
«Исследование фрактальной организации хроматина в ядре живой клетки методами малоуглового и ультрамалоуглового рассеяния нейтронов»
Руководитель: Григорьев Сергей Валентинович





Реферат
Проект был направлен на исследование и разработку методов анализа фрактальной организации объектов биологической природы с использованием принципов и подходов малоуглового рассеяния нейтронов.
Хроматин в клеточном ядре образует сложные пространственные структуры с несколькими уровнями организации и его крупномасштабная организация принципиально отличается от его мелкомасштабной структуры [24-29]. На сегодняшний момент наиболее популярная модель, описывающая трехмерную конфигурацию упаковки хроматина в ядре клетки --- модель складчатой или фрактальной глобулы. Данная модель предполагает, что хроматиновая фибрила укладывается самоподобным образом, напоминая известную в теории фракталов кривую Пеано, которая имеет размерность 3 и полностью заполняет трехмерное пространство [11, 30]. Классическая кривая Пеано --- это кривая на плоскости, и с математической точки зрения, она является необычным представлением области или участка плоскости (двумерного пространства), размерность Хаусдорфа (фрактальная размерность) DF которого естественным образом равняется 2 [7]. Это определение можно обобщить на случай трехмерного пространства, и, таким образом, кривая Пеано в 3D осуществляет способ полностью заполнить пространство, и, соответственно, её размерность Хаусдорфа равна 3.
Одним из наиболее достоверных и информативных методов исследования субмикронных объектов является малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН), характеризующее структуру объекта в диапазоне размеров от 1 нм до 1 мкм. С помощью МУРН можно узнать размер, форму и внутреннюю структуру нанообъектов. В отличие от микроскопии, методы рассеяния дают информацию от всего объема образца, что делает их совершенно необходимыми для изучения трехмерных объектов. Эксперименты по малоугловому рассеянию нейтронов, способны подтвердить или опровергнуть справедливость той или иной модели, построенной для описания крупномасштабной структуры хроматина.
Основываясь на классификации фрактальных объектов, разработанной с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН), было показано, что модель фрактальной глобулы не удовлетворяет экспериментальным данным малоуглового рассеяния нейтронов на ядрах биологических клеток [5]. Напротив, модель логарифмического фрактала хорошо описывает экспериментальные данные МУРН, а, следовательно, и является хорошим приближением для описания крупномасштабной структуры хроматина. Модель логарифмического фрактала предсказывает, что ядерное пространство заполнено хроматином ровно наполовину, в то время как остальная его половина составляет межхроматиновые пустоты, заполненные нуклеоплазмой, в которой осуществляются различные ядерных процессы. Таким образом, в структурной организации хроматина сбалансированы две противоборствующие тенденции: увеличение площади поверхности хроматина в ядре клетки (доступности для внешних агентов) и уменьшение объема занимаемого хроматином (компактности ядра) [1-5].
Установленные в результате выполнения проекта закономерности вносят значительный вклад в современные сведения о фрактальной организации хроматина в интерфазном ядре биологической клетки. Полученные экспериментальные результаты могут быть востребованы в научных лабораториях, занимающихся проблемами генетики и клеточной биологии, и в будущем могут быть полезны при разработке лекарств против онкологии.

Содержание:

Введение 2
Основная часть отчета о НИР 4
Заключение 12
Список литературы 13


Введение
При всех впечатляющих успехах биологии и генетики за последние десятилетия, корректное описание структурной организации хроматина в ядре эукариотической клетки остается вопросом, до конца нерешенным. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — это невероятно длинная полимерная молекула, находящаяся в относительно небольшом ядре клетки. Многократное сокращение линейных размеров ДНК обеспечивается её упаковкой в хроматин с помощью специальных архитектурных белков. Например, если распаковать геном человека, то его длина составит 2 метра, в то время как диаметр ядра меньше 10 микрон, а самый большой, известный на данный момент, геном в 200 раз больше, чем у человека (Amoeba dubia).
Кроме хранения генетической информации, в период интерфазы в ядре клетки осуществляются сложные процессы биосинтеза ДНК, а также считывание информации о структуре белка. Жизненно важные функции осуществляются за рекордно короткое время. Нить ДНК должна очень быстро распаковываться, чтобы нужный участок гена мог быть считан. С другой стороны макромолекула ДНК уложена в очень небольшом объеме. Предполагается, что особенности структурной укладки хроматина определяют принципы внутриядерного транспорта. Удивительно, что понимая, как работают, те или иные гены в составе ДНК, мы все еще не знаем всех принципов упаковки хроматина в ядре.
С одной стороны, структурная организация хроматина приводит в высшей степени его компактности, а с другой, к способности быстрой распаковки ДНК. Предполагается, что именно эти два фактора формируют структурный и функциональный дизайн организмов. Первый из них - это стремление к максимальной метаболической способности, поскольку он производит энергию и вещества, необходимые для поддержания и воспроизведения жизни. Достигается это за счет увеличения площади поверхности, через которую происходит обмен ресурсами с окружающей средой. Второй фактор - увеличение внутренней эффективности метаболизма за счет уменьшения расстояния, на которое транспортируются материалы, и, следовательно, время, необходимое для транспорта [8]. Эта тенденция к уменьшению приводит к компактизации живой системы, иными словами, к минимизации объема. Эти два фактора являются противоположными друг другу, и морфология живого организма, формирующегося под влиянием двух противоборствующих факторов и принимает наиболее выгодную для выживания форму. Кроме того, простота реализации законов воспроизведения является третьим, не менее важным свойством, к которому стремится жизнь. В природе структуры зачастую генерируются многократным повторением одного и того же морфогенетического механизма, например, ветвления. Наиболее наглядной реализацией этого принципа являться дерево.
Дерево старается занять как можно больше пространства для получения максимума воды и света, при этом его ресурсы, поступающие из земли ограничены. В результате оно растет таким образом, что на каждом следующем уровне ветвления, сумма квадратов радиусов веток равна квадрату радиуса ветви из которой произошло ветвление. Рекуррентное свойство, описывающие рост дерева было замечено еще Леонардо Да Винчи [9].
В настоящее время для сопоставления взаимодействия хроматина в интересующих областях ДНК и по всему геному широко используется методология захвата конформации хромосом (3С) [10]. Полученные данные взаимодействия генов в хроматине (например, наличие хроматиновых петель и хромосомных доменов) можно использовать для построения модели пространственной организации хроматина. В отличие от микроскопических методик метод 3С и другие методы (4C, 5C, Hi-C), разработанные на его основе, не фиксируют конкретное событие взаимодействия в пределах одной клетки, а измеряют вероятность взаимодействия двух областей генома в большой (10^5 - 10^6) популяции клеток [11]. Эти методы позволяют изучить взаимодействие удаленных друг от друга участков ДНК в трехмерном пространстве. Метод 3C показывает взаимодействуют ли друг с другом определенные участки генома. Метод 4C характеризует взаимодействия одного участка со всеми остальными. Наконец, метод 5C дает возможность изучить взаимодействия "всех со всеми" на небольшом участке генома, а Hi-C - на всем геноме, с разрешением до 1000 пар нуклиотидов.
Однако, у методов захвата конформации хромосом есть свои недостатки. После сопоставления, фильтрации и коррекции данных Hi-C составляется матрица взаимодействия генома, в которой каждая ячейка отражает частоту взаимодействия между двумя генами. Извлечение соответствующих биологических знаний из этой матрицы взаимодействия является одной из основных проблем анализа данных Hi-C. Оно включает в себя дифференциацию полезного сигнала от шума, идентификацию моделей взаимодействия и интерпретацию полученных закономерностей. Существует ряд факторов, которые усложняют этот анализ. Во-первых, нужно учитывать тот факт, что измеряются частоты взаимодействия в популяции клеток. Это имеет решающее значение с точки зрения интерпретации данных, поскольку, когда мы рассматриваем шаблон взаимодействия, состоящий из нескольких пар генов, мы не можем различать сценарии, в которых взаимодействия могут происходить одновременно в одной ячейке, являются взаимоисключающими или где-то между ними. Соответственно, наблюдение за усредненной матрицей взаимодействия, которая показывает небольшую позиционно-специфическую структуру, не исключает существования структуры в нижележащих геномах. Это просто означает, что если такие структуры существуют, они не согласуются между клетками. Во-вторых, ограничение сегодняшних методов анализа состоит в том, что часто шаблоны определяются не явно, а косвенно. Другими словами, вместо того, чтобы формально определять, как выглядит конкретный шаблон взаимодействия, и искать его в матрице взаимодействия, шаблоны взаимодействия определяются как выходные данные некоторого метода. Например, геномные компартменты (области хроматина, в которых происходят различные процессы, связанные с активностью генома) отображаются в виде шахматного шаблона взаимодействия, но они идентифицируются с помощью метода, который явно не ищет этот шаблон. В результате трудно оценить обоснованность метода или сравнить методы, направленные на выявление однотипного шаблона взаимодействия. В-третьих, различные типы моделей взаимодействия сосуществуют и перекрывают друг друга. Трудно разделить различные типы шаблонов взаимодействия, учитывая, что во многих случаях нам не хватает явного определения этих шаблонов. В-четвертых, важно помнить, что Hi-C измеряет частоту взаимодействия между генами, а не расстояние. Формальдегидные сшивки будут только между генами, которые физически взаимодействуют. Таким образом, слабый сигнал Hi-C между двумя генами указывает на то, что взаимодействие произошло в небольшой части популяции, но мы не можем определить расстояние между ними, не делая некоторые упрощающие предположения о том, как частоты взаимодействия связаны с физическими расстояниями. Наконец, нельзя предполагать эргодичность частот взаимодействия. Другими словами, частоты в клеточной популяции не обязательно должны интерпретироваться как частоты во времени. Например, взаимодействие, которое происходит в небольшом объеме клеток и, таким образом, производит слабый сигнал в Hi-C, не значит, что оно обязательно является неустойчивым взаимодействием [12].
Упаковка ДНК происходит в несколько этапов. Наиболее изученной считается нуклеосомная структура интерфазного хроматина, в то время как его крупномасштабная структура на сегодняшний момент достоверно неизвестна.


Основная часть отчета о НИР
1. Классификация фрактальных объектов конечных размеров с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов
Представлен подход для расчета корреляционной функции, основанный на анализе сечения рассеяния. В этом подходе профиль сечения рассеяния нейтронов рассматривается как наблюдаемое свойство фрактальной частицы. В модели учитываются два основных параметра частицы: конечный размер ξ и степень ее фрактальности D, детектируемые через призму малоуглового нейтронного рассеяния. Описание охватывает в единой картине поверхностные и объемные фракталы, а также случай, соответствующий закону рассеяния dσ/dΩ ~ Q-3 . Корреляционная функция γ(r) для объемных и поверхностных фракталов описывается общим выражением
γ(r)=2/Г(D/2-1) (r/2ξ)^((D-3)/2) K_((D-3)/2) (r/ξ), (1)
где Г(x) - Гамма функция и Кn(x) - функции Макдональда n-ого порядка (Рис.1). При 2<D<3 корреляционная функция соответствует объемному фракталу с D = Dm , при D = 3 логарифмическому, при 3 < D < 4 поверхностному с D = 6 − Ds (Dm и Ds - фрактальные размерности объемного и поверхностного фракталов). Кроме того, корреляционные функции для неограниченных фракталов, как объемных, так и поверхностных совпадают с асимптотикой полученного выражения Ур.(1) при r/ξ<1, где ξ — корреляционная длина частицы. Также получено выражение для одномерной корреляционной функции G(z), которая измеряется в методе спин-эхо МУРН, которое описывается аналогичным выражением, со сдвигом индекса функции Макдональда и показателя степенной функции на 1/2.
Пограничный случай перехода от объемного к поверхностному фракталу, характеризующийся зависимостью интенсивности рассеяния от переданного импульса I(Q)∼(1+(Qξ)2)-3/2, соответствует СЭМУРН функции G(z) равной убывающей экспоненте exp(-z/ξ), а корреляционная функция в области фрактального поведения в этом случае пропорциональна ln(ξ/r) и имеет необычное масштабное свойство γ(r/a)=γ(r)+ln(a), т. е. уменьшение масштаба дает аддитивную добавку к корреляционной функции, а не мультипликативную, как в случае объемного фрактала. Результаты опубликованы в работе [1].
2. Исследование структурной организации хроматина в ядрах куриных эритроцитов методами МУРН, ультра МУРН и СЭМУРН
Исследована организации хроматина в ядрах куриных эритроцитов. Интенсивность малоуглового рассеяния нейтронов в диапазоне переданных импульсов [10−2 ÷ 10−1] nm−1 описывается степенной функцией I(Q) ~ Q−D со степенью D=2.46±0.01 (Рис. 2). Интенсивность рассеяния нейтронов диапазоне переданных импульсов [10−3 ÷ 10−2] nm−1 также имеет степенную зависимость со степенью D=3.005±0.005 (Рис. 2). Различие между степенями, обнаруженными в разных диапазонах по переданному импульсу Q, приводит к заключению о том, что фрактальная структура ДНК в ядре меняет свой характер при переходе от малого масштаба (десятки нанометров) к большему масштабу (сотни нанометров).
Для исследования крупномасштабной структурной организации хроматина в ядре живой клетки был использован метод спин-эхо малоуглового рассеяния нейтронов (СЭМУРН). На Рис.3 представлены результаты измерения поляризация P(z) на ядрах куриных эритроцитов и, извлеченная из нее, СЭМУРН корреляционная функция G(z). Экспериментальные данные демонстрируют экспоненциальный закон G(z) = exp(−z/ξ) для функции СЭМУРН, где ξ = (3.29±0.07)•мкм — корреляционная длина исследуемого ядра. Экспоненциальная функция СЭМУРН соответствует кубическая зависимость сечения рассеяния нейтронов в пространстве переданных импульсов и логарифмической корреляционной функции γ(r)∼ln(ξ/r) при r/ξ<1 (в области фрактального поведения).
Имеющиеся экспериментальные данные по МУРН и спин-эхо МУРН представляют сложную картину двухуровневой фрактальной организации хроматина в ядре. Мелкомасштабная фрактальная структура соответствует объемному фракталу с размерностью DF=2,46, а крупномасштабная соответствует логарифмическому фракталу с корреляционной функцией γ(r)∼ln(ξ/r). Характеристики этих двух наблюдаемых типов организации хроматина в ядре совершенно различны. Объемный фрактал самоподобен на разных масштабах, тогда как логарифмический фрактал иерархически изменяется при масштабировании [1-5].
Структура логарифмического фрактала формируется, на наш взгляд, под влиянием двух факторов: максимизации площади поверхности (доступность для внешних агентов) и минимизации объема (компактность). Максимально возможная площадь поверхности способствует диффузионным процессам и механизмам целевого поиска ядерных белков, таким как транскрипция. С другой стороны, логарифмический фрактал является более компактным, чем объемный фрактал, и поэтому эффективность взаимодействий между удаленными геномными локусами повышается за счет уменьшения расстояния между ними [2]. А это, в свою очередь, соответствует особому типу самоподобия с аддитивным законом масштабирования, а не мультипликативным, как в случае объемного фрактала.
Что касается мелкомасштабной фрактальной организации, то она имеет структуру, напоминающую кластер диффузионно-ограниченной агрегации и построена так, чтобы максимально облегчить диффузию белков. Результаты опубликованы в работах [2, 3].
3. Протокол измерения ядер методом СЭМУРН
Для получения достоверного СЭМУРН сигнала G(z) необходимо точно измерить постоянный уровень поляризации P(∞) = exp(-lσ), который не зависит от спин-эхо длины z. Может быть теоретически показано, что точность измерения спин-эхо корреляционной функции максимальна при P(∞) равной приблизительно 30% поляризации. Существует две возможности варьировать значение величины P(∞): менять толщину образца l или длину волны падающих нейтронов λ, вследствие чего меняется полное сечение рассеяния σ. На сегодняшний день установка SESANS является единственной действующей установкой СЭМУРН, и работает на постоянной длине волны λ=2A, поэтому единственная возможность изменять величину P(∞) - это менять толщину образца l.
Образцы ядер куриных эритроцитов были измерены при максимально возможной концентрации ядер в фосфатно-натриевом буфере в кварцевых кюветах разной толщины: 2 мм, 4 мм и 10 мм. Высота и ширина всех кювет стандартная, 25 и 20 мм, соответственно. Максимальный сигнал получен при измерении в 10 мм кювете. Кроме того, оказалось, что ядра склонны к агломерации, что также приводит к невозможности измерить постоянный уровень поляризации P(∞). Для избежания агломерации, перед каждым измерением образец ядер куриных эритроцитов был многократно пропущен в быстром потоке через шприц с толщиной иглы 1, 0.3, 0.1 мм.
Измерения с использованием техники вариации контраста показали, что присутствие небольшого количества воды H2O дает сильный некогорентный фон, из которого абсолютно невозможно извлечь полезный сигнал. Вне всякого сомнения, это является особенностью данной установки, а не метода.
4. Разработка концепции и обоснования для создания специализированной установки СЭМУРН для исследования ядер биологических клеток.
Возможность извлечения СЭМУРН сигнала от ядер куриных эритроцитов ограничена слабой рассеивающей способностью, характерной для образцов биологической природы. Рис.3 демонстрирует максимально возможный сигнал, который удалось измерить при толщине образца l=10 мм и при контраситровании тяжелой водой D2O. При исследовании ядер биологических клеток такой объем образца почти всегда недостижима, поэтому необходимо варьировать величину P(∞), изменяя полное сечение рассеяния, которое зависит от длины волны нейтронов как λ2. На Рис.4 изображены экспериментальная кривая изменения поляризации P=P0(z) при λ=2А и расчетные кривые изменения поляризации P=P0(z) при λ=4, 6, 12 А. Прочие параметры установки и эксперимента одинаковы. Видно, что чувствительность поляризации возрастает с ростом длины волны нейтронов. Оптимальная длина волны для изучения ядер биологических клеток на микронных масштабов является λ=6А. Кроме того, выбор разных длин волн позволит точно измерить спин-эхо корреляционную функцию на от от нанометрового до микронного масштабов.
Измерения при 3 различных длин волн (2, 4, 6А) в СЭМУРН аналогично 3 измерениям с разными расстояниями образец-детектор (2, 10, 18 м) в классическом МУРН. СЭМУРН установка с опцией изменения длиной волны нейтронов в диапазоне от 2 до 12 А будет востребована для изучения объектов биологического происхождения.
Для правильного выбора условия эксперимента по СЭМУРН, должны быть осуществимы следующие опции: 1. возможность изменения длины волны; 2. применение техники вариации контраста; 3. возможность изменения толщины образца. Результаты опубликованы в работе [3].

2. Исследование структурной организации хроматина в ядрах HeLa методами МУРН, ультра МУРН и СЭМУРН
Исследована организации хроматина в ядрах HeLa (Рис.5). Интенсивность малоуглового рассеяния нейтронов в диапазоне переданных импульсов [8∙10−2 ÷ 7∙10−1] nm−1 описывается степенной функцией I(Q) ∼ Q−D со степенью D = 2.41 ± 0.01. Эта зависимость демонстрирует фрактальную организацию упаковки ДНК в ядре с размерностью равной степени D. Интенсивность рассеяния нейтронов (Рис.5) диапазоне переданных импульсов [1.5∙10−3 ÷ 8∙10−2] nm−1 описывается степенной функцией с учетом конечного размера рассеивателя I(Q)~〖(1+〖(Qξ)〗^2)〗^(D/2) со степенью D=2.92±0.01 и корреляционной длиной ξ=6164±84nm. Различие между степенями, обнаруженными в разных диапазонах по переданному импульсу Q, приводит к заключению о том, что фрактальная структура ДНК в ядре меняет свой характер при переходе от малого масштаба (десятки нанометров) к большему масштабу (сотни нанометров). Независимые измерения по Спин-Эхо МУРН (Рис.6) дают функцию СЭМУРН, которая хорошо описывается экспоненциально затухающей функцией G(z) = exp(-z/ξ), где ξ = (5.1 ± 0.1) ∙ 103 нм - корреляционная длина ядра HeLa в диапазоне спин-эхо длин [3∙102 ÷ 1.6∙104] нм.
Согласно концепции рассеяния на фрактальных объектах [9] корреляционная функция ядра HeLa на масштабах от 9 нм до 80 нм является степенной функцией γ(r) ∼ (r/ξ)D−3, с D=2,41. Степенная корреляционная функция соответствует объемной фрактальной структуре с фрактальной размерностью Df = 2,41. На более крупных масштабах, т. е. от 80 нм характер корреляционной функции изменяется на логарифмический γ(r) ∼ ln(ξ/r) и простирается вплоть до масштаба, соответствующего корреляционной длине ядра HeLa, равной 5100 нм. Результаты опубликованы в работе [4].
6.1 Исследование методами ультра МУРН и СЭМУРН процесса агломерации ядер HeLa
Методами малоуглового рассеяния и конфокальной было установлено, что ядра HeLa агломерируют со временем, взаимопроникая друг в друга. Интенсивность ультра малоуглового рассеяния нейтронов на изолированных (синие точки) и агломерированных (черные точки) ядер HeLa в области малых значений переданного импульса показаны на Рис.7. Кривая рассеяния на агломерированных ядрах HeLa демонстрирует небольшую выпуклость, которая исчезает после того, как образец несколько раз пропустить через шприц с тонкой иглой, иными словами, пропустить суспензию ядер в быстром потоке. Для анализа изменения интенсивности рассеяния, возникшей при агломерации ядер, кривые рассеяния, соответствующие агломерированным ядрам и изолированым были поделены на расчетную кривую рассеяния, которая соответствует ядрам изолированным (Рис. 8). Таким образом был выделен вклад в рассеяние, связанный с парной корреляцией между ядрами. Обнаруженный пик можно рассматривать как структурный фактор агломерированных ядер.
Пик на Рис. 8 хорошо описывается функцией Лоренца в логарифмических координатах с центром при Q=(5.5+/-0.3)∙10-3 нм-1. Положение максимума пика соответствует корреляции на расстоянии порядка 1 микрон, в то время, как размер самого ядра чуть больше 6 микрон. Принимая во внимание то, что ядра фиксированы и с самим ядром ничего происходить не может и тот факт, что агломерация ядер дает корреляционный пик на масштабах в пять раз меньших размера самого ядра, логично предположить, ядра HeLa проникают друг в друга при агломерации.
Изменение корреляционной функции СЭМУРН при агломерации можно рассматривать с точки зрения дополнительного рассеяния нейтронов на корреляциях ядрах. В этом случае функция, связанная с агломерацией, может быть извлечена путем деления одного набора данных на другой. На Рис. 9 представлено отношение рассчитанной по выражению поляризации, соответствующей изолированным ядрам HeLa к экспериментальной поляризации соответствующей агломерированным ядрам HeLa (черные точки) и изолированым ядрам HeLa (синие точки). Таким образом, может быть выделен вклад в функцию СЭМУРН от агрегированных (взаимопроникающих) ядер. Выделенный вклад может быть также хорошо аппроксимирован функцией Лоренца в логарифмических координатах с центром в 2 мкм. При агломерации ядра взаимопроникают, и их характерная глубина проникновения достигает при z=2 мкм, в то время как размер ядра равен 5,1 мкм.
В обоих экспериментах (МУРН и СЭМУРН), корреляционный пик описывается стандартной функцией (функция Лоренца), но в логарифмическом масштабе. Это может быть связано с тем, что логарифмически растянутая вдоль оси абсцисс функция Лоренца должен быть тесно связан с логарифмическим характером корреляционной функции. Иначе говоря, если объекты с внутренней структурой, которая описывается логарифмической корреляционной функцией, взаимопроникают, то они дают парную корреляционную функцию, которая описывается функцией Лоренца в логарифмическом масштабе. Результаты опубликованы в работе [4].
8. Исследование крупномасштабной организации хроматина в ядрах лимфоцитов крыс и человеческой глиомы с помощью времяпролетной методики СЭМУРН
Для исследования крупномасштабной организации хроматина в ядрах крысиных лимфоцитов и ядрах человеческой глиомы была использована времяпролетная методика спин-эхо малоуглового рассеяния нейтронов. Поскольку спин-эхо длина z квадратично зависит от длины волны нейтронов, то измеряемый сигнал должен быть нормирован на квадрат длины волны нейтронов. На Рис.10 представлены результаты измерения ln(P/P0)/λ2 на ядрах крысиных лимфоцитов и глиомы. Каждый образец был измерен при разных конфигурациях устройств прецессии, что дало возможность получить спин-эхо сигнал в широком диапазоне спин-эхо длин. Для обоих типов ядер экспериментальные данные демонстрируют экспоненциальный закон спин-эхо корреляционной функции G(z)=exp(−z/ξ) для функции СЭМУРН, где ξ = (3.5±0.1)•мкм — корреляционная длина ядер крысиных лимфоцитов, а ξ = (7.8±0.1)•мкм— корреляционная длина ядер человеческой глиомы. Экспоненциальная функция СЭМУРН соответствует кубическая зависимость сечения рассеяния нейтронов в пространстве переданных импульсов и логарифмической корреляционной функции γ(r)∼ln(ξ/r) при r/ξ<1 (в области фрактального поведения).
Исследования ядер крысиных лимфоцитов и глиомы человека методом СЭМУРН подтверждают гипотезу об универсальном принципе строения крупномасштабной структуры хроматина в виде логарифмического фрактала.
5. Модель крупномассштабной организации хроматина в интерфазном ядре
Метод СЭМУРН является комплементарным методу МУРН, поскольку в обоих методах измеряется пространственная корреляционная функция рассеивающего объекта [6]. Можно показать, что зависимости сечения МУРН
I(Q) = A(1 + (Qξ)2 )−3/2 (2)
и зависимости функции СЭМУРН
G(z) = exp(−z/ξ) (3)
соответствует пространственная корреляционная функция следующего вида
γ(r) = 1/πK0(r/ξ), (4)
где K0(x) — функция Макдональда нулевого порядка. В области малых r (r/ξ < 1), функция Ур.(4) имеет логарифмический характер
K0(r/ξ) ≃ ln(ξ/r). (5)
Такое поведение корреляционной функции соответствует особому типу фрактального объекта, отличающегося от объемного и от поверхностного фракталов. Легко видеть, что корреляционная функция Ур.(5) имеет следующее масштабное свойство
γ(r/a) = γ(r) + ln(a), (6)
т. е. уменьшение масштаба дает аддитивную добавку к корреляционной функции, а не мультипликативную, как в случае объемного фрактала.
Физический смысл пространственной корреляционной функции — это вероятность найти ненулевую плотность на разных масштабах. Зная корреляционную функцию, можно найти объем частицы. Интегрируя γ(r) по трехмерному пространству получаем:
V(r)=4π ∫_0^r▒〖r'2 γ(r')dr'〗 (7)
В нашем случае логарифмического фрактала Ур.(4.8) интеграл, с точностью до
константы, равен
V (r) ∼ r3ln(ξ/r) (8)
Заметим, что объём является частным случаем понятия меры. Для описания фрактальных множеств вводится мера Хаусдорфа или Df -мера [7]:
µDf (r) = rDf , (9)
где Df — размерность Хаусдорфа-Безикевича, принимающая дробные значения. Число сфер размером r, нужное для покрытия регулярного фрактала равно
N(r) = r−Df (10)
Фрактал определяется, как множество, у которого размерность Хаусдорфа-Безиковича Df больше топологической размерности DT. Она определяется посредством покрытий, например, для точки DT = 0, для отрезка DT = 1, для плоской фигуры DT = 2, и т.д. Это определение описывает регулярные фракталы, такие, как канторова пыль, снежинка Коха, ковер и губка Серпинского, кривые дракона и кривые Пеано и Гильберта. Все они обладают геометрически правильной, регулярной структурой. Каждый фрагмент такого геометрически правильного фрактала в точности повторяет всю конструкцию в целом.
Однако, существуют объекты, для которых размерность совпадает с его размерностью Хаусдорфа DT = Df , но в тоже время они не являются ни отрезком, ни плоскостью, ни шаром. Дело в том, что они описываются логарифмической мерой, а не мерой Хаусдорфа Ур.(9):
µ(r) = rDf lnΔ(1/r), (11)
где ∆ — подразмерность [7]. Это связано с тем, что размерности Хаусдорфа-Безиковича не хватает для их описания, поскольку такие объекты характеризуются иерархическим строением, что и отражает наличие логарифма. А сам характер иерархии отражается в значении подразмерности. Отрицательное значение подразмерности несет в себе конструктивную иерархию: каждое последующее поколение фрактала надстраивается на предыдущем поколении. В случае положительной подразмерности иерархия носит деструктивный характер: и каждое последующее поколение вычитается из предыдущего.В обоих случаях абсолютное значение подразмерности отражает скорость изменения между поколениями. Аналогами деструктивного и конструктивного строения регулярного фрактала являются снежинка Коха и ковер Серпинскрого, соответственно. В первом случае фрактал строится путем добавления отрезков, а во втором с помощью вычитания треугольников. Число покрытий, требуемое, чтобы замостить логарифмический фрактал равно
N(r) = r−Df ln−Δ(1/r). (12)
Важно отметить, что многие биологические объекты являются по своей структуре логарифмическими фракталами. Закон роста деревьев описывается логарифмическим фракталом с Df = 2 и ∆ = −1 [8]. В данную модель заложено изменение сечения веток, в то время как их длина может быть произвольной. Поэтому фрактальная и топологическая размерность этого фрактала равны 2. Отрицательная подразмерность означает, что фрактал наращивается с каждым ветвлением дерева сечениями веток, площадь и число которых зависит от уровня ветвления. Фрактал строится из суммы всех сечений на каждом уровне ветвления. Абсолютное значение подразмерности, равное 1 значит, что на каждой итерации n-ой итерации площадь фрактала увеличивается на одинаковое значение, равное площади первого поколения Sn = n • S1 , таким образом выполняется правило Да Винчи.
Разветвления бронхов в легких описываются логарифмическим фракталом с Df = 3 и ∆ = −1. Строится он аналогичным образом, как и предыдущий, только вместо двумерных сечений берутся трехмерные цилиндры, которые характеризуются объемом. Такое строение обеспечивает наименьшее сопротивление воздуха в легких. При этом выполняется условие постоянства отношения сопротивления к поперечному сечению на всех участках системы, как до, так и после разветвления [7].
Структурная организация хроматина в ядрах куриных эритроцитов является логарифмическим фракталом с Df = 3 и ∆ = 1 на масштабах от сотен до тысячи нанометров. Здесь мы имеем дело с деструктивной иерархией. Стартуя с трехмерного плотного пространства, мы с каждой итерацией вычитаем объем, так что выполняется следующее условие на каждой итерации Vn = Vn+1 /n. Для простоты изобразим такой фрактал на плоскости, где в роли объема выступает площадь Рис.11. Так на первой итерации из плотного пространства вычитается площадь, формируя первичную складку, так что объем уменьшается вдвое. Далее, в том месте, где складка однородна вычитается площадь, формируя складки второго поколения и объем, занимаемый фракталом равен трети от первоначального. Число и густота складок на каждом следующем поколении увеличивается. Уместна следующая аналогия с деревом в том смысле, что Каждая складка является веткой, дающей начало другим более мелким и многочисленным веткам-складкам. Число и плотность, и конечно, размер складок-веток зависит от их поколения.
Нить ДНК имеет иерархически разветвленную структуру, похожую на трехмерное сферически симметричное дерево складок, что обеспечивает максимальную доступность любого участка из вне и максимально компактную, плотную структуру. По всей видимости, такая структура является характеристической для живых систем. Результаты опубликованы в работе [2].

Заключение
Разработана концепция рассеяния нейтронов на ограниченных фрактальных объектах, основанная на анализе сечения рассеяния нейтронов, в рамках которой проведена классификация фракталов, которая привела к открытию и математическому описанию логарифмического фрактала, соответствующего пограничному случаю перехода от объемного к поверхностному фракталу.
Ядра куриных эритроцитов были использованы в качестве образца здоровых клеток, а клетки HeLa в качестве образца раковых клеток. Полученные образцы ядер были исследованы методом малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН), ультра МУРН и спин-эхо МУРН. Наднуклеосомная организация хроматина в ядрах куриных эритроцитов и ядрах HeLa представляет собой двухуровневую фрактальную структуру, что подкрепляет общую гипотезу о би-фрактальной структуре хроматина в интерфазных ядрах. Мелкомасштабный фрактальный уровень описывается моделью объемного фрактала с размерностью DF = 2.46 в ядрах куриных эритроцитов и DF = 2.41 в ядрах HeLa. Крупномасштабный фрактальный уровень описывается моделью логарифмического фрактала. Структура логарифмического фрактала в ядрах HeLa простирается на две декады, в то время как объемный фрактал распространяется только на одну. Напротив, в ядрах куриных эритроцитов логарифмический фрактал обнаружен в пределах одной декады, а объемный фрактал распространен на две. В отличие от ядер куриных эритроцитов, ядра HeLa имеют тенденцию агломерироваться во времени. Большой диапазон распространения логарифмической фрактальной структуры крупномасштабной организации хроматина позволяет ядру HeLa глубоко проникать в соседнее ядро в процессе агломерации. Феномен взаимопроникновения ядер HeLa показывает, что свободное от хроматина пространство одного ядра может быть занято не чем-то пренебрежимо малым: оно равно объему, занимаемому самим хроматином.
Исследования ядер крысиных лимфоцитов и глиомы человека методом СЭМУРН в рамках данного проекта подтверждают гипотезу об универсальном принципе строения крупномасштабной структуры хроматина в виде логарифмического фрактала.
Основные результаты исследований опубликованы в ведущих научных журналах и представлены на многих российских и международных конференциях.

Список литературы:
[1] Яшина Е. Г., Григорьев С. В. Малоугловое рассеяние нейтронов на фрактальных объектах //Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. – 2017. – №. 9. – С. 5-16.
[2] Iashina E. G. et al. Additive scaling law for structural organization of chromatin in chicken erythrocyte nuclei //Physical Review E. – 2017. – Т. 96. – №. 1. – С. 012411.
[3] Iashina E. G. et al. Spin-echo small-angle neutron scattering study of the structure organization of the chromatin in biological cell //Journal of Physics: Conference Series. – IOP Publishing, 2017. – Т. 862. – №. 1. – С. 012010.
[4] Iashina E. G. et al. Small-angle neutron scattering (SANS) and spin-echo SANS measurements reveal the logarithmic fractal structure of the large-scale chromatin organization in HeLa nuclei //Journal of Applied Crystallography. – 2019. – Т. 52. – №. 4. – С. 844-853.
[5] Яшина Е. Г., Григорьев С. В. Крупномасштабная структура хроматина: фрактальная глобула или логарифмический фрактал? //Журнал экспериментальной и теоретической физики. – 2019. – Т. 156 – №. 3 (9). – С. 540–544.
[6] Krouglov T., de Schepper I.M., Bouwman W.G., Rekveldt M.Th., J.Appl.Crystallogr., 36 117, (2003).
[7] B. Mandelbrot, The Fractal Geometry of Nature, Freeman, New York, 1983.
[8] West G. B., Brown J. H., Enquist B. J. The fourth dimension of life: fractal geometry and allometric scaling of organisms //science. - 1999. - Т. 284. - №. 5420. - С. 1677-1679.
[9] Eloy C. Leonardo’s rule, self-similarity, and wind-induced stresses in trees //Physical review letters. – 2011. – Т. 107. – №. 25. – С. 258101.
[10] Lieberman-Aiden E. et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome //science. – 2009. – Т. 326. – №. 5950. – С. 289-293.
[11] Mirny L. A. The fractal globule as a model of chromatin architecture in the cell //Chromosome research. – 2011. – Т. 19. – №. 1. – С. 37-51.
[12] Lajoie B. R., Dekker J., Kaplan N. The Hitchhiker’s guide to Hi-C analysis: practical guidelines //Methods. – 2015. – Т. 72. – С. 65-75.
[13] Finch J. T., Klug A. Solenoidal model for superstructure in chromatin //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1976. – Т. 73. – №. 6. – С. 1897-1901. %Finch J., Klug A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 73, 1897—1901 (1976).
[14] Thoma F., Koller T. Influence of histone H1 on chromatin structure //Cell. – 1977. – Т. 12. – №. 1. – С. 101-107.
[15] Woodcock C. L., Frado L. L. Y., Rattner J. B. The higher-order structure of chromatin: evidence for a helical ribbon arrangement //The Journal of cell biology. – 1984. – Т. 99. – №. 1. – С. 42-52.
[16] Bednar J. et al. Chromatin conformation and salt-induced compaction: three-dimensional structural information from cryoelectron microscopy //The Journal of cell biology. – 1995. – Т. 131. – №. 6. – С. 1365-1376.
[17] Bednar J. et al. Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1998. – Т. 95. – №. 24. – С. 14173-14178.
[18] Robinson P. J. J., Rhodes D. Structure of the ‘30 nm’chromatin fibre: a key role for the linker histone //Current opinion in structural biology. – 2006. – Т. 16. – №. 3. – С. 336-343.
[19] Woodcock C. L., Ghosh R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics //Cold Spring Harbor perspectives in biology. – 2010. – Т. 2. – №. 5. – С. a000596.
[20] Fussner E., Ching R. W., Bazett-Jones D. P. Living without 30 nm chromatin fibers //Trends in biochemical sciences. – 2011. – Т. 36. – №. 1. – С. 1-6.
[21] Ou H. D. et al. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells //Science. – 2017. – Т. 357. – №. 6349. – С. eaag0025.
[22] Joti Y. et al. Chromosomes without a 30-nm chromatin fiber //Nucleus. – 2012. – Т. 3. – №. 5. – С. 404-410.
[23] Nishino Y. et al. Human mitotic chromosomes consist predominantly of irregularly folded nucleosome fibres without a 30?nm chromatin structure //The EMBO journal.
[24] Gerlich D., Ellenberg J. Dynamics of chromosome positioning during the cell cycle //Current opinion in cell biology. – 2003. – Т. 15. – №. 6. – С. 664-671.
[25] Belmont A. Dynamics of chromatin, proteins, and bodies within the cell nucleus //Current opinion in cell biology. – 2003. – Т. 15. – №. 3. – С. 304-310.
[26] Lebedev D. V. et al. Fractal nature of chromatin organization in interphase chicken erythrocyte nuclei: DNA structure exhibits biphasic fractal properties //FEBS letters. – 2005. – Т. 579. – №. 6. – С. 1465-1468.
[27] Ilatovskiy A. V. et al. SANS spectra of the fractal supernucleosomal chromatin structure models //Journal of Physics: Conference Series. – IOP Publishing, 2012. – Т. 351. – №. 1. – С. 012007.
[28] Metze K. Fractal dimension of chromatin: potential molecular diagnostic applications for cancer prognosis //Expert review of molecular diagnostics. – 2013. – Т. 13. – №. 7. – С. 719-735.
[29] Misteli T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression //Science. – 2001. – Т. 291. – №. 5505. – С. 843-847.
[30]Мешков Д. А., Аветисов В. А. СКЛАДЧАТЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ ГЛОБУЛЫ КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАШИНЫ: ДИЗАЙН И ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ //Наноструктуры. Математическая физика и моделирование. – 2015. – Т. 13. – №. 1. – С. 5-98.