В рамках выполнения первой задачи по валидации отработанного в ходе первого года выполнения проекта протокола дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека в дофаминергические нейроны на третьей линии иПСК и отработки альтернативного протокола дифференцировки, позволяющего осуществлять криоконсервацию дифференцированных клеток, была выполнена дифференцировка линии иПСК человека WTSli046-A (European Collection of Authenticated Cell Cultures) в дофаминергические нейроны по протоколу, описанному в Doi D. et al., 2014 с модификациями, которые включали использование реактивов, производства STEMCELL Technologies, вместо реактивов, производства Wako и STEMGENT, отсутствие сортировки после 12 дня дифференцировки и использование AggreWell™800 (StemCell) для культивирования на этапе эмбриоидных телец (протокол 1). На 53 день дифференцировки были получены клетки, которые были проанализированы а) при помощи иммунофлюоресцентного окрашивания и была оценена экспрессия маркеров дофаминергических нейронов тирозин гидроксилазы (tyrosine hydroxylase (TH)), MAP2, Lmx1a; б) при помощи метода высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) было оценено содержание дофамина и его метаболитов (дигидроксифенилуксуной кислоты (3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) и гомованилиновой кислоты (homovanillic acid (HVA)); в) при помощи метода patch-clamp в конфигурации “целая клетка” был оценен потенциал действия полученных клеток.
Также в рамках первой задачи была запланирована отработка второго протокола дифференцировки иПСК, описанного в статье Nolbrant S. et al. (2017), который позволяет использовать криозаморозку полученных нейрональных прогениторов. Для отработки данного протокола были использованы линии иПСК человека WTSli046-A и WTSli004-A. Единственной модификацией, которая была внесена в протокол, описанный в статье Nolbrant S. et al. (2017), стало использование Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413202) в качестве подложки на всех этапах дифференцировки вместо Laminin-521 (Biolamina, cat. no. LN-521) и Laminin-111 (Biolamina, cat. no. LN-111) (протокол 2). Как и в случае с протоколом 1 дифференцировка по протоколу 2 проводилась 53 дня в условиях in vitro. Полученные клетки были проанализированы а) при помощи иммунофлюоресцентного метода и была оценена экспрессия TH, MAP2, Lmx1a ; б) при помощи ВЭЖХ было оценено содержание дофамина и его метаболитов (DOPAC и HVA); в) при помощи метода patch-clamp в конфигурации “целая клетка” был измерен потенциал действия полученных клеток.
Итоговым результатом первой запланированной задачи второго года выполнения проекта должно было стать сравнение результатов дифференцировок, выполненных по двум протоколам. Так как одной из основных целей получения дофаминергических нейронов в рамках данного проекта является их введение в стриатум лабораторных животных, то три параметра - трудоемкость, стоимость и продолжительность протокола оценивались при условии проведения протокола до этапа получения дофаминергических прогениротов, после чего клетки могут быть использованы для трансплантации. Стоимость реактивов была рассчитана на основании цен, которые поставщики выставляли на реактивы в 2021 году. Эффективность протокола - наиболее четко может быть оценен при анализе полученной культуры на финальных этапах дифференцировки, поэтому данный параметр в обоих протоколах был оценен на 53 день дифференцировки in vitro. Эффективность протоколов была оценена подсчетом процента TH(+) и Lxm1a(+) клеток на 53 день дифференцировки.
На основании совокупности данных, полученных при сравнении, был выбран единых протокол, который будет использован для дальнейшей работы по проекту.
В рамках второй задачи по разработке стандартизированных методов транспортировки и введения клеточного трансплантата (прогениторов дофаминегических нейронов, полученных в ходе дифференцировки иПСК человека) в мозг лабораторных животных иПСК человека линии WTSli046-A были дифференцированы в условиях in vitro до стадии дофаминергических прогениторов (28 день дифференцировки) по протоколу 1 и были выполнены 10 операций по введению клеточной суспензии в стриатум лабораторных животных. Результаты трансплантации были оценены через 2 месяца после выполнения оперативного вмешательства.
В ходе работы были разработаны следующие протоколы:
а) Эмбриоидные тельца на 28 день дифференцировки собирались в 15 мл фальконы, промывались PBS, диссоциировались при помощи Accumax (StemCell), 5 мин при температуре 37 оС. После этого клетки ЦФ 3 мин 500 g, отбирали супернатант и клетки диссоциировали в среде, содержащей Neurobasal medium (Gibco), 1% Penicillin-Streptomicine, 0,1 mM бета-меркаптоэтанол, 200 mkM аскорбиновую кислоту (Sigma), 2mM L-glutamine (Gibco), 5 mkM Y27632.
б) Транспортировка клеток осуществлялась при температуре 37 оС в стандартных атмосферных условиях.
в) Во время проведения оперативного вмешательства животное помещалось в ингаляционную камеру, заполненную парами изофлюрана. После того, как животное достаточно наркотизировано, оно фиксировалось в стереотаксической установке с непрерывной подачей изофлюрана. Перед проведением болезненных манипуляция глубина наркоза определялась с помощью теста тейл-пинч. Перед проведением операции на глаза животного наносился офтальмогель для предотвращения пересыхания роговицы глаз. Все манипуляции проводились в асептической манере, с использованием стерильных инструментов и материалов. Введение клеточной суспензии проводилось унилатерально. Разрезалась кожа, обнажался череп и проводилась краниотомия по координатам AP +0.9, ML -1.7, DV -3.2. Для введения клеточной суспензии использовался шприц Microliter #701 (Hamilton-Bonaduz, Schweiz). Перед введением клеточную суспензию центрифугировали 5 мин 300 g, удаляли среду и клетки растворяли в HBSS, содержащем ДНКазу I (DNase I, Invintogen, 18047019) 25 ед/мл. Клеточная суспензия набиралась в шприц, который удерживался, фиксировался и устанавливался в трепанированный мозг животного, после чего проводилась инъекция (объем введения 1 мкл, скорость введения 0.5 мкл/мин). После введения клеточной суспензии делалась пауза в течение 3 мин, после чего шприц извлекался. Кожа зашивалась, животное доставалось из стреотаксической установки. Состояние животных отслеживалось сразу после выхода из наркоза, на следующий день после операции, через день после операции. Животные получали иммунносупрессивную терапию (преднизолон 2 мг/кг массы тела/день) начиная со дня операции и в течение последующих 2х месяцев.
г) Для оценки выживаемости и интеграции клеток через 2 месяца после введения клеточной суспензии животным под наркозом выполнялась перфузия 4% параформальдегида с последующим выделением и фиксаций головного мозга в 4% растворе параформальдегида в течении 12 ч, после чего мозг помещался в 30% раствор сахарозы на 48 ч. Полученный препарат нарезался при помощи криостатирующего микротома Leica CM-3050S, толщина срезов составляла 30 мкм. Для оценки количества клеток использовалось иммунофлюоресцентное окрашивание на TH (антитела TH Antibody (H-196): sc-14007, Santa Cruz Biotechnology) по протоколам производителя. Полученные гистологические препараты оценивались при помощи флуоресцентного микроскопа Zeiss Axio Observer Z1.
В рамках третьей задачи по выбору оптимального метода для определения уровня экспрессии TAARs и измерению уровней экспрессии TAARs в ходе дифференцировки иПСК человека в дофаминергические нейроны на разных стадиях был выполнен подбор праймеров и проб для TaqMan ПЦР в реальном времени и подобраны оптимальные условия для проведения метода. Для анализа были использованы клетки, полученные во время дифференцировки по протоколу 1 трех линий иПСК человека WTSli004-A, WTSli032-A, WTSli046-A на трех стадиях: день 0 (недифференцированные иПСК человека), день 12 (конец первого этапа дифференцировки), день 53 (стадия зрелых дофаминергических нейронов). Анализ при помощи TaqMan ПЦР в реальном времени был проведен с использованием протоколов, отработанных на контрольных линиях, в качестве которых были использованы клетки линии HEK293, в которые по-отдельности были трасдуцированы плазмиды, экспрессирующие TAAR1, TAAR2, TAAR5, TAAR6, TAAR8, TAAR9.
Мы также провели секвенирование 3х линий иПСК в недифференцированном состоянии и на стадии нейрональных прогениторов, которые были получены при дифференцировке по протоколу 1. Мы использовали стандартное для человеческих образцов количество прочтений – 30-40 млн на образец. Однако экспрессия TAARs обнаружена не была. Одновременно с этим, выполняя анализ данных, полученных из открытых баз данных, таких как BioGPS, NCBI Gene Expression Omnibus (GEO), мы пришли к выводу, что ввиду крайне низкого уровня, экспрессия TAARs может быть обнаружена только в образцах, имеющих не менее 60 млн прочтений. Принимая во внимание эффективность, чувствительность и стоимость обоих методов, мы посчитали использование РНК секвенирования с глубиной более 60 млн прочтений на образец только для определения экспрессии TAARs экономически крайне не рациональным и пришли к выводу, что в ходе дальнейшего проекта для определения экспрессии TAARs мы будем использовать отработанный метод TaqMan ПЦР в реальном времени.
Также в рамках третьей задачи было запланировано сравнение данных, полученных на трех клеточных линиях с результатами, полученными в наборах данных, опубликованных в открытых базах данных. В ходе выполнения данной задачи, были использованы данные, полученные при проведении TagMan ПЦР в реальном времени на трех линиях иПСК человека WTSli004-A, WTSli032-A, WTSli046-A, и проведено сравнение полученных данных с данными, полученными при анализе наборов GSE118412 и GSE86654, которые были получены из клеток в ходе дифференцировки ЭСК линии RC17 (Roslin Cells) и линии H9 (WiCell) соответственно, по протоколу, описанному в Nolbrant S. et al. (2017) (Tiklová et al., 2020; Kirkeby, A. et al., 2017); набора данных EGAD0000100615, который был получен из 215 линий иПСК человека во время дифференцировки в направлении среднего мозга, включая дофаминергические нейроны (Jerber et al. 2021); набора данных SE162884 (GSE162883) (Kim T. W. et al., 2021), который был получен в ходе дифференцировки ЭСК линий H9 (WiCell) и MEL1 (Stem Cell Sciences plc) в дофаминергические нейроны по протоколу, опубликованному в Kim T. W. et al., 2021. Для анализа использовались необработанные данные. Для набора EGAD0000100615 нормализация проводилась с использованием TPM, в остальных наборах данных нормализация была выполнена с использованием CPM.