Цель научного исследования
Развитие методов компьютерного дизайна мини-белковых лигандов с целью повышения процентной доли успешных конструкций, разработка экспериментальных методик для получения и апробации кандидатных мини-белковых лигандов, применение мини-белковых лигандов в качестве альтернативы дорогостоящим антителам в иммуногистохимических исследованиях, применение наблюдаемого эффекта накопления мини-белков во внеклеточных везикулах для доставки мини-белков в клетки.
Актуальность проблемы, предлагаемой к исследованию
Последние несколько лет ознаменовались стремительным прогрессом в области in silico дизайна малых белковых лигандов. Три года назад наиболее эффективный алгоритм для de novo дизайна белковых лигандов, Rosetta, обеспечивал коэффициент результативности порядка 0.1% (т.е. один из тысячи сконструированных мини-белков оказывался эффективным) [Cao и др. Nature 605: 551 (2022)]. При этом успешным считался лиганд с достаточно скромной связывающей способностью по отношению к предназначенной для него белковой мишени, от 4 мкМ. Спустя год с помощью алгоритмов машинного обучения, включая AlphaFold2, результативность была доведена примерно до уровня 1% [Bennett и др. Nat. Commun. 14, 2625 (2023)]. Новая версия программы, RFdiffusion, разработанная на основе принципов глубокого обучения, позволила достичь результативности порядка 10% [Watson и др. Nature 620: 1089 (2023)]. Последним шагом вперёд в этой области стала недавно анонсированная программа AlphaProteo [Zambaldi и др. arXiv: 2409.08022 (2024)]. Использование этой программы в отдельных случаях позволяет довести долю успешных кандидатных конструкций до 90%; при этом тестирование относительно небольшого количества конструкций (порядка сотни) как правило позволяет выявить лиганды с высокой связывающей способностью, 0.1 – 1 нМ. Признанием этих успехов стало присуждение Нобелевской премии по химии 2024 г. Дэвиду Бейкеру, возглавляющему коллектив разработчиков программы Rosetta (включая специализированную версию RFdiffusion), а также создателям программы AlphaFold2 Джону Джамперу и Деннису Хасабису (последний также входит в группу разработчиков AlphaProteo).
Таким образом, в результате стремительного прогресса в этой области исследований широкий круг научных лабораторий получил возможность конструировать, производить и применять мини-белковые лиганды, предназначенные для связывания с клинически и/или физиологически значимыми белковыми мишенями. Тем не менее ряд встающих в связи с этим вопросов на сегодняшний день остаётся нерешённым, а открывающиеся в этой области возможности ждут своей реализации. Именно этот круг задач предлагается к решению в рамках заявленной программы НИР.
По своим функциональным свойствам мини-белковые лиганды можно сравнить с антителами. И те, и другие обладают высокой связывающей способностью по отношению к своим мишеням. При этом хорошо известно, что антитела обладают высокой специфичностью; по всей видимости, это также верно и для мини-белковых лигандов, хотя данный вопрос остаётся недостаточно исследованным (см. ниже задачи предлагаемой программы НИР).
Существенным недостатком антител является их высокая стоимость: для получения антител используются модифицированные клетки человека или животных (гибридомы), что обуславливает низкий выход при высоких затратах. Проблема высокой стоимости антител не теряет своей остроты даже при их производстве в промышленном масштабе. Дополнительным фактором, способствующим удорожанию антител, являются высокие требования, предъявляемые к их хранению и транспортировке. В этом смысле малые белковые лиганды выгодно отличаются от антител. Мини-белки просты и дешевы в изготовлении – для их экспрессии с успехом используются культуры E. coli. Следует также отметить их высокую стабильность, что обеспечивает простоту хранения и транспортировки. Наконец, мини-белки можно легко изготовить в варианте с конъюгированной меткой, введя в последовательность остаток цистеина и воспользовавшись стандартными тиол-реактивными метками (в случае антител подобный подход сопряжён с техническими сложностями, поскольку в отличие от мини-белков антитела содержат множественные остатки цистеина, образующие дисульфидные мостики). Наконец, на основе мини-белков можно легко получать рекомбинантные химерные конструкции с потенциальным фармакотерапевтическим эффектом [Huang и др. Nature 10.1038/s41586-024-07948-2 (2024)].
Тем не менее с точки зрения фармакологии антитела обладают рядом ключевых преимуществ перед мини-белками. Во-первых, антитела могут быть получены для практически неограниченного круга белковых мишеней, тогда как для мини-белковых лигандов нужен подходящий интерфейс связывания (первые разработки в области дизайна мини-белков, способных связываться с разупорядоченными мишенями появились лишь полгода назад [Liu и др. bioRxiv: 10.1101/2024.07.16.603789 (2024)]). Во-вторых, поскольку антитела являются нативным элементом иммунной системы, для них характерно длительное время жизни в кровотоке (напротив, мини-белки достаточно быстро удаляются из кровотока посредством специализированных рецепторов печени и почек). По той же причине, фармакологические препараты на основе человеческих антител обладают относительно низкой иммуногенностью (для мини-белков, полученных с помощью белковой инженерии, этот вопрос остаётся слабо исследованным). Наконец, антитела обладают способностью вызывать целенаправленный иммунный ответ, что используется в некоторых видах иммунотерапии. Все эти факторы обусловили современный успех фармакотерапии на основе моноклональных антител.
У мини-белков в этом отношении тоже имеются некоторые потенциальные преимущества. Например, последние данные позволяют предположить, что высокая стабильность мини-белков делает возможным их всасывание в кишечнике и тем самым обеспечивает пероральную биодоступность [Berger и др. Cell 187: 4305 (2024)]. Также небольшой размер мини-белков является относительным преимуществом перед антителами с точки зрения преодоления гематоэнцефалического барьера. Однако все разработки в области фармакотерапии на основе мини-белковых лигандов, полученных методом белковой инженерии, находятся на экспериментальной стадии. На сегодняшний день лишь единичные конструкции достигли этапа клинических испытаний, причём эти испытания не привели к успеху. Например, мини-белковый ингибитор интерлейкина-17A, получивший название изокибеп, испытывался в качестве средства от псориаза [Klint и др. MABS 15: 2209920 (2023)], однако в декабре 2024 г. клинические испытания были прекращены ввиду отсутствия значимого эффекта [https://www.affibody.se/press/affibodys-licensee-acelyrin-announces-top-line-results-for-izokibep-in-uveitis/].
Учитывая эти обстоятельства, мы приняли решение в заявленной программе НИР сосредоточиться на развитии методологии для дизайна мини-белковых лигандов, разработке лабораторных методов для получения и тестирования таких лигандов, а также применении мини-белков в области биомедицинских технологий.
Описание задач, предлагаемых к решению
1.Реализация новых программных инструментов для оценки эффективности сконструированных in silico мини-белковых лигандов.
Программы для дизайна мини-белковых лигандов (например, Rosetta, RFdiffusion и AlphaProteo, см. выше) в качестве результата предлагают компьютерные модели мини-белков в комплексе с предназначенной для них мишенью. Такие модели можно оценить с точки зрения их достоверности. В случае если модель оценивается как достоверная (т.е. физически реализуемая), исследователь может изготовить образец мини-белка и подтвердить его связывающую способность по отношению к мишени с помощью экспериментальных методов (например, посредством изотермической титрационной калориметрии, поверхностного плазмонного резонанса или биослойной интерферометрии). В противном случае, если модель оценивается как недостоверная, такую конструкцию следует отклонить. Отсюда вытекает, что такие программы как Rosetta, RFdiffusion или AlphaProteo можно дополнить специальными программными "фильтрами" для оценки достоверности получаемых моделей. Применение таких фильтров позволит повысить долю успешных конструкций, получаемых с помощью вышеназванных программ. Пример такого подхода можно найти в недавней работе Бейкера с соавторами [Bennett и др. Nat. Commun. 14, 2625 (2023)], где подобный фильтр был реализован на основе программы AlphaFold2. В рамках предлагаемой программы НИР мы планируем использовать в качестве фильтра разработанный нами алгоритм для предсказания константы связывания белков на основе структуры белок-белкового комплекса.
Стоит отметить, что существует ряд методов для оценки константы диссоциации белкового комплекса Kd на основе структурной модели комплекса с использованием так называемого "физического подхода". Например, в этой связи можно упомянуть алгоритмы расчётов MM/PBSA и MM/GBSA [Gohlke и Case, J. Comput. Chem. 25: 238 (2004)]. Однако этот и другие подобные методы отличаются очень невысокой точностью. Использование нейросетевых алгоритмов для решения этой задачи, начало которому было положено несколько лет назад, позволило существенным образом улучшить точность предсказаний. Разработанный нами предиктор PCANN использует языковую модель ESM-2 для кодирования информации об интерфейсах связывания белков и графовую сеть с вниманием для преобразования этой информации в предсказания Kd (или, что эквивалентно, свободной энергии связывания ΔGbind). В тестах с использованием двух ранее неиспользованных наборов данных PCANN показал более высокую точность, чем лучший из доступных на сегодняшний день нейросетевых предикторов, BindPPI [Zheng и др. Comput. Struct. Biotechnol. J. 23: 460-472 (2024)], среднее абсолютное отклонение между экспериментальными данными и предсказаниями PCANN составило 1,3 ккал/моль против 1,4 ккал/моль для BindPPI. Соответствующие иллюстративные материалы представлены на Рис. 1 в приложении «Предварительные результаты», размещённом по ссылке https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88.
(2026) Для дальнейшего усовершенствования алгоритма PCANN мы планируем использовать более совершенные языковые модели (например, esm2_t48_15B_UR50D). Мы также планируем расширить набор данных, используемый для обучения нейросети, и улучшить качество анализа за счёт внесения поправки на температуру измерений Kd (часть измерений выполняется при комнатной температуре, часть при температуре человеческого тела либо при другой нестандартной температуре). Для поиска новых данных по константам связывания белков будут использованы автоматизированные программные инструменты (боты), с последующим рассмотрением и отбором корректных данных членами научного коллектива.
(2027) В качестве следующего шага мы планируем использовать усовершенствованный алгоритм PCANN в качестве фильтра для отбора наиболее перспективных мини-белковых лигандов из числа конструируемых программой RFdiffusion (а также программой AlphaProteo после того, как она станет доступной для научного сообщества).
Помимо нового программного фильтра на основе оригинальной программы PCANN мы планируем также реализовать фильтр на основе недавно разработанной программы UFConf [Fan и др. J. Chem. Inf. Model. 64: 8414 (2024)]. Эта программа позволяет частично или полностью "разбирать" структурные модели белков или белковых комплексов, а затем заново "собирать" их посредством процесса, который можно описать как диффузия в потенциале; при этом потенциал генерируется нейросетью, которая представляет собой модификацию известной нейросети AlphaFold2. В нашей лаборатории имеется опыт использования программы UFConf для моделирования конформационных переходов в так называемых метаморфных белках [Murzin Science 320: 1725 (2008)]. Вкратце, мы разработали итеративный протокол с использование UFConf, позволяющий моделировать переход от одной стабильной белковой укладки к другой, сопровождаемый частичным разворачиванием и последующим пересворачиванием пептидной цепи. При этом нам удалось реконструировать ряд интермедиатов, которые были ранее идентифицированы в экспериментальных исследованиях метаморфных белков, см. иллюстрацию на Рис. 2 в приложении «Предварительные результаты» (https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88).
(2028) В рамках заявленной программы НИР мы планируем использовать программу UFConf для оценки достоверности моделей белок-белковых комплексов, полученных с помощью программы RFdiffusion и, в дальнейшем, программы AlphaProteo. В основу планируемого фильтра будет положен следующий принцип. Если в результате разборки и последующей сборки белкового комплекса UFConf успешно воспроизводит исходную структурную модель, то такая модель может считаться достоверной. И наоборот, если UFConf получает модель, существенно отличающуюся от исходной, то такая модель не может считаться достоверной. На основе этого принципа будет реализован фильтр, позволяющий ранжировать мини-белковые конструкции, получаемые с помощью программы RFdiffusion, и отбирать из них наиболее перспективные.
2. Разработка упрощённого экспериментального протокола для получения и тестирования мини-белковых лигандов
Как было указано выше, коэффициент результативности программы RFdiffusion для компьютерного дизайна мини-белковых лигандов составляет порядка 10% (при этом следует иметь в виду, что этот показатель сильно варьирует в зависимости от избранной мишени). Такая относительно высокая эффективность открывает возможности для дизайна и получения мини-белковых лигандов силами исследовательских лабораторий, располагающих стандартными ресурсами и оборудованием для работы с белками.
Для использования программы RFdiffusion необходимо использовать компьютеры, оснащённые графическими ускорителями (GPU). На сегодняшний день подобные компьютеры имеются в распоряжении многих лабораторий (например, наш коллектив располагает несколькими серверами, оснащёнными в общей сложности двадцатью графическими картами NVIDIA GeForce RTX 2080 Ti и GeForce RTX 3080); помимо этого большинство научных групп имеет доступ к подобным ресурсам через вычислительные центры коллективного пользования.
(2026) Скорость выполнения расчётов с использованием RFdiffusion позволяет достаточно быстро, за промежуток времени порядка нескольких дней, сгенерировать 1,000 высококачественных дизайнов мини-белковых лигандов для заданной мишени. Полученный таким образом набор кандидатных лигандов мы предлагаем ранжировать согласно метрикам, отражающим связывающую способность мини-белка (см. выше). В качестве следующего шага мы намерены отобрать из ранжированного списка 10 наиболее перспективных конструкций для последующего экспериментального исследования.
Отметим, что такого рода экспериментальное исследование представляет собой серьезную нагрузку для небольшого научного коллектива. Например, бактериальная экспрессия и хроматографическая очистка десяти de novo белков требует нескольких месяцев работы. Тестирование полученных образцов на предмет связывания с мишенью также является нетривиальной задачей. Такие экспериментальные методики как поверхностный плазмонный резонанс и биослойная интерферометрия получили лишь минимальное распространение в отечественных исследовательских центрах, оборудование для калориметрических измерений также доступно лишь ограниченному кругу пользователей (при этом сам эксперимент достаточно капризен и зачастую требует многократных повторений), а для проведения исследования методом иммуноферментного анализа необходима разработка и реализация достаточно сложной экспериментальной методики. В предлагаемой программе НИР мы ставим своей задачей упростить и ускорить процесс получения и тестирования мини-белковых лигандов силами отдельно взятой научной лаборатории.
В этой связи отметим, что мини-белковые лиганды, с их характерным небольшим размером в 50-55 остатков, могут быть получены не только путём рекомбинантной экспрессии, но также и методом твердофазного пептидного синтеза с использованием автоматизированного микроволнового синтезатора. При этом основную техническую сложность представляет собой выделение продукта из сложной многокомпонентной реакционной смеси и его очистка. Однако, как нам удалось продемонстрировать (см. ниже), в контексте интересующей нас задачи выделение и очистку проводить не требуется, что радикальным образом удешевляет стоимость работ.
Для идентификации эффективных лигандов будет применён разработанный нами тест с осаждением (pull-down assay). Тест будет реализован с использованием Ni-аффинных магнитных наночастиц с покрытием в виде белка-мишени, оснащённого гистидиновым тэгом. В ходе инкубации активный мини-белок связывается с мишенью на поверхности никелевой частицы, тогда как различные сопутствующие примеси и загрязнения удаляются посредством многократной отмывки. Далее мини-белковый лиганд в комплексе с белком-мишенью отделяется от никелевой частицы с помощью раствора имидазола, после чего обе компоненты, малый белковый лиганд и более крупная мишень, детектируются посредством электрофореза в полиакриламидном геле.
В ходе предварительных исследований в нашей лаборатории данная экспериментальная схема была реализована для вирусной мишени, а именно рецептор-связывающего домена шиповидного белка (RBD-S) коронавируса SARS-CoV-2. Рекомбинантный материал RBD S был получен в культуре P. pastoris силами сотрудников нашего коллектива. В качестве мини-белковых лигандов использовались лиганды, разработанные группой Бейкера, а именно LCB1, AHB2 и другие [Cao и др. Science 370: 426 (2020)]. Синтез мини-белков был осуществлён на коммерческой основе компанией Pepmic Co., Ltd (Suzhou, China). При этом белковый материал, полученный методом твердофазного пептидного синтеза, использовался "как есть", без трудоёмкой и технически трудновыполнимой хроматографической очистки. Проведенные нами опыты показали, что высокоаффинные мини-белковые лиганды успешно поддаются идентификации с помощью предложенной экспериментальной методики, см. иллюстрацию на Рис. 3 в приложении «Предварительные результаты» (https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88).
Описанный протокол может быть также реализован с альтернативной схемой детекции, использующей прикреплённую к мини-белку флуоресцентную метку. Конъюгация пептида с меткой может осуществляться как на этапе синтеза (простейший вариант предусматривает конъюгацию ФИТЦ с боковой цепью остатка лизина, специально введённого в C-концевую позицию аминокислотной последовательности), так и в качестве постсинтетической модификации (для чего в один из концевых участков вводится остаток цистеина). Для детекции успешно связавшегося мини-белкового лиганда может быть использован в этом случае сигнал флуоресценции финального смыва, либо характерный спектр поглощения флуоресцентной метки в УФ или видимой области. Для контроля можно также использовать гельдокументирующую систему, оснащённую модулем для регистрации сигнала флуоресценции.
В качестве мишени на данном этапе будет исследован антиапоптотический белок Bcl-2. Гиперэкспрессия Bcl-2 является одним из отличительных признаков агрессивных форм лимфомы. С точки зрения предлагаемой программы НИР специфика Bcl-2 состоит в том, что этот белок представляет собой внутриклеточную мишень. Это имеет свои преимущества, так как данный белок легко экспрессируется в E. coli [Petros и др. PNAS 98: 3012 (2001)]. У Bcl-2 существует близкий гомолог, BHRF1; при конструировании мини-белковых лигандов к этому белку с помощью программы AlphaProteo была продемонстрирована очень высокая результативность, ок. 90%. Это даёт основания считать, что хорошая результативность для этой мишени может быть достигнута и с помощью программы RFdiffusion. Протокол бактериальной экспрессии и очистки для BHRF1 можно найти в литературе [Kvansakul и др. PLoS Pathog. 6: e1001236 (2010)].
(2027) В качестве альтернативы мы планируем реализовать более традиционный подход с использованием рекомбинантной экспрессии – однако при этом экспериментальная процедура будет подвергнута существенному упрощению. При обычном подходе к экспрессии белков в культуре E. coli значительная часть времени и усилий затрачивается на хроматографическую очистку образца (в нашем случае речь идёт о Ni-аффинной и гель-фильтрационной хроматографии). Вместо этого, в рамках предлагаемой схемы в лизат клеток-продуцентов будут внесены никелевые магнитные наночастицы, что позволит связать на поверхности частиц целевой мини-белок, экспрессируемый в виде слияния с гистидиновым тэгом. Вслед за этим магнитные частицы будут подвергнуты отмывке и перенесены в раствор, содержащий белок-мишень. Связывание белка-мишени с мини-белковым лигандом будет детектироваться посредством гель-электрофореза, либо по сигналу поглощения UV-Vis от белка-мишени, конъюгированного флуоресцентной меткой. Таким образом, в данном протоколе мы также исключаем отдельный этап очистки мини-белка при помощи ВЭЖХ; вместо этого тест на связывание мини-белка с белком-мишенью одновременно служит целям очистки образца от посторонних бактериальных белков и других контаминантов.
(2028) Для дальнейшей апробации описанной методики мы планируем использовать рецептор фактора роста фибробластов 4 (FGFR4), демонстрирующий повышенный уровень экспрессии в различных разновидностях опухолей, включая гепатоцеллюлярную карциному и тройной негативный рак молочной железы. В контексте настоящей НИР этот рецептор интересен тем, что представляет собой одну из наиболее благоприятных мишеней с точки зрения de novo дизайна мини-белковых лигандов. Так называемый индикатор SAP (показатель склонности к агрегации для белковой поверхности) для функционально значимого интерфейса FGFR4 достигает 25 [Cao и др. Nature 605: 551 (2022)]. Это значение позволяет считать, что при использовании алгоритма RFdiffusion процентная доля успешных кандидатных конструкций превышает 10% и, скорее всего, лежит в диапазоне 30-40%. В свою очередь это означает, что в рамках предлагаемого исследования нам с высокой степенью вероятности удастся получить один или несколько эффективных лигандов.
В рамках данного исследования экспрессия внеклеточного домена FGFR4, дополнительно оснащенного гистидиновым тэгом, будет проведена в культуре дрожжей P. pastoris согласно опубликованному протоколу [Christensen и др. NeuroReport 22: 727 (2011)]). Десять наиболее перспективных мини-белковых лигандов будут получены методом твердофазного пептидного синтеза (Pepmic Co., Ltd, Suzhou, China) и/или методом бактериальной экспрессии в E. coli (заказ плазмид ЗАО Евроген, Москва, Россия).
3. Применение сконструированных in silico мини-белков в биомедицинских технологиях
Как было описано выше (см. раздел "Актуальность проблемы"), сконструированные in silico малые белки пока не получили применения в фармакотерапии. Несмотря на достаточно продолжительную историю, см. первые примеры аффител [Nord и др. Nature Biotech. 15: 772 (1997)], клинические испытания препаратов на основе мини-белков носят единичный характер и, по состоянию на сегодняшний день, не приводят к успеху. В этих условиях мы приняли решение обратиться к потенциальным применениям мини-белковых лигандов в области биомедицинской технологии. В этой области был опубликован ряд работ, посвящённых использованию мини-белковых лигандов для визуализации опухолей [Orlova и др. Cancer Res 66: 4339 (2006)], а также имеются предварительные данные, указывающие на их применимость для иммуногистохимических исследований [Lundberg и др. J. Immunol. Methods 319: 53 (2007)]. В рамках предложенной программы НИР мы планируем продемонстрировать возможность проведения иммуногистохимического анализа по новой методике, предусматривающей замену дорогостоящих антител на значительно более простые в изготовлении и доступные мини-белковые лиганды. Мы также планируем исследовать обнаруженный нами эффект поглощения мини-белковых лигандов внеклеточными везикулами, имея в виду потенциальную применимость этого эффекта для упаковки и доставки мини-белковых лигандов в клетку.
3.1. Разработка методики для иммуногистохимической диагностики онкообразований с использованием мини-белковых лигандов
Наряду с генетическим анализом, иммуногистохимические (ИГХ) исследования позволяют охарактеризовать этиологию заболевания на молекулярном уровне. Это даёт возможность подбирать эффективную таргетную терапию для лечения заболевания, минимизировать риски при назначении терапии, контролировать эффективность лечения и т.д. В настоящее время ИГХ тесты позволяют идентифицировать сотни белковых биомаркеров, в том числе множество ключевых онкомаркеров. Как правило, для уточнения диагноза и выбора методики лечения используется несколько таких маркеров. Можно предсказать, что в будущем число активно используемых маркеров будет расти. В частности, применение методов искусственного интеллекта позволит получать более полную картину заболевания с использованием десятков различных показателей ИГХ и более эффективно проводить лечение болезни. Можно говорить о том, что при использовании многочисленных показателей ИГХ и других детализированных данных молекулярной диагностики картина заболевания, равно как и тактика лечения, приобретают индивидуализированный характер, реализуя тем самым переход к персонализированной медицине
Однако при этом ИГХ в том виде, в котором оно существует на сегодняшний день, остаётся достаточно дорогим и времязатратным анализом. Типовое комплексное исследование обычно обходится в несколько десятков тысяч рублей. Высокая стоимость в первую очередь отражает цену первичных антител. Таким образом, при переходе к перспективной модели диагностики и лечения, которая будет использовать десятки показателей ИГХ, увеличившаяся стоимость исследования станет серьезным препятствием для его использования в повседневной практике. В качестве альтернативы для дорогих и сложных в хранении антител мы предлагаем использовать малые белки, сконструированные с помощью методов белковой инженерии. Такой подход позволяет в перспективе значительно удешевить проведение тестов ИГХ, тем самым способствуя расширению круга используемых маркеров, что в свою очередь следует рассматривать как шаг на пути к более детальной диагностике и индивидуализированной терапии.
Для разработки новой методологии нами были выбраны два ключевых онкомаркера: HER2 и PD-L1. Рецептор эпидермального фактора роста второго типа HER2 является одним из важнейших маркеров при диагностике рака груди, а также ряда других форм рака, и используется как основной индикатор при назначении терапии в виде моноклонального антитела трастузумаб, а также нескольких низкомолекулярных ингибиторов тирозин киназы (лапатиниб, нератиниб и др.). Тесты ИГХ на экспрессию HER2 проводятся во всех крупных отечественных центрах лабораторной диагностики.
Методом белковой инженерии для HER2 был разработан мини-белковый лиганд Zher2, представляющий собой укладку из трёх α-спиралей с длиной последовательности в 58 аминокислотных остатка. Аффинность этого лиганда к мишени была измерена методом биослойной интерферометрии, составив 22 пМ [Orlova и др. Cancer Res 66: 4339 (2006)]. На основании нашего опыта подобных измерений, мы считаем этот результат излишне оптимистичным; однако высокая связывающая способность Zher2 не подлежит сомнению. В рамках предварительных исследований по данной программе НИР нами был изготовлен рекомбинантный образец Zher2 с дополнительно введённым в состав последовательности N-концевым цистеином (отметим, что исходная последовательность Zher2 не содержат остатков цистеина; это верно и для других конструируемых in silico мини-белков). Полученный образец был конъюгирован с флуоресцентной меткой sulfo-Cyanine5 (производитель ООО Люмипроб РУС).
Чтобы продемонстрировать детекцию HER2 при помощи Zher2-Cy5, нами была использована клеточная культура карциномы протока груди человека BT-474 (коллекция Института цитологии РАН). Данная линия показывает очень высокий уровень экспрессии HER2 (ок. 2000 транскриптов/млн). В качестве контроля был использован эксперимент с клеточной линией карциномы легкого A549 с низким уровнем экспрессии HER2 (ок. 30 транскриптов/млн). При визуализации на конфокальном микроскопе равномерный и высокоинтенсивный сигнал флуоресценции Zher2-Cy5 был зарегистрирован на поверхности клеток BT-474, но при этом не наблюдался в контрольном эксперименте с клетками A549 (см. приложение «Предварительные результаты», Рис. 4: https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88). Таким образом нами была продемонстрирована принципиальная возможность проведения анализа ИГХ для определения уровня экспрессии рецептора HER2 с применением мини-белкового лиганда Zher2.
(2026) В качестве следующего этапа мы планируем проведение эксперимента по обобщённой схеме теста ИГХ с заменой первичного антитела на мини-белковый лиганд. Для этого нами будет изготовлен образец мини-белка Zher2 в виде конструкции слияния с Avi-тэгом (15 дополнительных аминокислотных остатков). Полученный материал будет обработан энзимом BirA, что позволит нам получить биотинилированный образец Zher2. С другой стороны, в качестве вторичного антитела нами будет использована конструкция в виде конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (доступен для приобретения в ООО Компания Пущинские лаборатории и у других поставщиков). Таким образом, уровень экспрессии HER2 на поверхности исследуемых клеток будет определяться по результатам энзиматической реакции пероксидазного окисления субстрата TMB, регистрируемой стандартным колориметрическим методом.
Помимо клеточных экспериментов, на данном этапе будут также реализованы эксперименты по схеме иммуноферментного анализа (ИФА). В этих экспериментах будет использован рекомбинантный образец HER2, полученный путём дрожжевой экспрессии согласно опубликованному протоколу [Dimitriadis и др. BMC Cancer 9: 386 (2009)] (наша лаборатория имеет значительный опыт экспрессии белков в P. pastoris). Измерения будут проведены по стандартному протоколу ИФА, за исключением того, что вместо первичного антитела будет использован биотинилированный мини-белок Zher2, а вместо вторичного антитела – конъюгат стрептавидин-HRP. С методический точки зрения такой эксперимент ИФА можно рассматривать как аналог исследования ИГХ. Наличие рекомбинантного материала HER2 также позволяет провести высокоточные измерения константы диссоциации для комплекса HER2 / Zher2 методом изотермической титрационной калориметрии (ИТК); такие измерения регулярно проводятся в нашей лаборатории с использованием микрокалориметра Nano ITC 2G (TA Instruments).
На последующем этапе выполнения НИР разработанная нами методика будет апробирована на образцах биопсийного либо операционного материала молочной железы. Для проверки чувствительности и избирательности разработанного нами теста на основе мини-белкового лиганда Zher2 будет проведено сравнение с результатами стандартного исследования ИГХ с применением сертифицированных антител. В качестве первого шага будут исследованы образцы HER2-негативных и трижды позитивных (HER2+, ER+, PR+) опухолей. На этот счёт у нашей лаборатории существует договорённость о сотрудничестве с одним из ведущих отечественных центров морфологической диагностики «Лаборатуар Де Жени» (дочернее подразделение ООО «НПФ Хеликс», проводит 300,000 исследований в год, контактное лицо: генеральный директор А.С. Козлов). Работа будет проводиться в сотрудничестве с Л.Э. Завалишиной (д.м.н., профессор кафедры патологической анатомии РМАНПО), научные интересы которой лежат непосредственно в области ИГХ исследований рецептора HER2.
(2027) В качестве следующего онкомаркера нами будет исследован лиганд рецептора программируемой клеточной гибели 1, PD-L1. Высокий уровень экспрессии этого рецептора позволяет опухолевым клеткам ускользать от иммунного контроля. Блокирование PD-L1 с помощью препаратов на основе моноклональных антител (дурвалумаб, авелумаб и др.) представляет собой наиболее эффективную стратегию при лечении немелкоклеточного рака легкого, распространенного уротелиального рака, тройного негативного рака молочной железы и других разновидностей онкологических заболеваний. Соответствующая терапия назначается по результатам исследования ИГХ, позволяющего определить уровень экспрессии PD-L1; данное исследование проводится в большинстве отечественных центров лабораторной диагностики. Описание мини-белкового лиганда PD-L1 появилось в печати полгода назад [Ciesiołkiewicz и др. Prot. Science. 33: e5106 (2024)]. Как и ранее, лиганд представляет собой укладку из 3 α-спиралей и, согласно данным биослойной интерферометрии, связывается с мишенью с константой 51 нМ. Экспериментальные исследования с применением данного мини-белка, ENH32, будут проведены по той же схеме, что описана выше для HER2.
(2028) Наконец, на заключительном этапе НИР мы планируем использовать в контексте исследований ИГХ оригинальные мини-белковые лиганды, сконструированные и апробированные в нашей лаборатории, см. пп. 1-2. В качестве мишеней будут использованы внеклеточный домен рецептора фактора роста фибробластов 4 (FGFR4) и антиапоптотический белок Bcl-2 либо его гомолог BHRF1, описанные выше в тексте заявки. В случае внутриклеточных мишеней, Bcl-2 и BHRF1, будет использована специально разработанная для Bcl-2 методика для демаскировки мишени [Umemura и др. Pathol. Internat. 45: 103 (1995)].
3.2. Исследование эффекта накопления мини-белков во внеклеточных везикулах с последующей транспортировкой внутрь клеток
Большинство из реализованных на сегодняшний день мини-белковых лигандов предназначены для связывания с внеклеточными мишенями (рецепторами). Такой выбор легко объясним, поскольку разработка мини-белковых лигандов для внутриклеточных мишеней неизбежно сталкивается с проблемой доставки мини-белка внутрь клетки. Данная проблема носит общий характер и резко сужает область применения различных биопрепаратов (например, терапевтических антител). Как известно, плазматическая мембрана является практически непроницаемой для водорастворимых белков, а захват белков посредством эндоцитоза имеет следствием их эндосомальную деградацию. В этой ситуации разработка эффективных средств для доставки рекомбинантных белков в клетки стала одной из важнейших задач современной биотехнологии.
Одним из наиболее перспективных решений в этой области считается использование внеклеточных везикул (в первую очередь, экзосом) в качестве средства доставки. К преимуществам внеклеточных везикул (ВВ) можно отнести их биосовместимость и, как следствие, низкую иммуногенность, определённую специфичность по отношению к адресуемым клеткам, и предполагаемую эффективность доставки (поскольку ВВ приспособлены для осуществления межклеточных коммуникаций). Однако при этом вопрос загрузки ВВ целевым белком остаётся практически не решённым. Например, для этой цели используются такие деструктивные и малоэффективные методы как электропорация [Wan и др. Sci. Adv. 8: е9435 (2022)] либо сложные генетические конструкции [Yim и др. Nat. Commun. 7: 12277 (2016)].
В рамках предварительных исследований по предлагаемой программе НИР мы обнаружили эффект накопления мини-белка LCB1 [Cao и др. Science 370: 426 (2020)] во внеклеточных везикулах, выделяемых клетками RPMI 2650 (см. Рис. 5 в приложении «Предварительные результаты», размещено по ссылке https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88). Захват мини-белка везикулами происходит на протяжении всего нескольких минут. При этом концентрация мини-белка в ВВ многократно (на два порядка величины) превышает таковую в растворе. Таким образом, наблюдаемый процесс позволяет быстро и эффективно нагрузить ВВ рекомбинантным белком, что открывает новые перспективы для разработки технологии доставки на основе внеклеточных везикул.
Вслед за быстрым накоплением LCB1 в везикулах мы наблюдаем также постепенный перенос мини-белка в клетки, который становится заметен по прошествии получаса и хорошо различим по прошествии пяти часов (см. Рис. 5 в приложении «Предварительные результаты»). Можно предположить, что по крайней мере частично этот перенос происходит при посредстве нагруженных мини-белком везикул. Внутри клеток белок наблюдается предположительно в виде внутриклеточных везикул; однако можно думать, что часть белка при этом высвобождается и попадает в цитоплазму. Механизм накопления LCB1 внеклеточными везикулами остаётся неизвестным, но можно предположить, что этот механизм обладает отдельными чертами эндоцитоза (следует отметить, что внеклеточные везикулы наследуют многие компоненты материнской клетки, что позволяет им реализовать подобные механизмы).
В предлагаемой программе НИР мы планируем всесторонним образом исследовать и охарактеризовать наблюдаемый эффект.
(2026) Во-первых, мы планируем изолировать внеклеточные везикулы и продемонстрировать, что их можно с равным успехом нагружать мини-белком и вне клеточной культуры. Для выделения ВВ будут использованы специальные устройства, разработанные и изготовленные ООО «Простагност» [Chernyshev и др. J. Extracell. Vesic. 11: e12256 (2022)]. Сотрудниками нашей лаборатории налажен контакт с фирмой-изготовителем и успешно проведены пробные эксперименты. В качестве средства для визуализации ВВ, имеющих типичный размер от 0.5 до 5 мкм, будет использоваться конфокальная микроскопия.
Во-вторых, мы намерены продемонстрировать, что эффект накопления мини-белка в ВВ определяется структурой мини-белка и, в первую очередь, его характерной укладкой (пучок из трёх α-спиралей, что является стандартной укладкой для большинства из полученных методом компьютерного дизайна мини-белков). Для этого аналогичные эксперименты на клеточной культуре RPMI 2650 будут поставлены с небольшими глобулярными белками, имеющими иную укладку (GB1, убиквитин), а также с другими мини-белками, имеющими стандартную трёхспиральную укладку (Zher2, ENH32). Помимо этого, мы также проведём эксперименты с мини-белком LCB1-Cy5 для того, чтобы исключить влияние флуоресцентной метки на процесс захвата мини-белка внеклеточными везикулами.
В-третьих, мы планируем уточнить вопрос о том, в какой форме находится LCB1 после вхождения в клетку. Для этого нами будет использован дополнительный липофильный краситель FM 4-64 FX, который будет внесён в культуральную среду перед инкубацией с LCB1-Atto647. Окрашивание клеточных мембран и мембран ВВ на этом этапе позволит установить наличие липидной оболочки у включений LCB1, наблюдаемых внутри клеток.
В-четвёртых, мы планируем охарактеризовать распределение LCB1 между везикулами и клетками с помощью проточной цитофлуориметрии. Данные предварительных измерений с использованием проточного цитометра Beckman Coulter EPICS XL свидетельствуют о том, что данная методика позволяет выделить популяции везикул и клеток (основываясь на интенсивности прямого светорассеяния) и проинтегрировать соответствующий сигнал от LCB1-Atto647, тем самым определив содержание мини-белка в везикулах и клетках. Таким образом будут получены кинетические кривые, характеризующие эффект быстрого поступления мини-белка в ВВ с последующим медленным перераспределением в клетки.
(2027) В-пятых, мы изучим общность наблюдаемого эффекта по отношению к различным клеточным линиям. В частности, мы повторим эксперименты с LCB1-Atto647 на клеточной культуре MCF7 (аденокарциномы протоков молочной железы), которая образует сходные крупноразмерные ВВ. Мы также исследуем проникновение ВВ, полученных из культуры RPMI 2650 и нагруженных LCB1-Atto647, в клетки культуры A549 (аденокарцинома лёгкого).
В-шестых, мы проведём эксперименты, позволяющие пролить свет на механизм накопления мини-белка в везикулах. Для этого мы намерены исследовать наличие в везикулах тех элементов, относительно которых известно, что они играют важную роль в системе активного транспорта клетки - например, фосфатидилсерина [Varga и др. J. Neurochem. 152: 48 (2020)], актина [Rennick и др. Nature Nanotech. 16: 266 (2021)] и других.
В-седьмых, для того чтобы пролить дополнительный свет на механизм захвата мини-белков внеклеточными везикулами, мы исследуем эффект накопления мини-белков в липосомах. Полученные предварительные данные указывают на то, что небольшой, но отчётливо наблюдаемый эффект накопления мини-белка наблюдается в образцах липосом с содержанием 60% фосфатидилхолина (POPC), 20% фосфатидилсерина (POPS) и 20% дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). При этом необходимым условием для захвата мини-белка является присутствие фосфатидилсерина.
(2028) В-восьмых, мы исследуем вопрос о том, могут ли мини-белки использоваться в качестве домена трансдукции для насыщения ВВ терапевтическими белками. Для этого будет использована химера LCB1-p53, конъюгированная меткой Atto647. В случае получения успешного результата, мы исследуем эффект везикул, нагруженных LCB1-p53, на раковые клетки с нарушениями экспрессии p53 [Takenobu и др. Mol. Cancer Ther. 1: 1043 (2002)].
Наконец, мы изготовим образец мини-белкового лиганда AB-Y-WCT A46T, предназначенного для блокирования протоонкогенa Mdm2 [Styles и др. bioRxiv 2025.01.06.631531 (2025)]. Этот мини-белковый лиганд, как и остальные обсуждаемые в настоящей заявке мини-белки, имеет трёхспиральную укладку и характеризуется высокой аффинностью к мишени, 8.4 нМ. Для данного мини-белка мы также рассчитываем продемонстрировать эффект накопления во внеклеточных везикулах клеточной культуры RPMI 2650. В случае успеха мы намерены провести эксперимент, в котором ВВ, нагруженные AB-Y-WCT A46T, будут инкубированы с клеточной культурой Т449 (липосаркома, интактный ген TP53, высокий уровень амплификации гена MDM2) [Muller и др. Int. J. Cancer 121: 199 (2007)]. Мы рассчитываем, что в ходе этого эксперимента мини-белок AB-Y-WCT A46T при посредстве внеклеточных везикул будет доставлен внутрь раковых клеток, где блокирует Mdm-2 и тем самым восстановит активность p53, что в свою очередь индуцирует процесс апоптоза.
Следует отметить, что мы не рассматриваем подобную ВВ модель как прототип лекарственного препарата. Хорошо известно, что ВВ, продуцируемые раковыми клетками, могут стимулировать рост опухоли и её метастазирование, повышать резистентность к различным формам фармакотерапии, способствовать ангиогенезу и т.д. Таким образом, они не могут использоваться в качестве платформы для создания новых фармпрепаратов. Вместо этого наш эксперимент призван продемонстрировать новые возможности для эффективной загрузки ВВ мини-белковым лигандом. Можно предположить, что в будущем подобный механизм будет реализован для синтетических ВВ-подобных конструкций, которые найдут применение в качестве одного из средств белковой терапии.
Предполагаемые (ожидаемые) результаты и их возможная практическая значимость (применимость)
1.Реализация новых программных инструментов для оценки эффективности сконструированных in silico мини-белковых лигандов
(2026) Мы планируем реализовать новую версию созданной в нашей лаборатории программы PCANN, позволяющую предсказывать константу диссоциации белок-белкового комплекса по его структуре. Для улучшения точности предсказаний мы намерены аннотировать подготовленную нами базу данных, добавив в неё условия экспериментальных измерений (температуру, pH, ионную силу раствора). Модель комплекса в виде графа с признаковым описанием на основе языковой модели ESM-2 будет дополнена путём включения в неё соответствующих экспериментальных параметров. Мы рассчитываем, что это позволит добиться значимого улучшения в точности предсказаний PCANN, определяемой при тестировании программы на специальном независимом наборе данных.
Мы также намерены расширить объём базы данных, используемой для обучения нейронной сети PCANN (в настоящее время составляет 585 белок-белковых комплексов). Для этого будет реализована автоматизированная система поиска (бот), позволяющая проводить поиск экспериментальных данных по измерению константы диссоциации комплекса путём просмотра прямых и обратных ссылок на первичную статью, связанную со структурой комплекса в банке данных PDB. Отобранные данные будут подвергнуты тщательной проверке сотрудниками лаборатории, после чего расширенная база данных будет размещена в открытом доступе для использования научным сообществом. Использование расширенной базы данных для обучения PCANN позволит добиться дальнейшего повышения точности предсказаний.
(2027) На основе программы PCANN будет создан программный фильтр для оценки сконструированных in silico мини-белковых лигандов значимых биомедицинских мишеней. В качестве вводных данных будут использованы компьютерные модели комплексов мишень/мини-белок. В качестве параметра для отбора перспективных мини-белковых лигандов будут использованы предсказанные с помощью PCANN значения константы диссоциации комплексов. Для валидации алгоритма будет использован массив экспериментальных данных, опубликованный Д. Бейкером с коллегами (13 мишеней, десятки тысяч мини-белковых конструкций, подвергнутых исследованию методом дрожжевого дисплея с флуоресцентным сортингом) [Cao и др. Nature 605, 551 (2022)]. По результатам этого тестирования будет показано, что программный фильтр на основе предиктора PCANN позволяет повысить процентную долю успешных лигандов в наборе мини-белковых конструкций, сконструированных методом компьютерного дизайна.
(2028) Аналогичный фильтр для оценки сконструированных in silico мини-белковых лигандов значимых биомедицинских мишеней будет создан на основе программы UFConf. В качестве вводных данных будут использованы компьютерные модели комплексов мишень : мини-белковый лиганд. Для оценки достоверности модели будет использован алгоритм генеративной диффузии под контролем нейросети UFConf. Способность UFConf успешно воспроизводить исследуемую компьютерную модель комплекса будет рассматриваться как индикатор высокой достоверности модели. Для тестирования и калибровки предлагаемого программного фильтра будет использован массив экспериментальных данных [Cao и др. Nature 605, 551 (2022)]. По результатам этого тестирования будет показано, что программный фильтр на основе программы UFConf позволяет повысить процентную долю успешных лигандов в наборе мини-белковых конструкций, сконструированных методом компьютерного дизайна, и тем самым упростить этап экспериментального скрининга кандидатных мини-белковых лигандов.
2. Разработка упрощённого экспериментального протокола для получения и тестирования мини-белковых лигандов
(2026) Используя программы RFdiffusion и AlphaProteo (в настоящее время доступна для использования в режиме бета-тестирования), нами будут сгенерированы in silico несколько тысяч кандидатных мини-белковых лигандов, предназначенных для связывания с антиапоптотическими белками BHRF1 и Bcl-2. Кандидатные конструкции будут ранжированы согласно ранее описанным метрикам [Bennett и др. Nat. Commun. 14, 2625 (2023)]. В предварительном порядке будет также произведена оценка моделей с помощью разработанного в нашей лаборатории нейросетевого предиктора PCANN (см. выше). Из полученного набора будут отобраны по 10 наиболее перспективных конструкций для каждой из двух мишеней с целью дальнейшего экспериментального тестирования.
Образцы BHRF1 и Bcl-2 будут получены методом рекомбинантной экспрессии в культуре E. coli и валидированы с помощью стандартных методов контроля (масс-спектрометрия, ЯМР, иммуноферментный анализ). Кандидатные мини-белковые лиганды будут изготовлены методом твердофазного пептидного синтеза, включая вариант с N-терминальным цистеином предназначенный для конъюгации с тиол-реактивными флуоресцентными метками; полученный в результате синтеза материал будет использоваться "как есть", без хроматографической очистки. Будет реализован новый экспериментальный тест с использованием метода копреципитации на магнитных наночастицах для идентификации эффективных мини-белковых лигандов. Тест будет апробирован в двух вариантах: с детекцией методом гель электрофореза ДСН-ПААГ и с детекцией по сигналу флуоресценции (и/или поглощения UV-Vis) от мини-белка, конъюгированного флуоресцентной меткой. Результатом станет экспериментальная идентификация успешных мини-белковых лигандов BHRF1 и Bcl-2 из числа десяти кандидатных конструкций, полученных методом компьютерного дизайна de novo.
(2027) На следующем этапе нами будет заново проведен отбор наиболее перспективных мини-белковых лигандов BHRF1 и Bcl-2 с применением программного фильтра на основе разработанного в нашей лаборатории нейросетевого предиктора PCANN (см. выше). Для тестирования отобранных кандидатных конструкций будут использованы образцы, полученные методом рекомбинантной экспрессии. При этом будет реализована упрощённая экспериментальная схема, позволяющая тестировать связывающую способность кандидатных мини-белков без необходимости проводить их хроматографическую очистку. Для этого экспрессируемые белки, оснащённые полигистидиновым тэгом, будут осаждены непосредственно из бактериального лизата на поверхность никелевых наночастиц. В свою очередь наночастицы с покрытием из мини-белка будут использованы для проведения теста на связывание с мишенью методом копреципитации. Как и ранее, тесты будут проводиться в двух вариантах: с детекцией методом гель электрофореза и по сигналу флуоресценции (поглощения). Результатом станет идентификация дополнительных de novo лигандов BHRF1 и Bcl-2 с использованием альтернативной методики, легко реализуемой в условиях биохимической лаборатории с использованием стандартного оборудования для рекомбинантной экспрессии. Полученные данные также дадут возможность оценить эффективность PCANN при использовании этой программы в качестве внешнего фильтра для отбора перспективных мини-белковых лигандов.
(2028) Аналогичное исследование будет проведено в отношении рецептора FGFR4, регулирующего клеточную пролиферацию. Мини-белковые лиганды для этой мишени будут сконструированы с помощью программ RFdiffusion, AlphaProteo и, возможно, других программных пакетов, которые появятся в предстоящие годы. Наиболее перспективные конструкции будут отобраны с привлечением усовершенствованной программы PCANN, а также нового алгоритма для оценки достоверности компьютерных моделей комплексов мишень / мини-белок с применением программы UFConf (см. выше). Образцы внеклеточного домена FGFR4 будут получены методом рекомбинантной экспрессии в культуре P. pastoris. Образцы кандидатных мини-белков будут получены либо методом твердофазного пептидного синтеза, либо методом рекомбинантной экспрессии в E. coli, как это описано выше (в зависимости от опыта, полученного в первые два года выполнения программы НИР). Тесты на связывание с мишенью будут проводиться в двух вариантах: как с использованием детекции методом гель электрофореза, так и по сигналу флуоресценции (поглощения). При этом результаты двух экспериментов будут подвергнуты сравнению с целью построить относительную шкалу аффинности для подобных измерений. Нами также будут проведены количественные измерения аффинности методом изотермической титрационной калориметрии с тем, чтобы привязать полученную относительную шкалу к абсолютным значениям Kd. В результате проведенных исследований будут получены новые мини-белковые лиганды FGFR4 и оптимизирована методика для экспериментального тестирования кандидатных мини-белковых конструкций с использованием стандартного лабораторного оборудования. Полученные данные также дадут возможность оценить эффективность новых алгоритмов на основе PCANN и UFConf для отбора перспективных мини-белковых лигандов, в том числе на основе количественных данных о константах связывания успешных лигандов.
3.1. Разработка методики для иммуногистохимической диагностики онкообразований с использованием мини-белковых лигандов
(2026) Клеточные эксперименты с мини-белковым лигандом Zher2-Cy5 будут проведены на серии клеточных линий с различным уровнем экспрессии онкорецептора HER2. В результате будет количественным образом охарактеризован уровень селективности Zher2 по отношению к HER2 на фоне нецелевых внеклеточных мишеней. Нами также будет реализован модельный клеточный эксперимент с использованием конструкции Zher2-биотин (аналог первичного антитела) и стрептавидин-HRP (аналог вторичного антитела, сопряженного с пероксидазой хрена). В дальнейшем такая реализация эксперимента позволит выполнять тесты ИГХ с регистрацией методом колориметрии, в соответствии со стандартным протоколом лабораторной диагностики. Для тестирования данной модели нами будет изготовлен образец внеклеточного домена HER2 (экспрессия в культуре P. pastoris). Используя полученный образец HER2, мы реализуем экспериментальную схему ИФА с использованием системы Zher2-биотин / стрептавидин-HRP, а также проведём измерения для уточнения константы связывания Zher2 с мишенью HER2 методом изотермической титрационной калориметрии. Эти эксперименты дадут возможность исчерпывающим образом протестировать и охарактеризовать тест-систему на основе Zher2 перед её целевым применением.
В качестве следующего шага тест системы Zher2-Cy5 и Zher2-биотин / стрептавидин-HRP будут апробированы на биоптатах и/или образцах операционной ткани, представляющих HER2-негативные и трижды позитивные опухоли. В качестве контроля будут использованы данные стандартных исследований ИГХ с применением сертифицированных антител. В результате мы планируем продемонстрировать принципиальную возможность проведения тестов ИГХ с заменой антител на высокоаффинные мини-белковые лиганды, полученные с помощью современных методов белковой инженерии.
(2027) На следующем этапе аналогичная схема исследований будет реализована на основе мини-белкового лиганда ENH32, предназначенного для связывания с ингибитором иммунного ответа PD-L1. Нами будут реализованы тест-системы на основе ENH32-Cy5 и ENH32-биотин / стрептавидин-HRP, а также изготовлен рекомбинантный образец внеклеточного домена PD-L1. Используя данные конструкции, мы проведём тестовые эксперименты на клеточных линиях с различным уровнем экспрессии PD-L1, а также измерения методом ИФА и ИТК. Эти эксперименты дадут возможность исчерпывающим образом протестировать и охарактеризовать тест-систему на основе ENH32 перед её использованием для иммуногистохимических исследованиях. После этого тест-системы на основе ENH32 будут апробированы на гистологических образцах с высоким уровнем экспрессии PD-L1, представляющих мелкоклеточный и немелкоклеточный рак лёгкого. Таким образом будет доказана возможность проведения тестов ИГХ с заменой антител на высокоаффинные мини-белковые лиганды для широкого круга онкомаркеров.
(2028) На заключительном этапе НИР аналогичным образом будут исследованы мини-белковые лиганды, предназначенные для связывания Bcl-2 и FGFR4, которые будут сконструированы и экспериментально апробированы в ходе выполнения программы НИР (см. раздел 2). Исследования будут проводиться по той же схеме, что описана выше для мини-белковых лигандов HER2 и PD-L1, включая пробные иммуногистохимические исследования на биоптатах и/или образцах операционной ткани. В результате будет показана принципиальная возможность для разработки "с нуля" тест-систем ИГХ на основе мини-белковых лигандов заданных белковых мишеней – маркеров онкологических заболеваний и других патологических состояний.
3.2. Исследование эффекта накопления мини-белков во внеклеточных везикулах с последующей транспортировкой внутрь клеток
(2026) Мы намерены продемонстрировать, что внеклеточные везикулы (выделяемые клетками линии RPMI 2650), будучи изолированными, сохраняют свою способность нагружаться растворимым мини-белком. При этом получаемая концентрация мини-белка в везикулах на порядок величины превышает таковую в растворе. Нами также будет проверена и (предположительно) доказана гипотеза о том, что эффект поглощения мини-белка везикулами в значительной мере обусловлен специфической укладкой мини-белков (трёхспиральный пучок). Мы рассчитываем показать, что эффект поглощения лишь в минимальной степени проявляется для малых белков с другим типом укладки и не зависит от типа используемой флуоресцентной метки. Мы также намерены продемонстрировать, что при переносе мини-белка в клетки (предположительно, при посредстве везикул), мини-белок преимущественно накапливается в клетке в форме внутриклеточных везикул, заключённых в липидную оболочку – что однако не исключает его частичного попадания в цитоплазму. При помощи проточной цитометрии будут получены данные, характеризующие кинетику процессов переноса белка между внеклеточными везикулами и клетками.
(2027) Нами будет проанализирована общность исследуемого эффекта по отношению к клеткам, продуцирующим внеклеточные везикулы, а также клеткам реципиентам везикул (на примере клеточных линий RPMI 2650, MCF7 и A549). Мы также планируем идентифицировать отдельные компоненты везикул, ответственные за эффект поглощения мини-белка из раствора и его накопления – например, фосфатидилсерин. Помимо этого мы намерены продемонстрировать, что до определённой степени наблюдаемый эффект может быть воспроизведён в липосомах с соответствующим липидным составом и, возможно, липосомах с добавлением отдельных белковых компонент, находимых во внеклеточных везикулах.
(2028) Мы планируем показать, что трёхспиральные мини-белки (по крайней мере, некоторые из них – например, LCB1) могут быть использованы в качестве доменов трансдукции для нагрузки внеклеточных везикул белками (доменами) с желаемыми свойствами. Например, в качестве нагрузки будет использована химерная конструкция LCB1-p53, потенциально обладающая терапевтическими свойствами по отношению к раковым клеткам с нарушениями экспрессии p53. Нами также будут получены везикулы с нагрузкой в виде мини-белкового ингибитора протоонкогенa Mdm2 (AB-Y-WCT A46T). Мы намерены показать, что такие везикулы могут использоваться в качестве средства доставки мини-белкового лиганда в клетки липосаркомы Т449 (интактный ген TP53, высокий уровень амплификации гена MDM2), индуцируя в них процесс апоптоза. В результате будет продемонстрирована принципиальная возможность использования внеклеточных везикул в качестве средств доставки активных мини-белков в клетки. Можно предвидеть, что в будущем широкое применение получат искусственные везикулы, созданные для этой цели с использованием элементов конструкции внеклеточных везикул.
Научный задел, имеющийся у коллектива, который может быть использован для достижения целей, предлагаемых к разработке научных тем или результаты предыдущего этапа
1. Реализация новых программных инструментов для оценки эффективности сконструированных in silico мини-белковых лигандов
В нашей лаборатории создан новый нейросетевой алгоритм PCANN для предсказания константы связывания белков на основе структуры белок-белкового комплекса. Статья с описанием этой программы в настоящее время находится на повторной рецензии в журнале Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics (доработка с несущественными исправлениями). PCANN использует языковую модель ESM-2 для кодирования информации об интерфейсах связывания белков и графовую сеть с вниманием для преобразования этой информации в предсказания Kd. В тестах с использованием двух ранее неиспользованных наборов данных в общей сложности 150 белок-белковых комплексов) PCANN показал более высокую точность, чем лучший из доступных на сегодняшний день нейросетевых предикторов, BindPPI. Среднее абсолютное отклонение между экспериментальными данными и предсказаниями PCANN составило 1,3 ккал/моль против 1,4 ккал/моль для BindPPI. Соответствующие иллюстративные материалы представлены на Рис. 1 в приложении «Предварительные результаты», размещённом по ссылке https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88.
В нашей лаборатории также разработан новый алгоритм для моделирования конформационных переходов в метаморфных белках на основе программы UFConf. Итеративный протокол с использование UFConf позволяет моделировать переход от одной стабильной белковой укладки к другой, сопровождаемый частичным разворачиванием и последующим пересворачиванием пептидной цепи. При этом нам удалось реконструировать ряд интермедиатов, которые были ранее идентифицированы в экспериментальных исследованиях метаморфных белков, см. иллюстрацию на Рис. 2 в приложении «Предварительные результаты» (https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88). Рукопись с изложением полученных результатов подготовлена для публикации в журнале Protein Science.
2. Разработка упрощённого экспериментального протокола для получения и тестирования мини-белковых лигандов
В рамках НИР по договору с ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, выполнявшемуся Лабораторией биомолекулярного ЯМР СПбГУ в течение 2021-2024 гг., нашим научным коллективом был освоен и автоматизирован процесс компьютерного дизайна мини-белковых лигандов на платформе программы Rosetta, а впоследствии программы RFdiffusion. Силами сотрудников лаборатории были изготовлены рекомбинантные образцы ок. 30 вариантов мини-белковых лигандов, предназначенных для блокирования рецептор-связывающего домена шиповидного белка (RBD-S) коронавируса SARS-CoV-2, включая пять мини-белковых лигандов, сконструированных de novo. Нами также был освоен протокол экспрессии RBD-S в культуре P. pastoris и получено 5 различных вариантов данного белка. В рамках данных исследований мы провели систематическое исследование аффинности полученных мини-белков по отношению к различным штаммам RBD-S методом изотермической титрационной калориметрии. Десять мини-белковых лигандов были изготовлены методом твердофазного пептидного синтеза (Pepmic Co., Suzhou, China). Для этих образцов была реализована новая методика, позволяющая тестировать связывание мини-белковых лигандов с мишенью методом копреципитации с детекцией посредством гель-электрофореза. При этом белковый материал, полученный методом твердофазного пептидного синтеза, использовался “как есть”, без трудоёмкой и технически трудновыполнимой хроматографической очистки. В дополнение к этому мы также реализовали видоизменённую методику, использовав рекомбинантный образец мини-белка, конъюгированный с флуоресцентной меткой. В этом случае связывание мини-белка с мишенью детектируется по сигналу флуоресценции или по спектру поглощения UV/Vis от финального смыва. Соответствующие иллюстративные материалы представлены на Рис. 3 в приложении «Предварительные результаты», размещённом по ссылке https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88.
3.1. Разработка методики для иммуногистохимической диагностики онкообразований с использованием мини-белковых лигандов
В рамках предварительных исследований по предлагаемой программе НИР нами был изготовлен рекомбинантный образец мини-белка Zher2, предназначенного для связывания с онкорецептором HER2. В последовательность Zher2 был дополнительно введёт N-концевой остаток цистеина для последующей конъюгации с флуоресцентной меткой sulfo-Cyanine5. Чтобы продемонстрировать детекцию HER2 при помощи Zher2-Cy5, нами была использована клеточная культура карциномы протока груди человека BT-474 с высоким уровнем экспрессии HER2 (ок. 2000 транскриптов/млн). В качестве контроля был использован эксперимент с клеточной линией карциномы легкого A549 с низким уровнем экспрессии HER2 (ок. 30 транскриптов/млн). При визуализации на конфокальном микроскопе на поверхности клеток BT-474 наблюдался равномерный и высокоинтенсивный сигнал флуоресценции Zher2-Cy5; при этом сигнал флуоресценции не наблюдался в контрольном эксперименте с клетками A549 (см. приложение «Предварительные результаты», Рис. 4: https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88). Таким образом нами была продемонстрирована принципиальная возможность проведения анализа ИГХ для определения уровня экспрессии рецептора HER2 с применением мини-белкового лиганда Zher2.
3.2. Исследование эффекта накопления мини-белков во внеклеточных везикулах с последующей транспортировкой внутрь клеток
В ходе предварительных исследований по предлагаемой программе НИР мы обнаружили эффект накопления мини-белка LCB1 во внеклеточных везикулах, выделяемых клетками RPMI 2650 (см. Рис. 5 в приложении «Предварительные результаты», размещено по ссылке https://cloud.mail.ru/public/idL1/BPSdqwf88). Захват мини-белка везикулами происходит на протяжении нескольких минут; при этом концентрация мини-белка в ВВ многократно (на два порядка величины) превышает таковую в растворе. Таким образом, наблюдаемый процесс позволяет быстро и эффективно нагрузить ВВ рекомбинантным белком, что открывает новые перспективы для разработки технологии доставки на основе внеклеточных везикул. Вслед за быстрым накоплением LCB1 в везикулах мы наблюдаем также постепенный перенос мини-белка в клетки, который становится заметен по прошествии получаса и хорошо различим по прошествии пяти часов (см. Рис. 5 в приложении «Предварительные результаты»). Можно предположить, что по крайней мере частично этот перенос происходит при посредстве нагруженных мини-белком везикул.
В ходе выполнения программы НИР мы планируем изолировать внеклеточные везикулы и продемонстрировать, что их можно нагружать целевым мини-белком и вне клеточной культуры. Для выделения ВВ будут использованы специальные устройства, разработанные и изготовленные ООО «Простагност». Сотрудниками нашей лаборатории налажен контакт с фирмой-изготовителем и успешно проведены пробные эксперименты. Нами также проведены предварительные измерения методом проточной цитофлуориметрии, позволяющие охарактеризовать распределение мини-белка в культуре RPMI 2650. Данные цитометрии позволяют выделить популяции везикул и клеток (основываясь на интенсивности прямого светорассеяния) и проинтегрировать соответствующий сигнал от мини-белкового лиганда LCB1, конъюгированного с флуоресцентной меткой Atto647, тем самым определив содержание мини-белка в везикулах и клетках. Наконец, в рамках подготовки настоящей заявки нами были получены предварительные данные, указывающие на то, что (небольшой, но отчётливо наблюдаемый) эффект накопления мини-белка можно наблюдать в образцах липосом с содержанием 60% фосфатидилхолина (POPC), 20% фосфатидилсерина (POPS) и 20% дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). При этом необходимым условием для захвата мини-белка является присутствие фосфатидилсерина.
Предполагается, что требования по софинансированию будут выполнены за счёт получения на конкурсной основе гранта РНФ (Конкурс на получение грантов РНФ по мероприятию «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (совместно Государственным фондом естественных наук Китая – NSFC); планируемое финансирование на 2026-2028 гг. 21 млн. руб.).
