Характеризация CRISPR-CasY нуклеаз: 2020 г. этап 1

  • Северинов, Константин Викторович (руководитель)
  • Федорова , Яна Витальевна (исполнитель)
  • Казалов, Максим Алексеевич (исполнитель)
  • Абрамова, Марина Викторовна (исполнитель)
  • Французова, Ирина Владимировна (исполнитель)
  • Морозова, Наталия Евгеньевна (исполнитель)

Проект: исполнение гранта/договораисполнение этапа гранта/договора

Сведения о проекте

описание

CRISPR - Cas системы - бактериальные защитные системы клеток, широко используемые на сегодняшний день для изменения генома эукариотических организмов. Работа этих систем основана на действии Cas нуклеаз, белков, которые в комплексе с направляющими РНК способны специфически узнавать сайты в ДНК-мишени и вносить в них двунитевые разрывы.
CRISPR - Cas системы широко представлены в различных видах бактерий и архей, и не смотря на общий принцип функционирования, очень разнообразны в строении эффекторных Cas комплексов и механизмах действия.
В 2017 году был обнаружен новый тип CRISPR Cas систем, работа которых основана на CasY нуклеазах (Burstein, D et al. 2017). Была показана активность этих систем в бактериальных клетках, однако на сегодняшний день неизвестно, за счет каких компонентов функционирует CRISPR-CasY нуклеазный комплекс. В данной работе планируется определить механизм функционирования этой защитной системы.
Для этого в ходе проекта будет проведено исследование защитных свойств системы в бактериальных клетках: компоненты CRISPR-CasY системы из разных бактерий будут гетерологически эксперссированы в E.coli для последующего заражения их чужеродной ДНК и оценки эффективности защиты. Кроме того, будут проведены работы по изучению адаптации CRISPR-CasY систем - вставки новых спейсеров в CRISPR кассету. Такие эксперименты не проводились ранее и дадут возможность получить новые данные о приобретении иммунитета бактериями. Далее планируется синтезировать все компоненты CRISPR-CasY нуклеазной системы in vitro: получить рекомбинатные формы эффекторных CasY нуклеаз, синтезировать направляющие РНК и т.д. Проведение in vitro реакций разрезания ДНК-мишеней позволит определить состав минимального ДНК-разрезающего комплекса, что в дальнейшем позволит воссоздать систему в других организмах, в том числе эукариотических. CRISPR-CasY система разрезания геномной ДНК эукариот может стать наряду с широко используемыми Cas9 нуклеазами одним из эффективных инструментов геномного редактирования. На настоящий момент в литературе отсутствуют данные о воссоздании активности CasY нуклеаз in vitro и использования их в целях генетической модификации эукариот.
В течение первого года работ по проекту планируется:
1)Выбрать интересные для изучения CRISPR-CasY системы
2)Создать генетические конструкции для экспрессии генов систем в клетках E.coli
3)Определить эффективность защиты CRISPR-CasY систем от чужеродных ДНК с помощью интерференционных тестов в бактериях
4)Провести секвенирование малых РНК, экстрагированных из клеток, несущих систему, для определения РНК-компонентов нуклеазного комплекса
5)Проверить возможность встройки новых спейсеров в CRISPR-CasY кассету в процессе адаптации, приобретения иммунитета к чужеродным ДНК

Планируемые к проведению работы позволят понять механизм функционирования этих пока не охарактеризованных CRISPR-Cas систем и перейти к следующему шагу работ – воссозданию минимального CasY нуклеазного комплекса.
В течение работ над проектом планируется подача заявок на гранты для получения дополнительных средств для проведения исследований по теме.

Короткий заголовокGZ-2020
АкронимМ1_2020 - 1
СтатусАктивный
Действительная дата начала/окончания22/06/2031/12/20

Ключевые слова

  • CRISPR CasY
  • защитные системы
  • бактерии