Физиологическая и биохимическая характеристика инфекционных цитоплазматических белковых агрегатов

    Проект: исполнение гранта/договораисполнение гранта/договора в целом

    Сведения о проекте

    описание

    Исследование свойств нового штамма приона может дать ключ к пониманию сходств и отличий механизмов агрегации амилоидогенных белков в клетках дрожжей и в клетках млекопитающих. Такая информация имеет важное фундаментальное и прикладное (биомедицинское) значение, с точки зрения выявления факторов, влияющих на агрегацию амилоидогенных белков, и, таким образом, влияющих на возникновение, развитие или ремиссию болезней, связанных с неправильной укладкой белка (болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона).
    В научной группе проф. Форберг в Германском Центре Нейродегенеративных Заболеваний была разработана уникальная модельная система анализа агрегации прионогенных белков, в частности, Sup35NM, в клетках млекопитающих. Именно здесь было показано, что прионогенные участки дрожжевых белков ведут себя в клетках млекопитающих как настоящие прионы. Лаборатория располагает передовым оборудованием для микроскопического и биохимического анализа внутриклеточной агрегации белков и межклеточной передачи приона.
    Проф. Чернов Ю.О., возглавляющий лабораторию Геномных и протеомных исследований, является признанным экспертом мирового уровня в области биологии прионов дрожжей. В лаборатории налажены методы дрожжевой трансформации и фенотипической детекции приона в дрожжевых клетках. Кроме того, отработаны все методические подходы для анализа агрегации белка Sup35NM in vitro, а именно:
    - отработан метод очистки рекомбинантного Sup35NM c минимальным уровнем спонтанной агрегации;
    - отработан метод затравления агрегации мономерного Sup35NM дрожжевыми лизатами, содержащими прионизированный Sup35NM.
    Отработанные методы являются ключевыми для проведения исследования, т.к. минимальный уровень спонтанной агрегации рекомбинантного белка позволяет воспроизводить в системе in vitro конформацию приона, присутствующего в дрожжевом лизате. Сочетание методического потенциала двух лабораторий является несомненным преимуществом данного проекта, позволяющем провести исследование на высочайшем уровне. Результаты исследования планируются к оформлению в виде статьи(ей), которые будут поданы в высокорейтинговые научные журналы.

    описание для неспециалистов

    Прионные заболевания (губчатые энцефалопатии млекопитающих) и амилоидогенные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, диабет второго типа) это группа неизлечимых и летальных болезней млекопитающих и человека, характеризующихся накоплением в тканях и органах амилоидов – полимерных белковых агрегатов, возникающих за счет образования межмолекулярных кросс-бета структур. В образовании агрегатов участвует белок, специфический для каждого конкретного заболевания и в норме присутствующий в клетке в растворимом состоянии. Агрегация запускается при появлении в клетке молекул белка, имеющих третичную структуру, альтернативную растворимой форме и обладающих способностью к агрегации. Кроме того, они способны взаимодействовать с молекулами в растворимой форме, меняя их конформацию на альтернативную. Поэтому, такие заболевания называют также «болезнями неправильной укладки белков».
    В научной группе проф. Форберг в Германском Центре Нейродегенеративных Заболеваний была разработана уникальная модельная система анализа агрегации прионогенных белков, в частности, дрожжевого белка Sup35NM, в клетках млекопитающих. Выявлено, что прионогенные участки дрожжевых белков ведут себя в клетках млекопитающих как настоящие прионы. В лаборатории проф. Форберг, в клетках млекопитающих был получен новый штамм приона Sup35NM, не характерный для клеток дрожжей. Исследование физиологических и биохимических свойств нового штамма приона может дать ключ к пониманию сходств и отличий механизмов агрегации амилоидогенных белков в клетках дрожжей и в клетках млекопитающих. Это имеет важное фундаментальное и прикладное (биомедицинское) значение, с точки зрения выявления факторов, влияющих на агрегацию амилоидогенных белков, и, таким образом, влияющих на возникновение, развитие или ремиссию болезней, связанных с неправильной укладкой белка.
    Лаборатория проф. Форберг располагает передовым оборудованием для микроскопического и биохимического анализа внутриклеточной агрегации белков и межклеточной передачи приона. В лаборатории Геномных и протеомных исследований ИТБМ СПбГУ (руководитель - проф. Чернов Ю.О.) налажены методы дрожжевой трансформации и фенотипической детекции приона в дрожжевых клетках и анализа агрегации белка Sup35NM in vitro. Сочетание методического потенциала двух лабораторий позволит провести исследование на высочайшем уровне. Результаты исследования планируются к оформлению в виде статьи(ей), которые будут поданы в высокорейтинговые научные журналы.

    основные результаты по проекту в целом

    На начальных этапах проекта были сконструированы плазмиды для наработки рекомбинантного белка в клетках бактерий, а также получены препараты полноразмерной и укороченной форм Sup35NM для экспериментов in vitro.
    Приоритетным направлением во время работы в лаборатории DZNE был анализ инфекционности агрегатов полноразмерного и укороченного Sup35NM из лизатов клеток млекопитающих для клеток дрожжей. В отличие от экспериментов in vitro, где может быть оценена только затравляющая способность агрегатов по отношению к мономерному белку, дрожжевая трансформация позволяет также оценить насколько такие агрегаты могут сохраняться и поддерживаться в клетках дрожжей. Для трансформации использовали лизаты клеток млекопитающих, несущие агрегаты полноразмерного Sup35NM, либо агрегаты укороченной формы этого белка с делецией Nтерминального участка N-домена - с 1-го по 39-й аминокислотные остатки - ключевого для агрегации в клетках дрожжей. Такой делеционный вариант Sup35NM не способен к агрегации в клетках дрожжей, а его агрегация в клетках нейробластомы происходит за счет С-терминальной части N-домена (с 98-го по 123-й аминокислотные остатки), ключевой для агрегации в клетках млекопитающих. Результаты эксперимента показывают, что агрегаты укороченной формы Sup35NM эффективно агрегирующей в клетках млекопитающих, но не способной к агрегации в клетках дрожжей, способны затравлять агрегацию Sup35 в клетках дрожжей и вызывать супрессию нонсенс-мутации ade1-14, что фенотипически проявляется в появлении способности у трансформированных клеток расти на минимальной среде без добавления аденина. При искусственном повышении концентрации Sup35NM в клетках дрожжей за счет его сверхпродукции эффективность трансформации возрастала, но только в случае сверхпродукции полноразмерного Sup35NM. Эффективность трансформации дрожжевых клеток при сверхпродукции в них укороченной формы белка не отличалась от варианта, где количество Sup35NM искусственно не модифицировалось. По-видимому, агрегаты укороченной формы Sup35NM из клеток млекопитающих вызывают в клетках дрожжей агрегацию полноразмерных белков Sup35/Sup35NM по С-терминальной части N-домена, что, в свою очередь может дополнительно индуцировать агрегацию и N-терминальной части N-домена, присутствующую в эндогенном Sup35/Sup35NM и являющуюся ключевой для агрегации в дрожжах. Следует отметить, что агрегаты полноразмерного Sup35NM из клеток млекопитающих не обладали способностью затравлять агрегацию эндогенного Sup35 в клетках дрожжей. Этот феномен требует дальнейшего исследования. Причиной невозможности воспроизводства и поддержания таких агрегатов может являться, например, токсичность этих форм приона для дрожжевых клеток, либо пострансляционная модификация Sup35NM в клетках млекопитающих, препятствующая передачи прионной структуры неагрегированному белку в клетках дрожжей. В результате экспериментов по трансформации дрожжей агрегатами укороченной формы Sup35NM из клеток млекопитающих было отобрано более 70 дрожжевых клонов, несущих различные штаммы приона Sup35. В настоящий момент проводится классификация штаммов приона по эффективности нонсенс-супрессии, свойства вариантов приона различной силы будут проанализированы по плану, представленному ниже. В ходе командировки были освоены приемы работы с культурами клеток млекопитающих. Был наработан, собран и заморожен клеточный материал культур нейробластомы, экспрессировавших полноразмерный и различные укороченные варианты Sup35NM и несущие агрегированные или растворимые формы этих белков. Собранный материал будет использован в экспериментах in vitro для приготовления клеточных лизатов, несущих агрегаты различных форм Sup35NM, а именно:
    1. При проверке агрегирующей способности лизатов по отношению к растворам полноразмерного и укороченного мономерного рекомбинантного белка.
    2. Для физико-химического анализа амилоидных фибрилл, образованных при затравке полноразмерного и укороченного мономерного Sup35NM клеточными лизатами, включающего в себя
    - сравнительный анализ термолабильности и устойчивости к детергентам агрегатов полноразмерного или укороченного Sup35NM, полученных при затравлении мономеров лизатами клеток дрожжей или млекопитающих, соответственно, при помощи гель-электрофореза;
    - анализ способности агрегатов, образованных полноразмерным белком, вызывать агрегацию мономеров укороченного фрагмента и наоборот. - оценку размеров образующихся агрегатов с использованием таких методик, как полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле;
    - ограниченный протеолиз фибрилл и анализом протеолитических фрагментов для идентификации участков аминокислотной цепи, образующих амилоидный кор.
    Наряду с лизатами клеток нейробластомы, в этих экспериментах планируется использовать лизаты клеток дрожжевых клонов, несущих различные по силе штаммы приона, полученные при трансформации клеток дрожжей агрегатами Sup35NM из клеток млекопитающих.
    АббревиатураD. Mendeleev 2018
    СтатусЗавершено
    Действительная дата начала/окончания3/09/183/12/18

    Ключевые слова

    • Прионы
    • Амилоиды
    • Прионные заболевания и амилоидозы
    • Агрегация белка
    • Белок Sup35NM
    • Культура клеток млекопитающих
    • Saccharomyces cerevisiae