Разработка новых подходов для диагностики и лечения наследственных и многофакторных заболеваний на основе изучения молекулярных механизмов их патогенеза: 2020 г. этап 1

  • Хуснутдинова, Эльза Камилевна, Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (руководитель)
  • Карунас, Александра (исполнитель)
  • Хидиятова, Ирина (исполнитель)
  • Бермишева, Марина (исполнитель)
  • Гилязова, Ирина (исполнитель)
  • Гималова, Галия (исполнитель)
  • Климентова, Елизавета (исполнитель)
  • Федорова, Юлия (исполнитель)
  • Савельева, Ольга (исполнитель)

Проект: исполнение гранта/договораисполнение этапа гранта/договора

Сведения о проекте

описание

4.3.7.1. Научная проблема, на решение которой направлен проект.

Данный проект направлен на решение фундаментальной и социально-значимой проблемы изучения основ наследственной предрасположенности к широко распространенным онкологическим (рак молочной железы, рак яичника, рак почки) и аллергическим заболеваниям (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит), а также оценку эффективности проводимой терапии для раскрытия этиологии и патогенеза данных заболеваний и оптимизации лечения. Онкологические и аллергические заболевания относятся к числу широко распространенных, тяжелых и инвалидизирующих заболеваний, в случае онкологических с высокой частотой приводящих к смертельному исходу. Генетическая и фенотипическая гетерогенность, недостаточная изученность молекулярного патогенеза, поздняя диагностика, наличие у большого числа пациентов тяжелых, трудно поддающихся лечению форм рассматриваемых патологий, свидетельствуют о необходимости разработки современных высокоэффективных систем для прогнозирования риска развития этих заболеваний и выявления на ранних стадиях. В последние годы проведен ряд масштабных генетических исследований данных заболеваний, значительный прогресс в изучении наследственной природы связан с исследованием больших выборок в рамках работ международных консорциумов и активным применением современных методов исследований: полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), полноэкзомного, полногеномного и таргетного секвенирования с применением NGS-технологии (секвенирования нового поколения), полногеномного исследования профиля экспрессии генов, полногеномного анализа метилирования (EWAS) и др. Наряду с генетическими исследованиями, в последние годы активно проводится изучение эпигенетических механизмов развития онкологических и аллергических заболеваний, таких как метилирование ДНК, модификация гистонов, дифференциальная активность микроРНК, что позволяет значительно расширить понимание характера взаимодействия средовых и генетических факторов. Несмотря на многочисленность проводимых генетических и эпигенетических исследований данных патологий, остается множество нерешенных вопросов, исследование которых требует комплексного и разностороннего подхода.
Невзирая на успехи клинической фармакологии, терапия онкологических и аллергических заболеваний до сих пор остается сложной задачей. Появление новых препаратов для лечения онкологических заболеваний - ингибиторов контрольных точек иммунитета (ИКТИ, check-point inhibitors) - является революционным достижением в области онкологии. У некоторых больных эффект после применения данной группы препаратов может сохраняться длительное время, значительно увеличивая продолжительность жизни пациентов по сравнению с ранее проводимым лечением. В настоящее время маркером оценки эффективности препаратов ИКТИ считается высокая экспрессия PD-L1, однако, данный маркер не является специфичным, иногда при высоком уровне его экспрессии пациенты не отвечают на лечение, и в то же время описаны случаи, когда при низкой экспрессии PD-L1 препарат является эффективным для некоторых пациентов. Тем не менее, других маркеров, которые могли бы свидетельствовать об эффективности терапии ИКТИ, предсказывать риск развития резистентности к терапии, не существует. В связи с этим, актуальным является поиск маркеров для контроля эффективности лечения пациентов с раком почки препаратами ИКТИ на основе комплексного генетического и эпигенетического анализа опухоли и ее микроокружения.
Эффективность лекарственной терапии, оптимальный класс и режим дозирования препаратов у больных аллергическими заболеваниями также во многом определяются генетическими и эпигенетическими факторами, которые необходимо учитывать при определении тактики лечения. Учитывая наблюдаемую вариабельность ответа пациентов на проводимую терапию и наличие выраженных межпопуляционных различий частот полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме лекарственных препаратов, актуальным является проведение фармакогенетических исследований АЗ с учетом этнической принадлежности пациентов.
Все вышесказанное указывает на актуальность, научную значимость и своевременность комплексного изучения данных патологий с использованием междисциплинарного подхода, основным преимуществом которого является объединение глубоких фундаментальных знаний специалистов в области молекулярной генетики и биоинформатики с целью получения значимых с фундаментальной и практической точки зрения результатов. Решение задач, поставленных в данном проекте, даст возможность охарактеризовать процесс формирования генетической предрасположенности к онко- и аллергопатологиям в целом, а также к определенным заболеваниям, выявить высокоспецифичные потенциальные маркеры развития, течения и эффективности терапии данных заболеваний, будет способствовать разработке подходов своевременной профилактики и лечения.

4.3.7.2. Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы.
Актуальность и значимость планируемых научных исследований диктуются основной стратегией развития современной медицины - переводом ее на уровень персонализированной медицины (ПМ), представляющей собой интегральную медицину, которая включает в себя разработку персонализированных средств лечения, тестирование на предрасположенности к болезням, профилактику, диагностику и лечение заболеваний с учетом индивидуальных генетических особенностей пациентов. Необходимыми условиями развития и внедрения методов ПМ являются выявление генетических и эпигенетических механизмов патогенеза заболеваний. Выявление молекулярных механизмов патогенеза болезней, их конкретных клинических фенотипов является основой для разработки методов ранней диагностики и новейших методов лечения.
Онкологические заболевания часто связаны с мутациями в ключевых генах. Идентификация основных событий, способствующих развитию злокачественных новообразований и общих механизмов их патогенеза может способствовать разработке новых подходов к диагностике и лечению рака. Анализ результатов крупномасштабных GWAS позволяет идентифицировать совершенно новые локусы риска, общие для нескольких онкологических заболеваний. Идентификация таких «перекрестных локусов» может выявить общие генетические факторы, лежащие в основе формирования злокачественных опухолей и способствовать одновременной оценке риска развития большого спектра онкологических заболеваний.
Имеющиеся на сегодняшний день данные, полученные в исследованиях по изучению предиктивных маркеров при различных опухолях, зачастую противоречивы ввиду разных подходов к исследованию, этнической вариабельности, статистических погрешностей и небольшого количества наблюдений, поэтому работа в этом направлении весьма перспективна и актуальна. Выявление факторов риска развития онкологических заболеваний, способствующих развитию злокачественных новообразований с использованием данных результатов полногеномных исследований, проводится во всем мире, и конечная цель таких исследований - это разработка эффективных систем для прогнозирования риска развития заболеваний и выбора правильной тактики и стратегии лечения.
Достижения в области иммунотерапии рака в последнее десятилетие считаются одними из важных в области медицинских и биологических наук. Развитие и прогрессирование онкологических заболеваний вызывает сильный противоопухолевый иммунный ответ, благодаря которому иммунная система может уничтожать злокачественные клетки. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа, также известные как чекпойнт-ингибиторы (check-pointinhibitors) - это группа современных иммуноонкологических препаратов, механизм действия которых направлен на восстановление нормального противоопухолевого иммунного ответа путем блокирования ингибиторных рецепторов Т-лимфоцитов, так называемых  ключевых точек иммунитета, – антигена 4-го типа, ассоциированного с антицитотоксическим Т-лимфоцитом (CTLA-4), и белка программируемой клеточной гибели (PD-1), его лигандов PD-L1 и PD-L2, и связанных с ними ингибиторных сигналов, позволяющих опухолевым клеткам уклоняться («ускользать») от иммунологического надзора. Иммунная регуляция контрольных точек является предметом интенсивного изучения во всем мире, однако лежащие в основе механизмы, регулирующие экспрессию PD1 и PD-L1, до конца не изучены. Физиологическая роль иммунных контрольных точек состоит в том, чтобы поддерживать самостоятельную толерантность и минимизировать степень и продолжительность воспалительных реакций. Внедрение терапевтических антител (Ниволумаб, Пембролизумаб, Авелумаб), нацеленных на путь PD-1 / PD-L1, в клиническую практику привело к значительному улучшению результатов лечения пациентов.
К сожалению, у большей части пациентов отмечается нечувствительность опухолей к препаратам этого класса и дальнейшее прогрессирование опухолевого процесса на фоне проводимого лечения. В механизме противоопухолевого иммунитета в целом и механизме действия ИКТИ остается много неясных вопросов. Факторы, лежащие в основе чувствительности к ингибиторам контрольных точек, в настоящее время интенсивно изучаются. Имеющиеся на данный момент маркеры эффективности являются неспецифичными. В связи с этим, поиск маркеров, приводящих к резистентности к препаратам ИКТИ, очень актуален и имеет решающее значение для выявления пациентов, которые с меньшей вероятностью отвечают на лечение, что могло бы позволить выбрать наиболее эффективную тактику их лечения и повысить экономический эффект применения препаратов.
По данным Всемирной организации аллергии, около 30-40% населения мира страдают различными аллергическими заболеваниями [http://www.worldallergy.org]. Бронхиальная астма, аллергический ринит и атопический дерматит (атопическая триада) – три распространенных, взаимосвязанных между собой аллергических заболевания, часто трансформирующихся из одного в другое и сопутствующих друг другу. Данные эпидемиологических исследований позволяют отнести аллергические заболевания к синтропиям, предполагая наличие как общих (синтропных) генов, видимо отвечающих за общие звенья патогенеза (предрасположенность к аллергиям вообще), так и генов, специфических для разных групп заболеваний [Фрейдин М.Б., 2010; Sun H.L., et al., 2012; Pinart M., et al., 2014; Ziyab A., et al., 2014; Garcia-Aymerich J., et al., 2015; Gough H., et al., 2015; Jacob L. et al., 2016].
В последние годы проведен ряд масштабных генетических исследований АЗ, значительный прогресс в изучении наследственной природы АЗ связан с исследованием больших выборок в рамках работ международных консорциумов и активным применением современных методов исследований: полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), полноэкзомного, полногеномного и таргетного секвенирования с применением NGS-технологии (секвенирования нового поколения), полногеномного исследования профиля экспрессии генов, полногеномного анализа метилирования (EWAS) и др. Обнаружено более 300 генов, функция белковых продуктов которых тесно связана с развитием АЗ [Holloway J.W. et al., 2010; Meng J.-F. et al., 2010; Ortiz R.A. andBarnes K.S., 2015; Willis-Owen S.A.G. et al., 2018]. Проведено более 20 полногеномных анализов сцепления БА, атопии, АР и АД. Выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АЗ, идентифицированы позиционно-клонированные гены для БА и АД [Zhang Y. et al., 2003; Marchet al., 2011; Ortiz R.A. andBarnes K.S., 2015; Willis-Owen S.A.G. et al., 2018]. Выполнено более 90 полногеномных анализов ассоциации (GWAS) БА и ее различных клинических фенотипов, 8 GWAS АР и 10 GWAS АД, в результате которых выявлено более 1000 ассоциированных с АЗ полиморфных вариантов генов, выполняющих различные роли, включая воспалительные функции клеток и их активацию (IL13, IL6R, DENND1B, LRRC32, IL2RB, IL1RL1), барьерную функцию эпителия (IL33, IL1RL1, C11orf30, TSLP, CDHR3), сокращение гладких мышц дыхательных путей (PDE4D), апоптоза и дифференцировки клеток (GSDMB) и др. [www.genome.gwas.org].
Наряду с генетическими исследованиями, в последние годы активно проводится изучение эпигенетических механизмов развития аллергических заболеваний, таких как метилирование ДНК, модификация гистонов, дифференциальная активность микроРНК, что позволяет значительно расширить понимание характера взаимодействия средовых и генетических факторов [Specjalski K., Jassem E., 2019]. Большое число исследований АЗ посвящено изучению роли малых или других некодирующих РНК. МикроРНК играют важную роль в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, путем связывания с целевыми РНК-носителями (мРНК) для их подавления или деградации, что приводит к общему снижению экспрессии гена [Carnino J. M., et al., 2018]. МикроРНК оказывают несомненное влияние на регуляцию аллергического воспаления. Основной набор микроРНК, участвующих в патогенезе АЗ, включает miR-196a2, miR-146a, miR-499, miR-148a, miR-148b, miR-152, miR-149, miR-21, miR-223, miR-142-5p, miR-142-3p, miR-146b, miR-155, let-7, miR-193b и miR-375. Некоторые отдельные микроРНК могут быть использованы в качестве биомаркеров аллергических заболеваний [Specjalski K., Jassem E., 2019].
В последнее десятилетие во всем мире активно проводятся фармакогенетические исследования АЗ, актуальность которых объясняется наблюдаемой гетерогенностью ответа пациентов на терапию и наличием пациентов с резистентными к терапии тяжелыми формами заболеваний. У значительной части пациентов отмечается недостаточная эффективность контроля симптомов, что приводит к развитию более тяжелых форм и серьезных осложнений. Установлено, что генетическая предрасположенность на 60-80% определяет индивидуальную вариабельность в эффективности терапии пациентов определенной группой препаратов [Isidoro-García M. et al., 2017; Farzan N. et al., 2017].
Несмотря на многочисленность проводимых генетических и эпигенетических исследований АЗ, остается множество нерешенных вопросов, исследование которых требует комплексного и разностороннего подхода. Клиническая гетерогенность этой группы заболеваний со сходным этиопатогенезом свидетельствует о необходимости идентификации факторов риска, предрасполагающих к развитию аллергопатологии в целом, а также к определенным аллергическим заболеваниям у индивидов различной этнической принадлежности, с целью разработки подходов своевременной профилактики и лечения. Актуальным является поиск новых генетических и эпигенетических маркеров эффективности проводимой терапии глюкокортикостероидными и антигистаминными препаратами для разработки новых подходов диагностики и лечения данных заболеваний.
В связи с вышесказанным, планируется провести комплексное исследование генетических и эпигенетических механизмов развития ряда онкологических и аллергических заболеваний с использованием современных технологий геномного анализа для разработки эффективных подходов диагностики, профилактики и лечения этих заболеваний.

4.3.7.3. Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб.
Настоящий проект является фундаментальным биомедицинским исследованием, целью которого является раскрытие молекулярных механизмов патогенеза многофакторных онкологических и аллергических заболеваний, направленное на разработку новых эффективных подходов ДНК-диагностики и патогенетического лечения.
Для достижения цели исследования поставлены следующие задачи:
1.    Поиск общих генетических маркеров риска развития рака молочной железы, рака яичников, а также специфических маркеров различных форм данных заболеваний (эстроген-рецептор положительный (ER+) рак молочной железы и эстроген-рецептор отрицательный (ER-) рак молочной железы, серозный рак яичников) на основе полногеномных исследований.
2.    Идентификация генетических и эпигенетических маркеров риска развития аллергических заболеваний и эффективности их терапии глюкокортикостероидными и антигистаминными препаратами.
3.    Идентификация генетических и эпигенетических маркеров риска развития рака почки и эффективности их терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа.

4.3.7.4. Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.
Научная новизна данного исследования состоит в реализации комплексного подхода к решению фундаментальной и социально-значимой проблемы изучения молекулярных основ наследственной предрасположенности к широко распространенным онкологическим (рак молочной железы, рак яичников и рак почки) и аллергическим заболеваниям (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит), а также к поиску маркеров эффективности / резистентности их лечения. В проекте будет проведен поиск маркеров риска развития широко распространенных онкологических и аллергических заболеваний на основе анализа генетических и эпигенетических факторов.
Кроме того, учитывая существующую гетерогенность ответа пациентов на терапию и наличие пациентов с резистентными к терапии тяжелыми формами онкологических и аллергических заболеваний, особое внимание будет уделяться поиску маркеров эффективности терапии этих двух групп заболеваний.
В частности, при раке молочной железы различных форм и при раке яичников будет проведен транскриптомный анализ для идентификации общих и специфических маркеров риска их развития.
Кроме того, будет проведен поиск молекулярно-генетических особенностей пациентов с метастатическим раком почки, получающих терапию ингибиторами контрольных точек иммунитета и по-разному отвечающих на проводимое лечение, с использованием самых современных методов молекулярно-генетического исследования. В проекте запланирована оценка генетических и эпигенетических маркеров и их влияние на эффективность терапии препаратами ИКТИ. Для решения и достижимости поставленных задач в работе будут использованы хорошо охарактеризованные репрезентативные выборки больных раком почки, демонстрирующих эффективный ответ на терапию ИКТИ и, напротив, резистентных к проводимой терапии. Все пациенты будут обследованы и охарактеризованы высококвалифицированными специалистами Республиканского клинического онкологического диспансера и кафедр онкологии и урологии Башкирского государственного медицинского университета. Информированное согласие на участие в эксперименте будет получено от каждого индивидуума. В проекте будут применены современные высокотехнологичные методы молекулярно-генетического исследования с использованием технологии OpenArray на приборе QuantStudio™ 12K Flex.
Предлагаемое в данном проекте исследование генетических и эпигенетических маркеров развития аллергических заболеваний и эффективности ответа на терапию глюкокортикостероидными и антигистаминными препаратами у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности ранее не проводилось, в связи с чем отличается выраженной научной новизной и практической значимостью для понимания патогенеза заболеваний и назначения адекватной персонализированной терапии. Проведенные на сегодняшний день генетические и эпигенетические исследования АЗ выявили множество полиморфных вариантов генов, которые оказывают умеренное влияние на патогенез и эффективность терапии АЗ, однако полученные в различных исследованиях данные зачастую противоречат друг другу и не объясняют наблюдаемой вариабельности терапевтического ответа больных АЗ на лекарственные препараты. В настоящем проекте запланировано молекулярно-генетическое исследование АЗ на различных выборках пациентов с учетом фенотипов и эндотипов заболеваний, с четкими критериями оценки эффективности терапевтического ответа на препарат является целесообразным. В рамках проекта также будет проведено исследование роли полиморфизма генов биогенеза и предшественников микроРНК в развитии АЗ и чувствительности к терапии у пациентов с АЗ, что является весьма актуальным в связи с тем, что существующие в настоящее время данные о значении регуляторных микроРНК в развитии аллергического воспаления малочисленны.
Одной из предпосылок достижения поставленных задач и получения запланированных результатов является высокий уровень профессионализма коллектива исполнителей, которые в течение многих лет исследуют генетические и эпигенетические факторы предрасположенности к развитию широко распространенных онкологических и аллергических заболеваний.
В настоящее время лаборатория располагает банком ДНК и РНК больных различными онкологическими заболеваниями (n=2000), аллергическими заболеваниями (n=906) и контрольной группы (2000). Проведен поиск мутаций в некоторых генах, являющихся важными участниками общих сигнальных путей, контролирующих целостность генома, клеточный цикл, апоптоз и дифференцировку клеток, обусловливающих повышенную чувствительность к ионизирующей радиации (Бермишева М.А., 2006-2019; Гилязова И.Р, 2008-2019; Климентова Е.А., 2012-2019). У русских, татар и башкир, проживающих в Республике Башкортостан, определены генетические маркеры риска развития АЗ (АД, БА и АР) по полиморфным вариантам генов-кандидатов (Карунас А.С. и др., 2004, 2007; 2012, Федорова Ю.Ю. и др., 2009-2011; Гималова Г.Ф. и др. 2012-2017]. В рамках интегрированного проекта Шестой рамочной программы Евросоюза GABRIEL проведен полногеномный анализ ассоциации бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности [Карунас А.С., 2011, 2015]. При фармакогенетическом исследовании БА изучены полиморфные варианты генов, участвующих в метаболизме бета-2-агонистов, глюкокортикостероидных и антилейкотриеновых препаратов [Федорова Ю.Ю., Карунас А.С., 2016, 2019].
Коллектив использует самые современные методы исследований в области физико-химической, молекулярной и клеточной биологии, чему способствуют имеющиеся уникальные дорогостоящие приборы, оборудование и наличие необходимых компьютерных программ. Все исполнители проекта обладают большим опытом выполнения соответствующих НИР в рамках выполнения грантов РФФИ, ФЦП, У.М.Н.И.К., СТАРТ, гранты Евросоюза и др., научных исследований и практических работ в области разработок тест-систем моногенных и многофакторных, в том числе онкологических заболеваний человека.
Все запланированные в проекте работы соответствуют мировому уровню. Ожидаемые результаты будут иметь приоритетный характер, характеризуются высокой степенью научной новизны и перспективности реализации предлагаемых подходов для достижения цели работы и внесут значительный вклад в генетику онкологических и пульмонологических заболеваний.

4.3.7.5. Современное состояние исследований по данной проблеме.
Злокачественные новообразования приобрели характер глобальной проблемы современности. Ежегодно в мире регистрируется более 18 млн новых случаев онкологических заболеваний и около 9.6 млн вызванных ими летальных исходов. Прогнозируемый прирост онкологической заболеваемости к 2040 г. составит около 60% [Globocan 2018]. Онкопатология — вторая по значимости причина смерти в мире и в России после сердечно-сосудистой патологии [Каприн и др., 2018]. Заболеваемость ею неуклонно растет в глобальном масштабе, что определяется объективными процессами старения населения и конвергенцией изменяющихся социальных и экологических факторов. Так, в России среднегодовой темп прироста заболеваемости населения злокачественными новообразованиями в 2008–2018 гг. превысил 1.7%. Это сказывается на снижении средней продолжительности жизни, росте невосполнимых потерь населения и колоссального экономического ущерба.
На сегодняшний день не вызывает сомнения, что пусковым механизмом образования и развития злокачественной опухоли являются генетические и эпигенетические нарушения в геноме. В последнее десятилетие генетическая природа онкологических заболеваний активно изучается во всем мире, в том числе в России, что связано как с несомненной актуальностью изучения факторов риска развития данной группы заболеваний, так и с появлением новых методов, таких как полногеномный анализ ассоциации (GWAS), полноэкзомное, полногеномное и таргетное секвенирование, основанное на технологиях секвенирования нового поколения (NGS). 
Редкие мутации с высокой пенетрантностью могут объяснить лишь не большое число семейных случаев рака молочной железы (РМЖ) или рака яичников (РЯ), они не объясняют причин возникновения спорадических форм заболеваний. Тем не менее, имеются значительные доказательства генетического вклада в риск даже для спорадического рака молочной железы. Большинство исследователей считают, что генетическая архитектура спорадической болезни является полигенной, в которой восприимчивость является результатом совокупного действия многих вариантов с низким эффектом проявления. Широкомасштабные исследования GWAS направлены на поиск таких вариантов, работая с большими выборками больные/контроль.
На сегодняшний день выполнено более 60 GWAS рака молочной железы. По мере роста этого числа преимущество мета-анализа - объединение фактических данных в нескольких исследованиях - становится очевидным. Первый крупномасштабный мета-анализ, проведенный Michailidou et al. (2013) в 2013 г. включал 55342 случаев РМЖ и 54455 контролей из девяти GWAS, были идентифицированы новые локусы ассоциированные с риском развития заболевания. В другой работе, включающей более 120000 человек из 52 исследований, выявлено еще 15 локусов предрасположенности [Michailidou et al. 2015]. Выявлены специфические локусы, объясняющие развитие разных подтипов РМЖ. Много работ посвящены изучению генетических детерминант рака с учетом статуса рецептора эстрогена (ER), рецептора прогестерона (PR) и / или экспрессии HER2. Установлено, что семь SNP имеют значительно больший эффект у пациентов с ER +, чем у пациентов с ER–, и только два SNP оставались ассоциированными с ER - раком молочной железы после корректировки на множественность тестирования [Broeks et al., 2011; Figueroaet al., 2011]. Стивенс и соавт. (2013) изучили 65 вариантов, ассоциированных с РМЖ и обнаружили, что хотя 38 были связаны как с ER +, так и с ER– заболеванием, остальные были уникальными только для одного подтипа.
Большая часть редких изменений в геноме, которые могут вносить значительный вклад в развитие заболеваний,  остается неизученной. Благодаря современным технологиям массового параллельного секвенирования можно выявлять как общие, так и редкие варианты. За последние несколько лет проведены исследования с использованием NGS технологии с целью изучения молекулярных характеристик рака, идентификации новых генетических изменений, способствующих онкогенезу, прогрессирования рака и метастазирования, гетерогенности опухоли и ее эволюции. Получены впечатляющие результаты при изучении рака яичников [Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 2011], колоректального рака (Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer), рака молочной железы (Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours), рака легких, рака печени, рака почки, рака головы и шеи, меланомы, острого миелоидного лейкоза и т.д. При изучении РМЖ, показано, что существует определенная специфичность ряда выявленных мутаций в отношении определенных подтипов РМЖ и нарушения конкретных патологических путей. Например, мутации в гене MAP3K1 часто встречаются при Люминальном А типе РМЖ. Некоторые мутации указывают на терапевтические возможности их использования, например, мутантный GATA3 может служить прогностическим маркером в случае применения ингибиторов ароматазы. В работе Thompson E. с соавторами (2012) в результате проведенного экзомного секвенирования на выборке больных с наследственной формой заболевания, выявлены мутации в генах репарации ДНК FANCC и BLM. Данный метод увеличивает возможности проводимых исследований и позволяет выявить не только патогенные мутации в уже известных генах, ответственных за развитие РМЖ, но и обнаружить новые варианты в генах, до сих пор не ассоциированных с заболеванием.
Рак почки (почечно-клеточный рак (ПКР)) - гетерогенная группа злокачественных опухолей, которые развиваются из клеток проксимальных извитых канальцев почки (паренхимы почки) [Матвеев и др., 2013; Ljungberget al., 2015]. В настоящее время выделяют 4 основных гистологических типа ПКР, для каждого из которых характерны специфичные молекулярно-генетические нарушения, определяющие потенциал злокачественности, метастазирования и чувствительности к лекарственному лечению. Наиболее распространенным является светлоклеточный рак (СРП), представляющий до 85% всех опухолей почки. СРП характеризуется мутациями в генах-супрессорах опухолевого роста, расположенных на коротком плече третьей хромосомы, среди которых  наибольший вклад в развитие заболевания вносят изменения в генах фон Хиппеля-Линдау (VHL) и полибромо 1 (PBRM1) [Матвеев и др., 2013; Ljungberget al., 2015; Михайленко и др., 2016]. Менее распространены хромофильный (папиллярный) (7– 14 %), хромофобный (4–10 %) рак и рак собирательных протоков (1–2 %) [Бежанова и др., 2017].
В России среди опухолей мочеполовой системы ПКР занимает 2-е место после злокачественных новообразований предстательной железы [Чиссов и др., 2017] и 1–3-е место по темпам прироста [Давыдов и др., 2014; Каприн и др., 2015; Чиссов и др., 2017]. К моменту постановки диагноза у 25-30% больных выявляют запущенные формы заболевания с отдаленными метастазами. Основным методом лечения почечно-клеточного рака считается радикальная нефрэктомия, в то же время отмечены высокая резистентность рака почки к химиотерапии и слабый ответ на лечение гормональными препаратами, а эффективность терапии цитокинами (интерлейкином 2, интерфероном альфа) не превышает 18–20 % [Носов и др., 2014]. Лучевая терапия при раке почки практически неэффективна.
С 2006 года для системной терапии рака почки зарегистрировано 11 препаратов, относящихся к группам анти-VEGF (ингибиторы фактора роста эндотелия сосудов, ингибиторы ангиогенеза), ингибиторам сигнального пути mTOR и ингибиторам иммунных контрольных точек. Препараты анти-VEGF подавляют формирование сосудов и тем самым препятствуют васкуляризации опухоли, из-за чего она «задыхается». Ингибиторы сигнального пути mTOR подавляют клеточный рост и выживание, а ингибиторы иммунных контрольных точек «обезоруживают опухоль» перед естественным противоопухолевым иммунитетом.
В основе парадигмы таргетной терапии лежит знание специфических геномных нарушений, мутаций, которые способствуют выживанию и размножению злокачественных клеток. Обнаружение аналогичных мутаций, определяющих чувствительность опухоли к иммунотерапии, могло бы помочь выделить пациентов, которым показано её проведение. Например, показано, что в некоторых случаях такие мутации оказывают влияние на иммунную систему. У пациентов с меланомой на фоне наличия мутации BRAF V600E отмечается секреция ряда факторов, подавляющих процессы активации иммунных клеток, при подавлении сигнального пути BRAF отмечается снижение секреции этих факторов. Тем не менее, в проведенных клинических исследованиях анти-PD1 препаратов, не было выявлено различий в их эффективности в зависимости от наличия мутаций BRAF. Также известно, что мутации в генах PTEN, ALK, LKB1 могут приводить к повышению секреции PD-L1 опухолевыми клетками, что делает перспективным их изучение в качестве биомаркеров эффективности иммунотерапии, однако, на данный момент не выявлено каких-либо специфических мутаций, ассоциированных с эффективностью иммунотерапии [Simmonset al., 2017].
Большинство классических цитостатиков и таргетных препаратов, применяемых в настоящее время, характеризуются узким спектром противоопухолевого действия и быстрым развитием резистентности. В отличие от них современные иммунотерапевтические препараты позволяют добиться клинического ответа при широком спектре злокачественных опухолей.
Важным преимуществом иммунотерапии является то, что препараты этого класса не оказывают прямого воздействия на опухолевые клетки, но восстанавливают реактивность собственной иммунной системы организма, что должно снижать риск развития резистентности. Несмотря на перечисленные преимущества, механизмы, через которые реализуется эффект иммунотерапевтических препаратов, во многом остаются неизвестными.
Почечно-клеточный рак (ПКР) является одной из наиболее иммуночувствительных опухолей, о чем свидетельствует опыт применения неспецифических иммуномодуляторов, например препаратов интерлейкина-2 или интерферона-α. Основой для разработки новых иммунотерапевтических препаратов послужили результаты исследований, показавшие, что опухолевые клетки для «ускользания» от иммунологического надзора используют механизмы, в физиологических условиях необходимые для предотвращения развития аутоиммунной агрессии и повреждения собственных тканей [Grünwaldet al., 2016; Leeet al., 2016; Schmidingeret al., 2018].
Регуляция этого процесса осуществляется клеточными и молекулярными факторами, значительное место среди которых занимают ингибиторные рецепторы Т-клеток, так называемые контрольные точки иммунитета [Koshkinet al., 2016; Matarazaet al., 2016]. Наиболее изученными из них являются CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyteassociatedprotein 4) [Callahanet al., 2013; Poprachet al., 2017; Sakamuriet al., 2017; Simmonset al., 2017] и PD-1 (рrogrammedcelldeathpathway 1) [Ottet al., 2013; Румянцев и др., 2016; Rosset al., 2017]. PD-1 – мембранный белок, принадлежащий к семейству CD28 / CTLA-4 регуляторов Т-клеток. PD-1 играет важную роль в подавлении активности Т-клеток и предотвращении аутоиммунных реакций. При взаимодействии PD-1 c его лигандами запускается апоптоз цитотоксических лимфоцитов в опухолевом микроокружении, при этом усиливается активность регуляторных T-лимфоцитов, что способствует «ускользанию» опухоли от иммунологического надзора [Pardollet al., 2012; Patelet al., 2015; Румянцев и др., 2016; Ключагина и др., 2017].
Блокада PD-1 / PD-L1 усиливает противоопухолевый иммунитет, уменьшая количество и/или иммуносупрессивную активность регуляторных T-лимфоцитов и восстанавливая активность эффекторных Т-клеток, а также стимулирует пролиферацию В-клеток памяти.
Механизм действия препаратов, воздействующих на сигнальный путь PD-1, связан с блокированием взаимодействия его рецепторов и их специфических лигандов, PD-L1 и PD-L2. Можно предположить, что необходимым условием для реализации действия препаратов данной группы является использование злокачественными клетками этого сигнального пути для ухода от надзора иммунной системы. В этом случае наличие экспрессии лигандов PD-1 в опухоли могло бы позволить выделить пациентов, которые получат преимущество от применения препаратов, подавляющих активность этого сигнального пути. Экспрессия PD-L2 обнаруживается при некоторых солидных опухолях, однако, на сегодняшний день роль экспрессии PD-L2 в опухолях на эффективность применения иммунотерапевтических препаратов не изучена. Имеющиеся данные показывают, что наличие экспрессии PD-L2 коррелирует с экспрессией PD-L1 и редко встречается изолированно [Callahanet al., 2013].
Особый интерес в связи с иммунотерапией онкопатологии вызывают микроРНК, в частности, сети микроРНК, прямо и косвенно контролирующие экспрессию рецепторов иммунной контрольной точки.
МикроРНК, которые специфически ингибируют только одну контрольную точку, подходят для оценки того, получит ли пациент пользу от терапии, и для оценки ответа на блокаду иммунной контрольной точки после начала терапии. МикроРНК, нарушающие регуляцию при аутоиммунном заболевании, могут быть использованы для мониторинга и прогнозирования связанных с иммунитетом побочных эффектов. Наконец, микроРНК, которые нацелены на несколько контрольных точек, являются идеальными терапевтическими мишенями, ввиду того, что они имитируют блокаду с несколькими ингибиторами иммунных контрольных точек, которые оказались лучше, чем терапия одним антителом.
Одной из стратегий определения того, будет ли пациент реагировать на ингибиторы контрольных точек, может быть экспрессия микроРНК, которые контролируют уровень иммунных контрольных точек. Например, было обнаружено, что уровень микроРНК miR-124 значительно снижен во всех классах и патологических типах глиом по сравнению с нормальной мозговой тканью, и она была идентифицирована как важный модулятор передачи сигналов STAT3 [Sempereet al., 2010; Scariaet al., 2013]. Также показано, что повышенная регуляция miR-124 в стволовых клетках рака глиомы ингибирует путь STAT3. Кроме того, системное лечение miR-124 с применением зрелой микроРНК (внутриопухолевой или внутривенной инфекцией) продемонстрировало терапевтический эффект против глиомы в мышиных моделях глиобластомы[Wiklundet al., 2011; Westermannet al., 2014]. Полученные эффекты указывают, что действие miR-124 зависит отналичия опосредованного Т-клетками противоопухолевого иммунного ответа [Wonget al., 2008].
Известно, что однонуклеотидные полиморфные варианты (SNP) могут влиять на эффективность и токсичность лекарств [Evans WE, Relling MV., 2004]. Поскольку лекарственные препараты взаимодействуют с незлокачественными эндотелиальными клетками и микроокружением опухоли, было предложено, что генетический фон пациента играет важную роль в терапии рака почки. Кроме того, анализ полиморфных вариантов может быть осуществлен в легко доступных биологических образцах, таких как кровь, и, в отличие от соматических мутаций, профиль SNP остается стабильным на протяжении всей жизни пациента. По этим причинам SNP широко изучаются в качестве биомаркеров ответа рака почки на различные виды лекарственной терапии.
Генетическая изменчивость в различных иммунных медиаторах является важной детерминантой в восприимчивости к широкому кругу аутоиммунных нарушений и новообразований, а также в прогрессировании и исходе заболевания. Понимание иммуногенетической изменчивости необходимо не только для понимания гетерогенности иммунных ответов противоопухолевой системы организма, но также для обеспечения рационального планирования терапии. Цитокины играют решающую роль в повышении и поддержании иммунных ответов против множества патогенов, в том числе опухолей. Генетическая изменчивость генов, кодирующих провоспалительные и противовоспалительные цитокины и хемокины, может привести к изменению функции или количества ассоциированных цитокинов и, следовательно, считается важной детерминантой противоопухолевого иммунитета. Так, было показано, что полиморфный вариант в промоторной области IL1B (c.-511C> T), кодирующего ген бета-интерлейкин-1 (медиатор воспалительного ответа, пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток), связан с риском развития рака шейки матки в корейской, северной индийской, китайской ханьской и египетской популяциях [AkashM.Mehtaet al., 2017].
При изучении полиморфных вариантов генов иммунного ответа было показано, что они могут влиять на регуляторную роль микроРНК. Так, в исследовании Wu D. с коллегами у пациентов с колоректальным раком было продемонстрировано, что некоторые аллели полиморфных вариантов в гене ICOS (inducibleco-stimulatorymolecule) могут влиять на способность микроРНК-21-3p, микроРНК-186-5p, микроРНК -323b-5p, микроРНК-1207-5p, микроРНК-1279, микроРНК-2117 и микроРНК-3692-3p регулировать экспрессию молекул B7/CD28. Было предположено, что rs7628626, rs13505, rs4404254, rs1559931 и rs4675379, нарушая регуляторную роль микроРНК в экспрессии молекул B7/CD28, способствуют возникновению и прогрессированию колоректального рака [Wu D et al., 2015]. При изучении рака желудка было показано, что полиморфизм в 3’UTR гена B7-1 (SNP rs1599795 A> T) приводит к значительно более высокому риску развития заболевания. Данный полиморфный вариант способен ослаблять взаимодействие между микроРНК-361-5p и B7-1, в то же время усиливая связывание микроРНК-132-3p/микроРНК-212-3p и B7-1, что приводит к понижающей регуляции B7-1 и развитию рака [Wu R. et al., 2014].
Полиморфный вариант rs4143815 в 3'-UTR регионе гена PD-L1, одной из ключевых молекул при терапии ИКТИ, способствует избыточной экспрессии и повышенному риску аденокарциномы желудка, в результате нарушения взаимодействия между микроРНК-570 и мРНК PD-L1  [Wang W. et al., 2013].
При раке почки было продемонстрирована связь между полиморфными вариантами интерферона лямбда-3 (IL28B) и прогнозом заболевания. Показано, что носители минорных аллелей имели неблагоприятный ответ на VEGF-терапию, худший прогноз, повышенную экспрессию pAkt (Ser-473) и PD-L1 в первичной опухоли. Эти данные позволяют предположить, что наличие минорных аллелей SNP IFN-lambda3 может быть клинически связано с повышенным опухолевым аэробным гликолизом, иммуносупрессией, устойчивостью опухолей к терапии и плохой выживаемостью пациентов с раком почки [Nukui и др., 2018]. Также, было отмечено, что полиморфный вариант гена CTLA-4 rs231775 обладает потенциалом в качестве прогностического биомаркера. Пациенты с генотипом GG показали повышенную общую выживаемость по сравнению с пациентами с генотипом GA или AA [Liu X. et al., 2018]. Согласно ряду исследований G-аллель CTLA-4 rs231775 связан с уменьшением экспрессии CTLA-4 [Anjos S et al., 2002; Sun T et al., 2008; Ligers A et al., 2001]. В результате снижения экспрессии белка или снижения способности к связыванию, предположительно, G-аллель может быть связан со сниженным ингибированием активированных Т-клеток.
Полиморфные варианты в генах PD-1 и PD-L1 также могут способствовать пониманию различий в иммуносупрессивной функции. Сообщалось, что PD-1 rs10204525 был связан с общей выживаемостью у пациентов с местно-регионарным раком желудка [Sunakawa Y et al., 2017], а также у пациентов с резектабельнымколоректальным раком [Yoon S et al., 2016], что позволяет предположить, что он может служить прогностическим маркером. Сообщалось, что PD-L1 rs4143815 в значительной степени связан с ухудшением общей выживаемости у пациентов с немелкоклеточным раком легкого, перенесших резекцию [Lee SY et al., 2017].
Применение современных иммунотерапевтических препаратов позволяет добиться стойкого клинического ответа у части пациентов с различными злокачественными новообразованиями. Несмотря на впечатляющие результаты, у большинства пациентов отмечается нечувствительность опухолей к препаратам этого класса и дальнейшее прогрессирование опухолевого процесса на фоне проводимого лечения. В связи с этим принципиально важным направлением развития данного типа лекарственной терапии является поиск прогностических и предиктивных маркеров эффективности иммунотерапии, которые смогут позволить выделить подгруппу больных с иммуночувствительными опухолями.
Аллергические заболевания (АЗ) являются одними из наиболее распространенных хронических заболеваний, в основе которых лежит повышенная чувствительность организма к воздействию некоторых факторов внешней среды, которые принимаются им за потенциально опасные. По данным Всемирной организации аллергии, около 30-40% населения мира страдают различными АЗ [http://www.worldallergy.org]. В связи с высокой распространенностью, значительным снижением качества жизни и инвалидизацией пациентов, изучение данных заболеваний входит в число приоритетных направлений. Бронхиальная астма (БА), аллергический ринит (АР) и атопический дерматит (АД) – три распространенных, взаимосвязанных между собой АЗ, часто трансформирующихся из одного в другое и сопутствующих друг другу. Последовательный характер развития этих заболеваний, начиная с АД в детском возрасте и заканчивая более тяжелыми проявлениями аллергии в виде БА и АР у взрослых, в аллергологии принято называть «атопическим маршем». АЗ имеют сложную многофакторную природу, гетерогенность которой проявляется различными фенотипами заболевания у разных людей под действием генетических и эпигенетических факторов постоянно меняющихся условий среды. Данные эпидемиологических исследований позволяют отнести АЗ к синтропиям, предполагая наличие как общих генов, отвечающих за развитие патогенеза, так и генов, специфических для разных групп заболеваний [Фрейдин М.Б., 2010; Sun H.L., et al., 2012; Ziyab A., et al., 2014; Garcia-Aymerich J., et al., 2015; Bellanti J.A., 2019].
С середины 1990-х годов начались многочисленные попытки идентифицировать кандидатные гены, обусловливающие наследственный компонент АЗ. Идентифицировано более 300 генов, функция белковых продуктов которых тесно связана с развитием АЗ [Holloway J.W. et al., 2010; Ortiz R.A. andBarnes K.S., 2015; Willis-Owen S.A.G. et al., 2018]. Проведено более 20 полногеномных анализов сцепления БА, атопии, АР и АД. Выявлены хромосомные области, тесно сцепленные с развитием АЗ, идентифицированы позиционно-клонированные гены для БА и АД [Zhang Y. et al., 2003; Marchet al., 2011; Ortiz R.A. andBarnes K.S., 2015; Willis-Owen S.A.G. et al., 2018].
Значительный прогресс в изучении наследственной природы АЗ связан с исследованием больших выборок в рамках работ международных консорциумов и активным применением современных методов исследований: полногеномного анализа ассоциаций (GWAS), полноэкзомного, полногеномного и таргетного секвенирования с применением NGS-технологии (секвенирования нового поколения), полногеномного исследования профиля экспрессии генов, полногеномного анализа метилирования (EWAS) и др. В Каталоге опубликованных исследований GWAS зарегистрировано более 90 полногеномных анализов ассоциаций БА, около восьми GWAS АР и десяти GWAS АД [http://www.ebi.ac.uk/gwas/].Наиболее статистически значимые ассоциации с БА, неоднократно подтвержденные в исследованиях различных групп авторов на разных выборках, показали полиморфные варианты генов, расположенных в областях 17q12-21 (GSDMB, ORMDL3, GSDMA, IKZF3, ZPBP2), 6p21.32 (HLA-DQA1, HLA-DQ, HLA-DQB1, HLA-DQA2, HLA-DOA, HLA-DRA, HLA-DRB5, HLA-DPB1, PBX2, NOTCH4, C6orf10, BTNL2), 9p24.1 (IL33), 2q12 (IL18R1, IL1RL1, IL1RL2) и 5q22.1 (TSLP). Функционирование большинства из ассоциированных с БА полиморфных локусов связано с иммунным ответом, дифференцировкой Th2 клеток, воспалительными процессами, барьерной функцией эпителия и др. (IL33, IL1RL1, C11orf30, TSLP, CDHR3), воспалительными процессами (IL13, IL6R, DENND1B, LRRC32, IL2RB, IL1RL1) и др. [Ortiz R.A. and Barnes K.S., 2015; Willis-Owen S.A.G. et al., 2018; Ferreira M.A. et al., 2017; Zhu Z. et al., 2018].
Выполнено 8 GWAS аллергического ринита, в которых выявлено более 100 ассоциированных полиморфных вариантов, многие из которых также ассоциированы с другими аллергическими заболеваниями HLA-DQB1, HLA-DQA1 (6p21.32), IL1RL1, IL1RL1 (2q12.1), LRRC32, C11orf30 (11q13.5), GSDMB, ZPBP2 (17q12-21), IL33, RANBP6 (9p24.1), IL13, RAD50 (5q31.1) идр. (http://www.ebi.ac.uk/gwas/, Waage J. et al., 2018). В 10 выполненных к настоящему времени GWAS атопического дерматита обнаружено более 130 ассоциированных полиморфных вариантов, среди которых также часть локусов совпадает с другими аллергическими заболеваниями, в том числе ассоциированные с высоким уровнем значимости полиморфные варианты генов IL18R1 (2q12), HLA-B (6p21.32), FLG (1q21.3) (http://www.ebi.ac.uk/gwas/).
Опубликованы ряд результатов полноэкзомных секвенирований (WES) в семьях с БА [DeWan A.T. et al., 2012], у больных АД афро-американского происхождения [Margolis D.J. et al., 2014] и эфиопских больных с ихтиозом и дерматитом [Taylan F. et al., 2015], в семьях с АД [Won I. Heoet al., 2017; Luo W. et al., 2017].
Проведенные ассоциативные исследования, включая GWAS, показали существование ряда общих (синтропных) генетических факторов риска АЗ, предрасполагающих к развитию различных аллергических заболеваний и сочетанной аллергопатологии, и специфических факторов риска, предрасполагающих к развитию определенных заболеваний. Например, выявленные первоначально при GWAS АД полиморфные локусы области 11q13.5 (c11orf30-LRRC32) [Esparza-Gordilloet al., 2009] оказались также ассоциированными с АР [Ramasamy A. et al., 2011] и БА [Marenholzet al., 2011]. Гены IL13 и RAD50 (11q13.5) ассоциированы с развитием БА и АД [Moffatt M.F. et al., 2010, Weidinger S. et al., 2013], гены GSDMB и ORDML3 (17q21) - с БА и АР [Moffatt M.F. et al., 2007, 2010; Fuertes E. et al., 2015].
В последнее десятилетие во всем мире активно проводятся фармакогенетические исследования АЗ, актуальность которых объясняется наблюдаемой гетерогенностью ответа пациентов на терапию и наличием пациентов с резистентными к терапии тяжелыми формами заболеваний. У значительной части пациентов отмечается недостаточная эффективность контроля симптомов, что приводит к развитию более тяжелых форм и серьезных осложнений. Установлено, что генетическая предрасположенность на 60-80% определяет индивидуальную вариабельность в эффективности терапии пациентов определенной группой препаратов [Isidoro-García M. et al., 2017; Farzan N. et al., 2017]. Фармакогенетические исследования АЗ проводятся как с помощью анализа полиморфных вариантов генов-кандидатов, так и с использованием полногеномных анализов ассоциации (GWAS) и других современных подходов. Большая часть работ посвящена изучению генов, принимающих участие в метаболизме основных групп лекарственных препаратов, применяемых для лечения аллергического воспаления (глюкокортикостероидов, антигистаминных препаратов и др.) [Tantisira K.G. et al., 2004, Sharma S. et al., 2005; Брянцева О.Н. и др. 2006; Klotsman M. et al., 2007; Жданова М.В. и др., 2008; Telleria J.J. et al., 2008; Tantisira K.G. et al. 2009; García-Martín E., 2009; Szczepankiewicz A. et al., 2010; Pietras T. et al., 2011; Hizawa N., 2011; Simon T. et al., 2012; Tsartsali L. et al., 2012, Mougey E.B. et al., 2013; Миронова Ж.А., и др. 2013; Panek M. et al. 2013; Mougey E. et al., 2013; Danielewicz H., 2014; Kmyta V. et al., 2015; Awasthi S. et al., 2015, Raje N. et al., 2015, Keskin O. et al., 2016; Slankard M. et al. 2016; Воропаев Е.В. и др. 2018]. Выполнен ряд эпигенетических исследований терапии АЗ, в результате которых выявлены дифференциально метилированные участки промоторных областей генов, ассоциированные с эффективностью терапии, показана роль модификаций гистонов и микроРНК в формировании терапевтической резистентности к определенным группам препаратов [Li L.B., 2010; McAlees J.W., et al., 2011; Fu A. et al., 2012; Solberg O.D.,2012; Gaffin J. et al. 2014; Wu C., et al. 2014; Xiao C. et al., 2015; Zhu J. et al., 2016; Huo X., 2016; Toraih E.A. et al. 2017; Zhang X. et al.,2017; Миронова Ж.А. и др., 2017; Zhang S. et al., 2018; Yu B. et al., 2019].
Глюкокортикостероиды (ГКС) считаются наиболее эффективными противовоспалительными препаратами для лечения всех аллергопатологий [GINA, 2019]. Противовоспалительный эффект ГКС реализуется путем взаимодействия их с глюкокортикоидными рецепторами, что приводит к изменению экспрессии генов, вовлеченных в воспаление [Farzan N. et al., 2017]. По данным литературы изменение эффективности терапии ГКС у больных АЗ ассоциировано с полиморфными вариантами в генах глюкокортикоидного рецептора NR3C1, рецептора кортикотропин-рилизинг гормона CRHR1 [Isidoro-García M., et al., 2017; Dai Y. Et al., 2018]. В ряде работ установлена роль полиморфных вариантов генов TBX21, WDR21A, eNOS, ORMDL3, HDAC1 и ADRB2 в развитии АЗ и эффективности лечения [Farzan N. et al., 2017]. При GWAS эффективности лечения пациентов с БА обнаружены новые гены, ассоциированные с изменением фармакологического ответа на ГКС – гены глюкокортикоид-индуцированного транскрипта 1 GLCCI1 [Tantisira K.G. et al., 2011], транскрипционного фактора Т ТFT [Tantisira K.G. et al., 2012], гена белка с доменами типа "цинковые пальцы" ZNF432 [Wu A.C. et al., 2014], аллантоиказы (ALLC) [Park T.J. et al., 2014], белка, содержащего лейцин-богатые повторы и F-box домен (FBXL7) [Park H.W. et  al., 2014], миозина 1E (MYOE1) [Wang Y. Et al., 2015], гены аполипопротеина В APOBEC3B и APOBEC3C [Hernandez-Pacheco N, et al. 2019] и др.
Антигистаминные лекарственные препараты являются одними из часто назначаемых для достижения более эффективного контроля аллергических заболеваний, в связи с чем в последние годы активно проводится изучение генов, определяющих эффективность терапевтического ответа пациентов с АЗ на данную группу препаратов. Антигистаминные средства обладают противоотечным, антиспастическим, антихолинергическим, противозудным, антисеротониновым и местноанестезирующим действиями, способны предупреждать бронхоспазм, который вызывают гистамин и гистаминоподобные вещества. Гистамин представляет собой биогенный амин с широкой сферой физиологических функций организма, уровень которого находится под действием ключевых ферментов, участвующих в его метаболизме [Луценко Т.М., 2016]. В организме человека гистамин образуется из аминокислоты L-гистидин в результате ее декарбоксилирования гистидиндекарбоксилазой, которую кодирует ген HDC. Метаболизируется гистамин путем окислительного дезаминирования аминоксидазой 1, кодируемой геном AOC1, и путем метилирования гистамин-N-метилтрансферазой, кодируемой геном HNMT; действие гистамина реализуется через взаимодействие с трансмембранными рецепторами HRH1, HRH2, HRH3 и HRH4 [Кучер А.Н., Черевко Н.А, 2018]. Большое число функциональных исследований обмена гистамина проводится у пациентов с БА и другими аллергическими заболеваниями. Обнаружен значительно более высокий уровень гистамина в бронхах пациентов с БА [Луценко Т.М., 2016, Raje N. et al, 2015]. В ряде исследований установлено, что полиморфные локусы генов, кодирующих белки, участвующие в метаболизме гистамина, играют роль в патогенезе БА и других аллергических заболеваний, определяют терапевтический ответ пациентов на лечение антигистаминными препаратами [Sharma S. et al., 2005; Kennedy M.J. et al., 2008; Garcia-Martin E. et al., 2009; Szczepankiewicz A. et al., 2010; Jones B.L. andKearns G.L., 2011; Simon T. et al., 2012; Raje N. et al., 2015]. При GWAS обнаружены ассоциации полиморфных вариантов, локализованных в генах или вблизи генов гистаминового метаболического пути (PSAP, SCG3, ADCYAP1), с бронхиальной астмой (www.genome.gwas.org).
Активное использование полногеномных, эпигеномных и других современных технологий с целью поиска новых маркеров чувствительности пациентов к использованию определенной группы лекарственных препаратов позволило вывести фармакогенетические исследования АЗ на качественно новый уровень. Однако, каждый из выявленных полиморфных вариантов генов предрасположенности к данным заболеваниям оказывает лишь небольшое влияние, при этом даже суммарное действие множества генов не может быть основной причиной формирования заболевания, подобное явление определяется как феномен «пропущенной наследственности». Для более глубокого понимания вклада генетических факторов в формирование признака следует проводить полигенный анализ с обязательной оценкой межгенных взаимодействий, а также необходимо учитывать влияние эпигенетических факторов [Cookson W., Moffat M., 2011; Ober C., Yao T.C., 2011; Lee J. et al. 2018].
В настоящее время активно изучается влияние эпигенетических процессов на изменение активности генов без изменений в его кодирующей последовательности, в частности при исследовании патогенеза многофакторных заболеваний. Наиболее изучены такие эпигенетические механизмы как метилирование ДНК, модификации гистонов, дифференциальная активность микроРНК, которые позволяют объяснить значительный вклад наследственности в формирование аллергических заболеваний [Menzella F. et al.,2016; Kabesh M., 2016]. Большое число исследований АЗ посвящено изучению роли малых или других некодирующих РНК. МикроРНК (miRNAs) представляют собой группу небольших одноцепочечных некодирующих РНК (около 18-22 нуклеотидов). МикроРНК играют важную роль в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, путем связывания оснований с целевыми РНК-носителями (матричной РНК (мРНК)) для их подавления или деградации, что приводит к общему снижению экспрессии гена, транслируемого с этой мРНК [Carnino J. M., et al., 2018]. В последние годы значимая роль микроРНК также была установлена в развитии многочисленных иммунологических и воспалительных заболеваний, включая аллергические. Rebane A., Akdis C.A. (2014) предположили, что микроРНК способствуют развитию АЗ, участвуя в дисбалансеTh1/Th2 пути, способствуя хроническому воспалению и ремоделированию тканей [Rebane A., Akdis C.A., 2014]. Специфические профили микроРНК были продемонстрированы при БА, АР и АД. Достаточно много исследований указывает на роль микроРНК в развитии заболеваний органов дыхания, в частности БА [Oglesby I.K. et al., 2010; Li L.J. et al., 2011; Qin H.B. et al., 2012; Angulo M. et al., 2012]. Однонуклеотидные полиморфные варианты как в генах микроРНК, так и в их мишенях ассоциированы с АЗ. Полиморфный вариант в гене pre-miR-146a, связанный с уменьшением экспрессии зрелой miR-146a, ассоциирован со сниженным риском БА у китайских и мексиканских пациентов [Su X.W. et al, 2011; Jimenez-Morales S. et al., 2012]. Ассоциация со сниженным риском БА установлена с полиморфными вариантами, расположенными в сайте связывания miR-148/miR-152 в 3'UTR-области гена I класса HLA HLAG, и с ОНП в сайте связывания miR-124 гена интегрина ITGB3 [Tan Z. et al., 2007; Zhang Y. et al., 2013]. Одним из подходов к идентификации микроРНК является оценка их уровня экспрессии, которые дифференцировано экспрессируются в нормальной и пораженной ткани. Оценка профилей экспрессии микроРНК в образцах биопсии тканей человека и клеточных моделях мышей с БА позволила выявить дифференциальную экспрессию ~ 10-20% микроРНК. В группу miRNAs с измененным уровнем экспрессии в легочной ткани вошли let-7c, miR-21, miR-29, miR-135, miR-142, miR-146, miR-150, miR-155, miR-181, miR-193, miR-223, miR-365, miR-375, miR-452 и miR-615 [Sonkoly E.G. et al., 2010; Garbacki N. et al., 2011; Lu S. et al., 2012; Lu T.X. et al., 2012; Vennegaard M.T. et al., 2012; Lacedonia D. et al., 2017]. Установлено, что аллергический ринит характеризуется типичными профилями экспрессии микроРНК. Среди многочисленных кандидатов на биомаркеры АР miR-181a представляется особенно перспективным. Сывороточный уровень этой микроРНК значительно снижен у пациентов с АР, и ее уровень экспрессии отрицательно коррелирует с тяжестью заболевания, уровнями Th2 цитокинов (IL-4, IL-5) и положительно коррелирует с Th1 цитокинами (IL-12, интерфероном γ) [Liu W. et al., 2016b]. Комбинация miR-126-5p, miR-19a-5p и miR-26a-5p могут подтвердить диагноз АР с чувствительностью 90% и специфичностью 70% [Jia M. et al. 2018]. Литературных данных о роли микроРНК в развитии АД меньше. Большинство исследований подтверждают повышенную экспрессию miRNAs (miR-21, miR-146a, miR-203) у больных АД, также как у пациентов с БА и АР [Wu G. et al., 2015]. Другие микроРНК, такие как miR-720, экспрессируются исключительно у больных с АД, возможно, из-за их роли в органоспецифических функциях, таких как регуляция клеточного цикла кератиноцитов [Chikh A. et al., 2011]. Уровень экспрессии miR-483-5p в сыворотке крови детей с АД был также выше, но только у детей с другими сопутствующими атопическими заболеваниями [Lv Y. et al. 2014].
Установлено значительное влияние микроРНК на формирование терапевтического ответа. На мышиной модели БА установлено, что экспрессия miR-146a подавляется при обработке дексаметазоном, коррелирует с общим количеством воспалительных клеток [Feng M.J. et al.,2012]. Выявлена дифференциальная экспрессия 26 микроРНК в ответ на терапию дексаметазоном, в частности, показано значительное увеличение экспрессии mmu-miR-144-3p and mmu-miR-451a в ответ на использование ГКС у мышей с БА [Plank M.W. et al. 2015]. Проведен ряд анализов профиля экспрессии микроРНК у пациентов с БА, в результате которых обнаружена дифференциальная экспрессия 9 микроРНК в ответ на использование ИГКС [Solberg O.D.,2012], выявлен кластер микроРНК, ассоциированный с низкой потребностью в использовании ИГКС [Zhang S. et al., 2018]. Обнаружены значительно более высокие уровни экспрессии miR-21 и miR-126 [Wu C., et al. 2014], miR-1165-3p [Wu C., et al. 2018] у пациентов с БА, не использующих ИГКС по сравнению с группой лечения. Показано значительное повышение уровня miR-181b-5p в плазме пациентов с БА после лечения ИГКС в течение 4 недель [Huo X., 2016]. Проведено несколько исследований роли микроРНК в чувствительности терапевтического ответа на бета-2 агонисты. Генотип rs3746444*GG полиморфного варианта сайта связывания miR-499 был ассоциирован со значительно более низким бронходилататорным ответом после ингаляции бета-2 агонистом сальбутамолом у пациентов с БА из Египта [Toraih E.A. et al. 2017], уровень экспрессии miR-16, мишенью действия которого является ген ADRB2, предлагается в качестве биомаркера, прогнозирующего эффективность ответа на терапию сальметеролом [Yu B. et al., 2019].
Таким образом, микроРНК оказывают несомненное влияние на регуляцию аллергического воспаления. Основной набор miRNAs, участвующих в патогенезе АЗ, включает повышенноэкспрессирующиеся miR-21, miR-223, miR-146a, miR-142-5p, miR-142-3p, miR-146b, miR-155 и пониженно let-7, miR -193b и miR-375. Некоторые отдельные микроРНК могут быть использованы в качестве биомаркеров аллергических заболеваний. Другим аспектом является возможное терапевтическое применение. Применение микроРНК в качестве биомаркеров должно быть изучено с акцентом на возможное определение эндотипов и фенотипов аллергических заболеваний. Учитывая сложные взаимосвязи между микроРНК и генами-мишенями, регулируемыми многочисленными микроРНК, эта область требует дальнейшего изучения.
Основной особенностью эпигенетических механизмов является их обратимость, которая определяет перспективность их использования для разработки инновационных средств лечения БА и других аллергических заболеваний. В настоящее время именно исследование эпигенетических факторов, определяющих риск развития аллергических заболеваний и чувствительность пациентов к рекомендуемой терапии, являются чрезвычайно актуальными.
Таким образом, несмотря на многочисленность проводимых генетических и эпигенетических исследований онкологических и аллергических заболеваний, остается множество нерешенных вопросов, исследование которых требует комплексного и разностороннего подхода.
Анализ опубликованных литературных данных подтверждает соответствие запланированного исследования мировому уровню и отсутствие прямых аналогов работы. Ожидаемые результаты исследования характеризуются высокой степенью новизны и практичностью реализации предлагаемых подходов для достижения цели работы.

4.3.7.6. Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта.
Подходы к решению задач проекта, направленных на изучение онкологических и аллергических заболеваний, определены последними достижениями науки в области генетики, молекулярной биологии, онкологии, основаны на современных знаниях об этиопатогенезе рака почки, рака молочной железы, рака яичников, бронхиальной астмы, атопического дерматита и аллергического ринита.
Экспериментальная работа будет проводиться с использованием передовых технологий анализа генома, адекватного выбора объекта исследования. Анализ будет выполнен в группах сравнения «случай-контроль» с оценкой ассоциации заболеваний с отдельными полиморфными вариантами и мутациями генов.
В настоящее исследование будут включены пациенты со светлоклеточным раком почки (300 человек), получающих терапию ингибиторами контрольных точек иммунитета и по-разному реагирующих на проводимое лечение. Кроме того, в качестве группы сравнения в исследование будут также включены здоровые индивиды (300 человек), первостепенные родственники которых не имели онкологических заболеваний. Критериями включения пациентов в исследование будут гистологически верифицированный диагноз «светлоклеточный рак почки», наличие метастазов и назначение препаратов ИКТИ. Критерии исключения – карциномы почек других гистологических типов, наличие других злокачественных новообразований в семейном анамнезе, инфекции мочеполовых путей, мочекаменная болезнь. Забор биологических образцов пациентов с раком почки будет произведен сотрудниками кафедры урологии клиники БашГМУ. От каждого участника исследования будет получено информированное согласие. Все образцы будут охарактеризованы по гистологическому типу опухоли, TNM-классификации и стадии заболевания.
Исследование рака молочной железы и рака яичников будет выполнено на сформированной группе пациенток с РМЖ (800 человек), пациенток с РЯ (250 человек) и здоровых женщин (800 человек). Забор биологического материала проведен на базе Клинического онкологического диспансера Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан (г. Уфа) за период 2007-2014 гг. Участники исследования дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований. При сборе и обработке материала использовались клинические и лабораторные методы исследования. В ходе исследования уточнялись данные об этнической принадлежности больных путем опроса и определения национальности родителей в трех поколениях. Средний возраст манифестации заболевания РМЖ у пациенток составил 52 года. При анкетировании было установлено, что у 10% больных РМЖ отягощенный семейный анамнез. Около 90% женщин с РМЖ из нашей выборки принадлежат к трем основным этническим группам, проживающим в Республике Башкортостан, - русской, башкирской и татарской - 47%, 13%, 26% соответственно. Возраст пациенток с РЯ варьировал от 17 до 80 лет (52,2 ± 7,4 года). В 8.8% случаев у женщин с РЯ выявлены семейные случаи заболевания РМЖ или РЯ. По этническому составу группа больных раком яичников не однородна и представлена русскими –49%, татарами – 28%, украинцами - 6%, башкирами - 6% и др.
В работе будет использована репрезентативная выборка больных аллергическими заболеваниями (БА, АР и АД), в возрасте от 2 до 67 лет (900 человек). Обследованные являются пациентами детского отделения Клиники ФГБОУ ВО «Башкирского государственного медицинского университета» Минздрава России, пульмонологического и аллергологического отделений ГБУЗ РБ «Городской клинической больницы № 21» г. Уфы, аллергологического отделения ГБУЗ «Республиканской детской клинической больницы» г. Уфы. Диагноз заболеваний устанавливался квалифицированными врачами в соответствии с критериями программных документов по диагностике, лечению и профилактике заболеваний. Выборка больных будет подразделена на группы в зависимости от наличия и сочетания различных АЗ: 1. общая выборка больных АЗ; 2. больные с клиническими проявлениями только БА (без АР и АД); 3. больные АР (без БА и АД); 4. больные АД (без БА и АР); 5. больные с сочетанными клиническими проявлениями БА, АР и АД; 6.больные БА и АД (без проявлений АР); 7. больные БА и АР (без АД); 8. больные АР и АД (без БА). Критериями включения больных в исследуемую группу является установленный диагноз и проведение терапии глюкокортикостероидными и антигистаминными препаратами не менее 3 месяцев. В качестве контроля будет исследована группа, состоящая из 589 практически здоровых лиц от 2 до 66 лет, не имеющих проявлений АЗ и отягощенной наследственности по атопическим заболеваниям. Все участники исследования или их родители (у индивидов детского возраста) дали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований.
Выделение ДНК пациентов и индивидов контрольной группы проводиться методом фенол-хлороформной экстракции. Качество препаратов ДНК оценивается по соотношению оптических плотностей А260/A280 с использование спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, USA).
Поиск генов, ответственных за развитие различных форм РМЖ и РЯ, будет основан на проведении геномного анализа (анализ нуклеотидных замен, структурных вариаций кодирующей части генома, мета-анализов GWAS и TWAS) c использованием технологии NGS (секвенирование следующего поколения). В частности, при РМЖ и РЯ будет проведен мета-анализ данных по экспрессии генов (TWAS) и мета-анализ GWAS с учетом различных типов заболевания (ER + и ER-) с целью идентификации общих и специфических генов, задействованных в развитии заболеваний.
Для понимания того, являются ли полиморфные участки в генах биогенеза микроРНК, предшественников микроРНК или сайтах их связывания с мишенью факторами, участвующими в формировании индивидуальной предрасположенности к развитию и течению аллергических и онкологических заболеваний, будет проведено изучение биологической роли микроРНК в патогенезе этих заболеваний. Будет выполнено исследование ~ 30 полиморфных вариантов генов биогенеза и предшественников микроРНК, для которых обнаружена связь с АЗ по данным зарубежных авторов (miR-196a2, miR-146a, miR-499 (Trinh H.K.T. et al., 2017); miR-148a, miR-148b, miR-152 (HLA-G, Tan Z. et al., 2007); miR-149 (Hu D. et al., 2017) и др.), а также будет проведен подбор и последующее исследование полиморфных вариантов в сайтах связывания генов микроРНК, мишенями которых, согласно базам данных, являются мРНК изученных в проекте генов. На основании изучения литературных данных и работы с биоинформатическими ресурсами будет также проведен выбор ~ 30 полиморфных локусов, расположенных в генах микроРНК, участников биосинтеза и процессинга микроРНК или сайтах связывания микроРНК с мишенью, которые вовлечены в патогенез онкологических заболеваний.
Выбор полиморфных вариантов в генах микроРНК будет проведен с использованием базы данных Национального центра биотехнологических информаций (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ensembl Genome Browser (www.ensembl.org), полиморфизма сайта связывания микроРНК (http://compbio.uthsc.edu/miRSNP/miRSNP_detail_all.php).
Для идентификации генетических маркеров развития и эффективности терапии аллергических заболеваний будет проведен отбор и генотипирование ~ 30 полиморфных локусов, отобранных по результатам своих предыдущих работ, а также ассоциированных с АЗ по данным анализов генов-кандидатов и полногеномных исследований, выполненных в различных популяциях мира, включая гены, вовлеченные в ответ на терапию АЗ глюкокортикостероидными (GR, CRHR1, GLCCI1, T (TFT), ZNF432, ALLC, FBXL7, CMTR1, MAGI2) и антигистаминными препаратами (AOC1, HNMT, MAOB, ALDH7A1, HRH1, HRH2, HRH3, HRH4) и др., у больных БА, АР, АД и сочетанной аллергопатологией.
Для определения генетических маркеров риска развития и эффективности терапии рака почки будет выполнено генотипирование ~ 30 полиморфных вариантов генов про- и анти-воспалительных цитокинов (TNFA, IL1B, IL10 и др.), хемокинов (CXCL12 (SDF-1)), рецепторов, компонентов аппарата процессинга антигенов (ERAP1, LMP7, TAP1 и др.), микроРНК (miR-146a, miR-196a2, miR-499 и др.) и др. полиморфных локусов, которые будут отобраны при формировании панелей для генотипирования на основании тщательного анализа данных литературных источников и биоинформатических баз.
Анализ однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP) будет выполнен методом генотипирования с последующим анализом ассоциации с использованием системы для ПЦР в реальном времени OpenArray®Real-Time PCR System (QuantStudio™ 12K Flex Real-Time PCR System, Applied Biosystems, США) и ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией (FLASH/RTAS). OpenArray Real-Time PCR System представляет собой уникальную платформу для проведения реакции в нанолитровых объемах. Реакционная смесь (TaqMan® OpenArray® Genotyping Master Mix, Applied Biosystems, USA) объемом 3 μl смешивается с 3 μl образцов ДНК (необходимая концентрация 50 нг) в 384-луночном планшете. Метод дискриминации аллелей Quant Studio™12K FlexReal-Time PCR предполагает использование металлических планшетов (чипов), в которые полученная смесь, затем переносится. В данном исследовании предполагается использовать чипы, рассчитанные на одновременную детекцию 60-ти однонуклеотидных полиморфных вариантов в образце ДНК. Предварительно, в каждой лунке слайда находятся меченные красителями VIC и FAM олигонуклеотидные зонды с возможностью единовременного анализа 60-ти полиморфных вариантов генов. Уровень сигнала от каждой лунки, оценка флуоресцентного изображения проводится по окончании проведения ПЦР в реальном времени с использованием системы графического интерфейса QuantStudio™ 12K Flex Instrument touch screen. Анализ полученных результатов генотипирования образцов ДНК осуществляется с использованием программного обеспечения QuantStudio™ 12K FlexSoftware.
Cтатистическая обработка результатов исследования будет проводиться с использованием пакета программ статистического анализа STATISTICA v.6.0[StatSoft], BIOSTAT [Гланц С.C., 1999], SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm), PLINK 1.07 (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/ index.shtml), а также с применением программного обеспечения Microsoft Exсel.
Степень ассоциаций будет оценена в значениях показателя отношения шансов odds ratio (OR). При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в группах больных и здоровых лиц будет использован критерий χ2 (Р) для таблиц сопряженности 2х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Различия при статистическом критерии p<0,05 будут оцениваться как значимые. Поправку на множественное тестирование будет проведена с помощью метода оценки доли ложно-положительных результатов FDR (False Discovery Rate) (Benjiamini &Hochberg), предусмотренного пакетом программы PLINK 1.07. На основании результатов моделирования с использованием программ MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction) [Ritchie et al., 2001] и GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) [Lou et al, 2007; Chen et al, 2011] будет проведен анализ межгенных взаимодействий.

Общий план работы на весь срок выполнения проекта
1.    Провести поиск генетических маркеров риска развития рака молочной железы и рака яичников, а также специфических маркеров различных типов данных заболеваний на основе данных полногеномных исследований.
2. Провести исследование 60-ти полиморфных локусов, расположенных в генах предшественников микроРНК, участников биосинтеза и процессинга микроРНК или сайтах связывания микроРНК с мишенями, в группах больных с онкологическими, аллергическими заболеваниями и в соответствующих группах контроля.
3. Провести исследование 60-ти полиморфных локусов, ассоциированных с онкологическими и аллергическими заболеваниями по данным кандидатных и полногеномных исследований, а также участвующих в метаболизме применяемых для лечения данной патологии лекарственных препаратов, в группах больных с онкологическими, аллергическими заболеваниями и в соответствующих группах контроля.
4. Провести анализ ассоциации прогенотипированных полиморфных локусов генов с развитием и течением онкологических и аллергических заболеваний с учетом этнической принадлежности индивидов, степени тяжести заболеваний, эффективности проводимой терапи; анализ межгенных взаимодействий.
5. Идентифицировать генетические и эпигенетические маркеры риска развития и эффективности терапии онкологических и аллергических заболеваний.
6. Представить результаты проекта на российских и зарубежных конференциях, опубликовать статьи в рецензируемых журналах.

Таким образом, в рамках данного проекта нами впервые предлагается проведение комплексного исследования вклада генетических и эпигенетических факторов в развитие, течение и эффективность терапии онкологических и аллергических заболеваний у индивидов различной этнической принадлежности.

4.3.7.7. Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту (в данном пункте заполняется текстовое описание задела, а размещение прочей подтверждающей информации описано в п. 4.3.19).
Лаборатория молекулярной генетики человека на протяжении многих лет сотрудничает с кафедрой онкологии БГМУ и Республиканским клиническим онкологическим диспансером Минздрава РБ и проводит изучение молекулярно-генетических основ развития ряда онкологических заболеваний. В настоящее время лаборатория располагает банком ДНК больных различными онкологическими заболеваниями, в т.ч. раком молочной железы, яичников, почки (n=2000) и контрольной группы (2000). С информированного согласия у одного и того же пациента забирается кровь и парные образцы тканей (норма/опухоль). Все пациенты, ДНК которых имеется в коллекции лаборатории, хорошо охарактеризованы клинически врачами-онкологами, гистологами.  В лаборатории у пациентов с различными онкологическими заболеваниями проводится поиск мутаций в генах, являющихся важными участниками общих сигнальных путей, контролирующих целостность генома, клеточный цикл, апоптоз и дифференцировку клеток.
В результате молекулярно-генетических исследований рака молочной железы и яичников получены интересные результаты. Так, анализ спектра и частоты мутаций в генах BRCA1, BRCA2, CHEK2, NBN, АТМ, PALB2, BLM у больных раком молочной железы и раком яичников из Республики Башкортостан показал, что мутация 5382insC в гене BRCA1 наиболее часто встречается среди изученных мутаций, ассоциированных с высоким риском развития злокачественных новообразований у женщин Республики Башкортостан. У пациенток с РЯ также выявлены мутации в гене СНЕК2 (dele9,10(5kb)), в гене PALB2 (c.172_175delTTTG) [Бермишева, 2014]. Проводится изучение новых генов кандидатов, ассоциированных с онкологическими заболеваниями. Например, установлено, что мутация ERCC4*p.Arg799Trp не связана с высоким риском развития РМЖ и РЯ у женщин нашего региона (Бермишева, 2020). Также продемонстрировано, что вариант WRN*p.R1406X не является патогенным для развития РЯ и РМЖ [Бермишева, 2019]. Доказано, что распространенный вариант c.1047-2A> G гена CDK12 в популяции татар и башкир не является клинически значимым при наследственном РМЖ [Bogdanova, 2019]. Интересным направлением в исследованиях онкологических заболеваний стало изучение роли микроРНК в развитии опухолей. Анализ полиморфных вариантов в генах DROSHA / RNASEN, DGCR8, DICER1, XPO5, RAN, PIWIL1 / HIWI, AGO1 / EIF2C1, AGO2, GEMIN4, GEMIN3 / DDX20, DDX5, принимающих участие в процессинге микроРНК, на выборке 778 человек (417 пациенток с раком молочной железы и 361 здоровых женщин), показал, что полиморфные локусы rs11060845 и rs10773771 в гене PIWIL1, rs3809142 / RAN, rs10719 / DROSHA, rs1640299 / DGCR8, rs563002 / DDX20, rs595055 / AGO1 и rs2740348 / GEMIN4 ассоциированы с развитием рака молочной железы у женщин русской этнической принадлежности [Бермишева, 2018].
В результате исследований, проводимых в рамках консорциума по изучению РМЖ и РЯ (ВСАС, ОСАС), выявлены ключевые механизмы, лежащие в основе этих заболеваний. Идентифицированы новые полиморфные варианты, ассоциированные с риском развития опухолей молочных желез, яичников, а также генетические локусы, специфичные для подтипов РМЖ. Большинство вариантов расположены не в генах, а в тех регионах, которые регулируют активность генов (Mavaddat N, 2019, Michailidou K, 2017, Milne R, 2017, Phelan C, 2017).
Изучение молекулярно-генетических основ развития светлоклеточного рака почки проводится в лаборатории с 2010 года. За этот период был проведен поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене фон Хиппеля-Линдау (VHL), полибромо-1 (PBRM1) у больных со светлоклеточным раком почки (СРП). Мутации в гене VHL обнаружены в 21,9% (23/105) случаев первичных опухолей почки, в гене PBRM1 - в 18% случаев. Впервые идентифицированы одиннадцать соматических мутаций, не описанных в литературе ранее и не зарегистрированных в базах данных [Гилязова И.Р., 2013]. Кроме того, авторским коллективом проведен анализ аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста фон Хиппеля-Линдау (VHL), гена Ras-ассоциированого белка семейства 1 (RASSF1) и гена ломкой гистидиновой триады (FHIT) с помощью STR-маркеров в 110 парных образцах ДНК из опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхимы. Частота потери гетерозиготности по двум исследованным локусам для гена VHL составила 32,7% случаев информативных образцов, для гена RASSF1 и FHIT – 32 и 30% случаев информативных образцов, соответственно. Более того, нами выявлены ассоциации аллельных делеций в гене FHIT с размером опухоли [Кутлыева с соавт, 2012]. Потеря гетерозиготности в гене FHIT ассоциирована с минимальным размером опухоли и начальной стадией заболевания, что свидетельствует о ранней инактивации гена FHIT. Также был проведен анализ аберрантного метилирования CpG-островков промоторной области гена VHL. Аберрантное метилирование определено только в образцах опухолевой ткани и не выявлено в нормальной почечной паренхиме. Частота аберрантного метилирования составила 3,8% в первичных опухолях почки пациентов со СРП. Аналогичный анализ был проведен для гена ингибитора циклин-зависимой киназы CDKN2A, кодирующего белок p16. Аберрантное метилирование определено только в образцах опухолевой ткани и не выявлено в нормальной почечной паренхиме. Частота промоторного метилирования данного гена в первичных опухолях составила 20,9%. В нашем исследовании обнаружена биаллельная инактивация гена VHL в 30,4% (7/23) случаев. Результаты проведенного нами анализа биаллельной инактивации гена VHL свидетельствуют о его важной роли в возникновении и развитии светлоклеточного рака почки [Гилязова И., 2012; Кутлыева Л., 2012].
Кроме того, к настоящему времени проведен анализ экспрессии 758 зрелых микроРНК с помощью технологии OpenArray использованием QuantStudio 12K FlexReal-Time PCR System обнаружена повышенная экспрессия микроРНК-210 и микроРНК-642 в образцах опухолей почки по сравнению с нормальной тканью. Для оценки вовлеченности метилирования CpG-островков, перекрывающих промоторные участки генов микроРНК в патогенез рака почки, проведен анализ метилирования 22 генов микроРНК в опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхиме пациентов со светлоклеточным раком почки с помощью технологии EpiTectMethyl II PCR Array (Qiagen). В результате анализа было выявлено два гена и два кластера микроРНК со статистически значимыми изменениями уровней метилирования: let-7g, микроРНК-301а, кластер микроРНК-23b/-24-1/-27b и кластер микроРНК-30с-1/-30е. Последующий анализ экспрессии генов микроРНК с дифференциальным метилированием установил статистически значимое повышение уровня экспрессии микроРНК-301a, микроРНК-23b в опухолях почки у пациентов с раком почки по сравнению с нормальной почечной паренхимой. Обнаружен статистически значимо низкий уровень экспрессии let-7g в опухолях почки по сравнению с прилежащей нормальной тканью [Климентова с соавт., 2019].
Анализ экспрессии семейства микроРНК-200 (microRNA-200a, microRNA-200b, microRNA-200c, microRNA-141 и microRNA-429)  при метастатическом раке почки показал значительное снижение экспрессии микроРНК-200с в опухолях почки по сравнению с нормальной тканью [Gilyazova et al., 2019].
Кроме того, коллектив лаборатории проводит изучение молекулярно-генетических основ других онкологических заболеваний. С 2010 авторский коллектив входит в состав международного консорциума по изучению рака молочной железы (BCAC) и рака яичников (OCAC). В рамках проведения совместных исследований с консорциумом BCAC определены потенциальные гены кандидаты MAP3K1, SLC4A7, STXBP4, TGFb1, PIK3CA, LSP1 и др., ассоциированные с заболеванием [Milne R, 2011; Ghoussaini M, 2012; Dörk T. et al., 2019], выявлены новые локусы, связанные с разными гистологическими типами эпителиального рака яичников [Phelan C. et al., 2017].
Исследования аллергических заболеваний (бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита) проводятся коллективом лаборатории молекулярной генетики человека совместно с сотрудниками кафедры детских болезней и кафедры пропедевтики внутренних болезней Башкирского государственного медицинского университета (БГМУ) с 1999 г. Сформированы репрезентативные выборки ДНК больных БА, АР, АД (около 900 человек) и контрольной группы практически здоровых индивидов (600 человек), соответствующие друг другу по полу, возрасту и этнической принадлежности. Частично набрана выборка пациентов с семейными случаями бронхиальной астмы. Частично сформирован банк РНК, выделенной из периферической крови больных БА, АР и здоровых индивидов (20 человек, соответственно). У русских, татар и башкир, проживающих в Республике Башкортостан, определены генетические маркеры риска развития атопического дерматита, бронхиальной астмы и аллергического ринита по полиморфным вариантам генов цитокинов (IL4, IL4RA, IL9, IL10, IL13, CCL11, TNFA) и генов детоксикации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, GSTM1, GSTT1, NAT2) [Карунас А.С. и др., 2004, 2007; 2012; Хуснутдинова Э.К., Карунас А.С., 2007; Рамазанова Н.Н. и др., 2007, Федорова Ю.Ю. и др., 2009, 2010, 2011]. Во всех этнических группах обнаружено сходство маркеров риска развития АЗ верхних и нижних дыхательных путей – аллергического ринита, бронхиальной астмы и их сочетанного проявления. Выявлено, что наиболее важным маркером риска развития атопического дерматита и других АЗ на фоне АД являются мутации в гене филаггрина FLG [Карунас А.С. и др., 2012]. При исследовании 64 полиморфных локусов генов образ-распознающих рецепторов установлена ассоциация АД с полиморфными вариантами генов Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR6 и TLR10) [Гималова и др., 2014]. В рамках интегрированного проекта Шестой рамочной программы Евросоюза GABRIEL проведен полногеномный анализ ассоциации 610000 полиморфных локусов, рассеянных по всему геному, с развитием бронхиальной астмы у индивидов русской, татарской и башкирской этнической принадлежности. Идентифицированы полиморфные локусы, ассоциированные с развитием БА с полногеномным уровнем значимости (p<4,79x10-7) и локализованные в области 17q12-q21 [Карунас А.С., 2011]. Впервые обнаружена выраженная ассоциация БА с полиморфными локусами гена бета1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1 (в области 9р13) и гена IGFBP3, кодирующего белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста (в области 7р12.3) [Карунас А.С., Хуснутдинова Э.К., 2013]. При полногеномном анализе ассоциации и репликативном исследовании на независимой выборке индивидов, проведенным в отдельных этнических группах, выявлены этноспецифические маркеры риска развития БА у русских (MUC19 (12q12) и KIAA1671 (22q11.23), татар (RAPGEF4 (2q31.1), rs12719740 (15q26.3) и rs10435941 (9q21.2)) и башкир (GRIA1 (5q33.2), rs12719740 (15q26.3), DACT2 (6q27)) [Карунас А.С., Хуснутдинова Э.К., 2013; Карунас А.С. и др., 2015].
В рамках фармакогенетического исследования БА проведен анализ полиморфных вариантов гена бета2-адренорецептора ADRB2, глюкокортикостероидного рецептора GR, рецептора кортикотропин-рилизинг гормона CRHR1 и транскрипционного фактора TBX21 у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов, проживающих на территории Республики Башкортостан. Установлены маркеры повышенного риска развития БА, ее тяжелой формы, неконтролируемого и частично-контролируемого течения заболевания со снижением параметров спирографии (ФЖЕЛ, ОФВ1, МОС25, МОС50, МОС75) [Мурзина Р.Р., 2015; Федорова Ю.Ю., Карунас А.С. и др., 2016]. При изучении полиморфных вариантов генов, участвующих в метаболизме широко применяемых противоастматических препаратов – глюкокортикостероидов (GLCCI1, T (TFT), ZNF432, ALLC, FBXL7, CMTR1, MAGI2) и антилейкотриеновых препаратов (ALOX5, ALOX5AP, LTA4H, LTC4S, SLCO2B1) показана роль полиморфных вариантов генов GLCCl1, FBXL7, MAGI2, T (TFT), ALLC, LTA4H, ALOX5AP и LTC4S в развитии и течении бронхиальной астмы на фоне терапии глюкокортикостероидными и антилейкотриеновыми препаратами [Федорова Ю.Ю., Карунас А.С. и др., 2019].
Результаты исследований опубликованы в рецензируемых российских и зарубежных журналах, доложены на российских и международных конференциях. Разработаны 2 патента по прогнозированию риска развития БА. (Карунас А.С., Шалухина А.Р., Загидуллин Ш.З., Исламгулов Д.В., Хуснутдинова Э.К. Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы. Патент на изобретение № 2324937. Приоритет изобретения 27.11.2006; Хуснутдинова Э.К., Карунас А.С., Федорова Ю.Ю. Нургалиева А.Х., Юнусбаев Б.Б. Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы. Патент на изобретение № 2510508. Приоритет изобретения 13.07.2012).
В настоящее время в ИБГ УФИЦ РАН собран уникальный комплекс приборов и оборудования, позволяющий решать самые сложные научно-исследовательские проблемы и задачи. Институт располагает следующим современным оборудованием, необходимым для выполнения запланированных в данном проекте работ: автоматический секвенатор ДНК модели ABI Prism 3500 (AppliedBiosystems, США); спектрофотометр NanoDrop 1000 (ThermoScientific, США), амплификаторы «MastercyclerClassic» (Eppendorf, Германия), T100 (Bio-Rad, США), система получения ультрачистой воды Milli Q Academic (Millipore, США), рефрижераторная центрифуга Multifuge 1S-R (ThermoScientificHeraeusMultifuge), рефрижераторная микроцентрифуга 5415R (Eppendorf, Германия), микроцентрифугиMiniSpinPlus (Eppendorf, Германия), персональные вортексы V-1 plus (Biosan, Латвия), источники питания Эльф-4, Эльф-8 (ДНК-Технология, Россия) и PowerPackBasic (BioRad, США), камеры для электрофореза Mini-ProteanTetraCell (BioRad, США), VE-20, SE-1 и SE2 (Хеликон, Россия), ламинарные боксы БАВнп-01-«Ламинар-С»-1,2 (Миас, Россия), весы электронные OHAUSAdventurer (Китай), автоклав MelagEuroklav 23 VS (Германия), твердотельные термостаты «Гном» (ДНК-технология, Россия) и «Термит» (ДНК-технология, Россия), магнитная мешалка MSH-300 (Biosan, Латвия), термостат ТС-40 (Россия), ротатормиксер программируемый (Multi RS-60), низкотемпературные холодильники -85C моделей MDF190, MDF-192 и MDF 32UVL (Sanyo, Япония), SpeedVac концентратор (Savant, США), системы гельдокументированияGelDoc XR (BioRad, США) и DocPrint 001.FDC (VilberLourmat, Франция), локальная сеть вычислительных и обрабатывающих компьютеров.
Коллектив проекта обладает большим опытом работы в области молекулярно-генетических исследований онкологических заболеваний и владеет всеми методами молекулярно-биологического анализа, в том числе имеет опыт проведения экспрессии микроРНК с помощью технологии OpenArray использованием системы QuantStudio 12K FlexReal-Time PCR System, опыт проведения секвенирования экзома с  последующей биоинформатической обработкой данных. Высокая квалификация членов коллектива подтверждается наличием публикаций в ведущих научных журналах.

4.3.7.8. Детальный план работы на первый год выполнения проекта.
1.    Провести поиск генетических маркеров риска развития рака молочной железы и рака яичников, а также специфических маркеров различных типов данных заболеваний на основе данных полногеномных исследований.
2.    Сформировать панель, содержащую ~60 полиморфных локусов, расположенных в генах предшественников микроРНК, участников биосинтеза и процессинга микроРНК или сайтах связывания микроРНК с мишенью;
3.    Провести генотипирование полиморфных вариантов с использованием системы QuantStudio ™ 12K Flex (AppliedBiosystems) у пациентов с онкологическими и аллергическими заболеваниями.

Короткий заголовокGZ-2020
АкронимМ1_2020 - 1
СтатусАктивный
Действительная дата начала/окончания22/06/2031/12/20

Ключевые слова

  • онкологические заболевания
  • аллергические заболевания
  • генетические факторы
  • терапия
  • фармакогенетика
  • эпигенетика