Оксид азота (II) в биологии эукариотических фотосинтезирующих микроорганизмов: механизмы регуляции внутриклеточных уровней и NO-контролируемые сигнальные пути в условиях стресса: 2021 г. этап 1

Полученные в 2021 году результаты позволили нам впервые экспериментально доказать, что уникальная одноклеточная водоросль Polytomella parva, утратившая хлоропластный геном и способность к фотосинтезу, не использует нитрит-зависимые механизмы (нитратредуктазу, NO-формирующую нитритредуктазу, компоненты ЭТЦ) в генерировании оксида азота (NO). Кроме того, путресцин, который синтезируется в клетках P. parva, также не является субстратом для генерирования NO. По нашим данным клетки нефотосинтезирующей водоросли генерируют оксид азот по окислительному пути из аргинина. В процессе эволюции у P. parva параллельно с утратой способности к транспорту/ассимиляции нитратов/нитритов и как результат - к нитрит-зависимому механизму генерирования NO появился функциональный аналог NO-синтаз животных, который катализирует формирование оксида азота из аргинина. Установлено, что при солевом стрессе происходит аргинин-зависимое генерирование NO, который используется клетками P. parva для нитрозилирования белков. Полученные данные показывают, что стратегия использования NO у P. parva сходна с той, что была описана ранее у Chlamydomonas и ряда высших растений, хотя механизм его формирования, по-видимому, уникален. В работе 2021 года проведено клонирование гена, кодирующего единственный усеченный гемоглобин P. parva дальнейший анализ которого позволит установить, вовлечен ли он в процессы детоксикации NO.
Впервые изучены механизмы контроля внутриклеточных уровней оксида азота в клетках Chlamydomonas reinhardtii, голодающих по фосфору, и доказано, что нитрит-независимый (окислительный) и полиамин-зависимый пути не вовлечены в формирования NO. Кроме того, система нитратредуктаза-NO-формирующая нитритредуктаза также не является ключевым компонентом для генерирования NO в анализируемых условиях. Предполагается роль альтернативной оксидазы 1 в формировании NO, увеличение экспрессии и активности которой было впервые установлено в клетках водоросли в условиях дефицита фосфора (Alqoubaili et al., 2021).
Охарактеризованы ключевые белки, которые вовлечены в «тонкую настройку» результирующего ответа (уровней внутриклеточного оксида азота) при различном содержании в среде доступного фосфора и в отсутствии света. Впервые показано, что усеченный гемоглобин 2, обладающий NO-диоксигеназной активностью, используется клетками C. reinhardtii для оптимизации передачи NO-зависимых сигналов и адаптивных реакций в ответ на голодание по фосфору (Grinko et al., 2021). Второй компонент, цитохром P450, снижающий уровни оксида азота путем формирования из него N2O, играет ключевую роль в контроле внутриклеточных уровней NO в клетках C. reinhardtii в условиях темноты (Zalutskaya et al., 2021).

1. Впервые установлено, что уникальная одноклеточная водоросль P. parva, утратившая хлоропластный геном и способность к фотосинтезу, формирует оксид азота по окислительному пути, а нитрит-зависимые механизмы (нитратредуктаза, компоненты ЭТЦ) не вовлечены в генерирование NO.
Полученные данные показывают, что клетки нефотосинтезирующей водоросли используют функциональный аналог NO-синтаз животных и Ostreococcus tauri, который катализирует формирование оксида азота из аргинина.
Путресцин синтезируется в клетках P. parva, однако не является субстратом для генерирования оксида азота.
P. parva генерирует NO в условиях солевого стресса и по нашим данным использует этот процесс для посттрансляционной модификации ряда белков путем нитрозилирования.
Т.о., в процессе эволюции у P. parva, по-видимому, параллельно с утратой способности к транспорту/ассимиляции нитратов/нитритов и как результат - к нитрит-зависимому механизму генерирования NO появился функциональный аналог NO-синтаз животных, который катализирует формирование оксида азота из аргинина. Установлено, что при солевом стрессе происходит генерирование NO, который используется клетками для нитрозилирования белков. Данные показывают, что стратегия использования NO сходна с той, что была описана ранее у Chlamydomonas и ряда высших растений, хотя механизм его формирования, по-видимому, уникален.

2. Осуществлено клонирование гена ТНВ, кодирующего усеченный гемоглобин Polytomella parva, в плазмиды pET15b и pASK-IBA3 с помощью реакции Гибсона и получены вектора для последующей экспрессии и очистки белка.
3. Впервые изучены механизмы контроля внутриклеточных уровней оксида азота в клетках C. reinhardtii, голодающих по фосфору, и доказано, что нитрит-независимый (окислительный) и полиамин-зависимый пути не вовлечены в формирования NO. Кроме того, система нитратредуктаза-NO-формирующая нитритредуктаза также не является ключевым механизмом генерирования NO в анализируемых условиях. Предполагается роль альтернативной оксидазы 1, увеличение экспрессии и активности которой было впервые установлено в клетках в условиях дефицита фосфора (Alqoubaili et al., 2021).
Впервые проанализирована роль усеченного гемоглобина 2 и установлено, что ТНВ2 используется клетками C. reinhardtii для оптимизации передачи NO-зависимых сигналов и адаптивных реакций в ответ на голодание по фосфору (Grinko et al., 2021).
Впервые доказана ключевая роль цитохрома P450 в контроле внутриклеточных уровней NO в клетках Chlamydomonas в условиях темноты (Zalutskaya et al., 2021).
4. Отработана методика трансформации Ostreococcus tauri, и из трансформантов, устойчивых к ампициллину и канамицину, и демонстрирующих люциферазную активность отобран штамм с нарушенной экспрессией гена, кодирующего нитратредуктазу.

Ермилова Е.В., профессор, 40%
Залуцкая Ж.М., с.н.с. 12%
Лапина Т.В., н.с. 12%
Пузанский Р.К., н.с. 7%
Алкубайли Р., инженер-исследователь 10%
Власова В.А., лаборант-исследователь 7%
Статинов В.Р., лаборант-исслелователь 5%
Леко Н.С., лаборант-исследователь 6%

не разрещается

не разрешается