Невирусные средства доставки генетических конструкций на основе синтетической хромосомы человека в клетки млекопитающих: 2020 г. этап 1

Проект: исполнение гранта/договораисполнение этапа гранта/договора

Сведения о проекте

описание

Научная проблема, на решение которой направлен проект:


Данный проект нацелен на разработку и создание новых генотерапевтических конструкций на основе ИХЧ, оценки эффективности их работы в модельной системе мыши, моделирующей наследственные заболевания человека, такие как гемофилия и дисферлинопатия.


Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы:


Разработка тканезаместительной геннотерапевтической модели на основе альфоидных искусственных хромосом человека (альфоидные-ИХЧ или alphoid-HAC) и плюрипотентных стволовых клеток (иПСК или iPSCs) для лечения моногенных наследственных заболеваний, таких как гемофилия и дисферлинопатия, имеет первостепенное значение для внедрения и использования таких видов векторов в тканезаместительной генотерапии. Исследования в области искусственных хромосом имеют также важное значение для понимания работы хромосомных единиц. Разработка и усовершенствование новых ММСТ методов переноса альфоидных-ИХЧ в клетки млекопитающих, а также альтернативных методов переноса хромосом являются приоритетными и актуальными в данной области. Ограниченное количество лабораторий в мире владеет техникой создания терапевтических альфоидных-ИХЧ и методами переноса и манипуляции искусственными хромосомами. Несколько лабораторий разработали собственные альфоидные ИХЧ и исследуют возможность их использования в генотерапевтических целях и для создания трансгенных животных. В том числе были разработаны генотерапевтические модели лечения гемофилии у мышей с помощью ИХЧ. В свою очередь, используемый нами вид ИХЧ, имеющих в своих центромерных областях встроенные tetO-связывающие сайты (это позволяет обеспечить индуцируемую потерю ИХЧ), не был детально охарактеризован на предмет их использования в генотерапевтических целях.



Научная новизна поставленной задачи: 

 

Проект направлен на создание модели тканезаместительной генотерапии наследственных заболеваний человека (гемофилии и дисферлинопатии) на основе неинтегрирующихсяальфоидных ИХЧ векторов. В данной работе альфоидные ИХЧ будут охарактеризованыв свете их применения в качестве генотерапевтических векторов. Успешная реализация данного проекта позволит перейти к следующей стадии, а именно, к доклиническим моделям с использованием клеток человека или дальнейшей модификации данных векторов в направлении улучшения их основных характеристик. Реализация данного проекта внесет значительный вклад в понимание функционирования новых альфоидных ИХЧ как векторов доставки терапевтических трансгенов и будет являться новейшей разработкой в данной области. 

 


Современное состояние исследований по данной проблеме:

 

Существует два типа искусственных хромосом. Первый тип – это ИХЧ (по сути, минихромосомы), созданные на основе предельного укорачивания хромосом или “top-down”-подходом [Oshimura and Katoh 2008, Hoshiya et al. 2009]. Второй тип – это de novo синтезированные с помощью “bottom-up”-подхода альфоидные ИХЧ, содержащие искусственные центромеры и теломеры. Наиболее охарактеризованными и удобными в использовании “bottom-up”-ИХЧ, являются циклические альфоидные ИХЧ. Данные альфоидные ИХЧ были разработаны в лаборатории В.Н. Ларионова [Kouprina et al. 2012, Kouprina et al. 2013]. Целью наших исследований является использование данных альфоидных-ИХЧ как генотерапевтических векторов для разработки моделей лечения моногенных генетических заболеваний человека, таких как гемофилия и дисферлинопатия. Данные альфоидные ИХЧ не были ранее использованы для создания моделей тканезаместительной терапии наследственных заболеваний. В связи с этим первостепенной задачей является оценка их пригодности для генотерапевтических исследований и определение возможных путей их усовершенствования.

Терапевтическая модель на основе ИХЧ для лечения гемофилии-А была разработана группой Ошимуры [Kurosaki et al. 2011, Yakura et al. 2013]. Авторы использовали минихромосомный ИХЧ вектор 21HAC2 [Kazuki et al, 2011], содержащий кДНК FVIII, под контролем CAG- промотора. Данная конструкция стабильно поддерживалась и экспрессировала FVIII трансгена в клетках человека [Kurosaki et al. 2011]. В другом исследовании было показано, что полученные из FVIIIY/-иПСК мегакариоциты/ тромбоциты, несущие кДНК FVIII под регуляцией PF4 промотора, показали достаточный уровень секретируемого FVIII в культуральной среде [Yakura et al. 2013, Uno et al. 2014]. Важно отметить, что в данных моделях использовался наиболее охарактеризованные минихромосомы. В наших исследованиях мы используем новый тип альфоидных хромосом, содержащие tetO последовательности.  Многочисленные исследования показали, что полученные de novo альфоидные HACs с различными трансгенами были перенесены в целевые клетки и эффективно экспрессировали функционально активные трансгены в различных клеточных линиях человека и мыши. Данные ИХЧ были успешно использованы для получения трансгенных мышей [Mejia et al. 2001, Ikeno et al. 2002, Voet et al. 2003]. Было показано успешное лечении мутантных по гену альбумина крыс посредством трансплантации иммортализованных гепатоцитов, несущих de novo синтезированные HAC с кДНК альбумина дикого типа [Ito et al. 2009].

 

Список используемых источников:


M. Oshimura, M. Katoh, Transfer of human artificial chromosome vectors into stem cells, Reproductive biomedicine online 16 (2008) 57-69.


H. Hoshiya, Y. Kazuki, S. Abe, M. Takiguchi, N. Kajitani, Y. Watanabe, T. Yoshino, Y. Shirayoshi, K. Higaki, G. Messina, G. Cossu, M. Oshimura, A highly stable and nonintegrated human artificial chromosome (HAC) containing the 2.4 Mb entire human dystrophin gene, Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 17 (2009) 309-317.

N. Kouprina, A. Samoshkin, I. Erliandri, M. Nakano, H.S. Lee, H. Fu, Y. Iida, M. Aladjem, M. Oshimura, H. Masumoto, W.C. Earnshaw, V. Larionov, Organization of synthetic alphoid DNA array in human artificial chromosome (HAC) with a conditional centromere, ACS synthetic biology 1 (2012) 590-601

N. Kouprina, W.C. Earnshaw, H. Masumoto, V. Larionov, A new generation of human artificial chromosomes for functional genomics and gene therapy, Cellular and molecular life sciences : CMLS 70 (2013) 1135-1148.

H. Kurosaki, M. Hiratsuka, N. Imaoka, Y. Iida, N. Uno, Y. Kazuki, C. Ishihara, Y. Yakura, J. Mimuro, Y. Sakata, H. Takeya, M. Oshimura, Integration-free and stable expression of FVIII using a human artificial chromosome, Journal of human genetics 56 (2011) 727-733.

Y. Yakura, C. Ishihara, H. Kurosaki, Y. Kazuki, N. Komatsu, Y. Okada, T. Doi, H. Takeya, M. Oshimura, An induced pluripotent stem cell-mediated and integration-free factor VIII expression system, Biochemical and biophysical research communications 431 (2013) 336-341.

Y. Kazuki, H. Hoshiya, M. Takiguchi, S. Abe, Y. Iida, M. Osaki, M. Katoh, M. Hiratsuka, Y. Shirayoshi, K. Hiramatsu, E. Ueno, N. Kajitani, T. Yoshino, K. Kazuki, C. Ishihara, S. Takehara, S. Tsuji, F. Ejima, A. Toyoda, Y. Sakaki, V. Larionov, N. Kouprina, M. Oshimura, Refined human artificial chromosome vectors for gene therapy and animal transgenesis, Gene therapy 18 (2011) 384-393.

N. Uno, Y. Kazuki, M. Oshimura, Toward Gene and Cell Therapies Employing Human Artificial Chromosomes in Conjunction with Stem Cells, Cloning & Transgenesis 3 (2014) 8.
J.E. Mejia, A. Willmott, E. Levy, W.C. Earnshaw, Z. Larin, Functional complementation of a genetic deficiency with human artificial chromosomes, American journal of human genetics 69 (2001) 315-326.

M. Ikeno, H. Inagaki, K. Nagata, M. Morita, H. Ichinose, T. Okazaki, Generation of human artificial chromosomes expressing naturally controlled guanosine triphosphate cyclohydrolase I gene, Genes Cells 7 (2002) 1021-1032.

T. Voet, E. Schoenmakers, S. Carpentier, C. Labaere, P. Marynen, Controlled transgene dosage and PAC-mediated transgenesis in mice using a chromosomal vector, Genomics 82 (2003) 596-605.

M. Ito, M. Ikeno, H. Nagata, T. Yamamoto, A. Hiroguchi, I.J. Fox, S. Miyakawa, Treatment of nonalbumin rats by transplantation of immortalized hepatocytes using artificial human chromosome, Transplantation proceedings 41 (2009) 422-424.


Предлагаемые методы и подходы:

 

В работе будут использованы методы молекулярной биологии: амплификация ДНК с помощью ПЦР, очистка и клонирование кДНК в том числе с помощью системы Cre/loxрекомбинации, FISH-анализ хромосом, иммуноблоттинг и ОТ-ПЦР, метод сборки лентивирусных частиц. Будут использованы методы культивирования иПСК мыши и человека, манипуляции с СНО клетками, получение иПСК мыши и человека, культивирование первичных клеточных культур мыши и человека, методы переноса ИХЧ – метод ММСТ и его различные модификации. 



Общий план работы на весь срок выполнения проекта:

 

1) Будут получены конструкты на основе альфоидных-ИХЧ, несущие следующие трансгены: кДНК фактора FVIII и кДНК дисферлина человека под контролем промотора EF1-alpha. Клонированные последовательности кДНК FVIII и дисферлина будут “загружены” с помощью Cre/loxсистемы в альфоидные-ИХЧ в клетках СНО.

 

2) Из фибробластов мышей мутантных по гену фактора FVIII будут получены иПСК мыши, подтверждена их плюрипотентность. Будут подготовлены лентивирусы, кодирующие полицистронную OKSM и rT-TAрепрограммирующие конструкции. Первичные дермальные фибробласты FVIII- и дисферлин-дефицитных мышей трансдуцированы этими лентивирусами для получения иПСК.

 

3) Будут отработаны методы ММСТ для переноса альфоидных-ИХЧ; эти методы будут затем использованы для переноса альфоидных ИХЧ, несущих трансгены, в иПСК мыши, мутантные по соответствующим генам.

 

4) Будет отработан метод получения иПСК человека и получены линии иПСК из периферических мононуклеаров крови больных гемофилией.

 

5) Будут опробованы новые методы переноса ИХЧ в целевые клетки.

 

6) Будут проведены эксперименты, подтверждающие эффективную экспрессию трансгенов в целевых иПСК и дифференцированных клетках, несущих соответствующие ИХЧ конструкты, охарактеризована митотическая стабильность полученных ИХЧ конструктов. Будет показано, что в дифференцированных из полученных иПСК клеток, несущих ИХЧ конструкты, трансгены экспрессируются эффективно в целевых тканях.



Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту:

У коллектива имеется значительный научный задел по данному проекту. Проведен анализ альфоидных ИХЧ, оценена их митотической стабильности и экспрессия GFP-трансгена в различных клетках, включая клетки СНО, НТ1080, эмбриональные стволовые клетки мыши, иПСК человека и иПСК мыши. Отработаны и постоянно используются методики молекулярного клонирования и рекомбинации в системе Cre/lox, FISH-анализ ИХЧ, иммуноблоттинг и т.д.

Отработаны и постоянно используются 2 варианта ММСТ метода – стандартный ММСТ и ретро-ММСТ. Собраны и требуют дальнейшего анализа ИХЧ конструкции, содержащие кДНК FVIII. Получены иПСК человека из мезенхимальных стволовых клеток эндометрия с помощью лентивиральной индуцируемой полицистронной системы rT-TA/OKSM. Осуществлен перенос альфоидных-ИХЧ-GFP в иПСК человека и показано, что данные ИХЧ поддерживаются как независимые хромосомные единицы при этом, не нарушая плюрипотентного состояния данных клеток. Также был проведен перенос альфоидных-ИХЧ-GFPв эмбриональные стволовые клетки мыши. Было показано, что данные ИХЧ не нарушают плюрипотентные свойства иПСК мыши. иПСК, несущие альфоидные-ИХЧ-GFP, дифференцируются во множество различных клеток в составе химерных мышей in vivo. Также были отработаны протоколы дифференциации иПСК мыши в различные терминально-дифференцированные клетки ex vivo.



Детальный план работы на первый год выполнения проекта:

 

1) Получить конструкты на основе альфоидных-ИХЧ, несущие следующие трансгены: кДНК фактора FVIII и кДНК дисферлина человека экспрессия которых регулируется промоторам EF1-alpha. Клонированные последовательности кДНК FVIII и дисферлина будут перенесены с помощью Cre/loxсистемы в альфоидные ИХЧ в клетках СНО. Полученные клоны клеток СНО с альфоидными ИХЧ будут охарактеризованы с помощью FISH-анализа и иммуноблоттинга. Будут отобраны клоны СНО клеток, имеющие не интегрированные эписомные альфоидные ИХЧ и стабильно экспрессирующие трансгены.

 

2) Получить индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) мыши из фибробластов мышей мутантных по гену фактора FVIII, подтвердить их плюрипотентность. Будут приготовлены лентивирусы кодирующие полицистронную OKSM и rT-TA репрограммирующие конструкции и трансдуцированы ими первичные дермальные фибробласты FVIII-мутантных мышей.

 

3) Будет отработан метод ММСТ для переноса альфоидных-ИХЧ в иПСК мыши, мутантные по соответствующим генам. Метод переноса ИХЧ на основе ММСТ будет адаптирован к данным видам ИХЧ. Панируется использовать новые модифицированные методы ММСТ для переноса ИХЧ в целевые клетки.

 

4) Провести подготовительные работы, направленные на получения иПСК человека. Привести анализ литературы и отобрать наиболее эффективные и недорогие протоколы получения иПСК человека с помощью неинтегрирующихся вирусных векторов, несущих репрограммирующие факторы.

 

Все необходимые генетические конструкции и клеточные линии имеются в наличие в лаборатории.

 

Короткий заголовокGZ-2020
АкронимМ1_2020 - 1
СтатусАктивный
Действительная дата начала/окончания22/06/2031/12/20

Ключевые слова

  • Искусственные хромосомы человека (ИХЧ)
  • альфоидные-ИХЧ
  • гемофилия
  • фактор свертывания крови VIII
  • индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК)
  • опосредованный микроклетками перенос хромосом (MMCT)
  • рерограммирование клеток
  • дисферлин
  • дисферлинопатия
  • генотерапевтические векторы
  • генотерапия