Лаборатория нейробиологии и молекулярной фармакологии: 2021 г. этап 3

Проект: исполнение гранта/договораисполнение гранта/договора в целом

Сведения о проекте

описание

Деятельность лаборатории направлена на исследование нейрохимических основ поведения и заболеваний человека и разработку новых фармакологических средств для терапии психических заболеваний.
Основные направления работы лаборатории:
1.Исследование функций рецепторов следовых аминов TAAR.
Это направление работы лаборатории ориентировано на понимание роли следовых аминов (trace amines, TA) и рецепторов к ним у млекопитающих, их вклада в физиологию и патологию, а также возможность использования рецепторов TAAR в качестве мишеней для фармакологического лечения различных заболеваний у человека. Хотя некоторые молекулы ТА, такие как тирамин и октопамин, являются одними из ключевых нейромедиаторов у беспозвоночных, их функциональная роль у млекопитающих остается до конца не изученной. В целом, ТА присутствуют в ЦНС и функционируют параллельно с моноаминергическими путями. ТА структурно связаны, колокализуются и выделяются вместе с биогенными аминами и нейротрансмиттерами . Считается, что ТА обладают нейромодуляторными функциями классических нейротрансмиттеров, таких как дофамин, серотонин и норадреналин, на уровень которых влияют все антидепрессанты и антипсихотические препараты, в настоящее время использующиеся в клинической практике. Дисфункции в физиологии ТА уже давно ассоциируется с шизофренией и расстройствами настроения. Показано, что повышение уровня PEA в моче, изменения в метаболизме триптамина и р-тирамина, и изменения в ферментах, участвующих в синтезе и катаболических путях данных аминов связано с шизофренией. Для объяснения причин развития депрессии четыре десятилетия назад была разработана PEA гипотеза, утверждающая, что дефицит PEA связан с эндогенной депрессией: пилотные исследования показали, что применение этого амина или его предшественника снижают симптомы депрессии. Таким образом, считается, что идентификация ТА рецепторов может привести к разработке лекарств, действие которых направленно на эту новую нейромодуляторную систему. В ЦНС мышей мРНК рецептора TAAR1 обнаружена по всей лимбической системе и в областях, содержащих моноаминергические клеточные тела, и в их проекциях, таких как миндалевидное тело, голубое пятно, черная субстанция, вентральная область покрышки, ядра шва, полосатое тело и базальные ядра (Borowsky et al. 2001; Bunzow et al. 2001). Таким образом, TAAR1 может модулировать двигательную, эмоциональную активность и мотивацию поведения, которые традиционно ассоциируются с моноаминергическими системами. Существуют 19 (2 псевдогена) и 16 (1 псевдоген) видов генов TAAR в геномах крысы и мыши соответственно, но всего лишь 9 генов в геноме человека (3 псевдогена, TAAR3 , TAAR4 и TAAR7) и шимпанзе (6 псевдогенов) (Lindemann & Hoener 2005). Последние исследования показали наличие рецепторов TAAR2-TAAR9 в клетках обонятельного эпителия, что позволяет считать их новым классом обонятельных рецепторов. Кроме того, существуют свидетельства того, что данные рецепторы также экспрессируются в головном мозге. Недавно проведенное исследование экспрессии мРНК при помощи метода ПЦР в реальном времени рецепторов TAAR2-TAAR9 у человека показало экспрессию данных рецепторов в префронтальной коре головного мозга человека. Более того, у TAAR5-KO мышей экспрессия гена-репортера, кодирующего бета-галактозидазу (LacZ) под контролем эндогенного промотера, наблюдалась в определенных зонах головного мозга, включая фронтальную кору. Однако о функциях TAAR2-TAAR9 рецепторов имеется крайне мало информации и их исследование может быть перспективным для понимания механизмов и поиска новых мишеней для терапии заболеваний. Для исследования функций TAAR рецепторов мы используем трансгенных животных, у которых отсутствует один из TAAR рецепторов. В настоящий момент в нашей лаборатории самая большая в мире коллекция TAAR нокаутных животных. У нас в лаборатории поддерживаются колонии животных, нокаутных по TAAR1, TAAR2, TAAR5, TAAR6, TAAR8(а,в,с) и TAAR9 – всех функциональных рецепторов человека. Отдельное направление работы в лаборатории – поиск новых препаратов, которые будут лигандами TAAR рецепторов. Изучение способности различных соединений взаимодействовать с рецепторами, сцепленными с белком G (GPCR), в частности, изучаемого нами семейства TAAR, основано на активации Gαs-зависимых сигнальных путей, выражающемся как в повышении внутриклеточной концентрации вторичного мессенджера – циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), так и в увеличении внутриклеточной концентрации ионов кальция (Ca2+).Для подобных оценок in vitro хорошо зарекомендовало себя использование генетических репортёрных систем, экспрессированных в живых культивируемых клетках. Репортёрная система меняет интенсивность своего сигнала (люминесцентного или флуоресцентного) в ответ на какое-либо изменение внутриклеточной сигнализации, что позволяет быстро оценить активирующий или ингибирующий потенциал интересующей молекулы в отношении определённого рецептора.Для оценки изменений концентрации внутриклеточной цАМФ применяется метод BRET (bioluminescence resonance energy transfer – резонансный перенос энергии биолюминесценции). В его основе лежит способность химерного белка Rluc-EPAC-YFP изменять свою конформацию при связывании с цАМФ. В результате молекула-донор энергии (люцифераза кораллового полипа R. reniformis – Rluc) и молекула-акцептор (жёлтый флуоресцентный белок – YFP), обычно расположенные близко друг к другу в неактивированном состоянии EPAC (exchange protein activated by cAMP), значительно отдаляются, что приводит к снижению резонансного неизлучательного переноса энергии от донора к акцептору. В итоге изменяется соотношении интенсивности люминесценции акцептора (525 нм) и интенсивности люминесценции донора (480 нм), или так называемое соотношение BRET. Таким образом, при активации Gαs-сигнального пути, возникающего при активации изучаемого рецептора каким-либо лигандом, будет наблюдаться снижение соотношения BRET. Следовательно, чем сильнее будет снижение данного соотношения от исходного уровня, тем более сильным агонистом будет считаться химическое соединение. И наоборот, отмена исследуемым веществом действия известного агониста будет свидетельствовать об антагонистических свойствах.

2.Исследование функций дофамина на модели DAT-нокаутных животных.
Нейротрансмиттер дофамин (DA) вовлечён в широкий спектр жизненно важных функций, таких как двигательная активность, пищевое поведение, эмоции, внимание и подкрепление (Carlsson 1987, Greengard 2001, Gainetdinov 2008). Болезнь Паркинсона (БП) – тяжелое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся гибелью дофаминовых нейронов. При БП происходит нарушение двигательного контроля, тремор, акинезия. Увеличение средней продолжительности жизни в популяции приводит к более широкому распространением паркинсонизма среди возрастного населения, что делает исследование данного заболевания и поиск новых способов терапии особенно актуальным. В данном проекте лишенные дофамина крысы представляют модель поздней стадии БП. Уникальность представленной модели состоит в том, что моделировать состояние критически низкого содержания дофамина, например, нокаутом определенных генов, затруднительно, поскольку такие нарушения несовместимы с жизнью. Ранее, на мышах, нокаутных по гену дофаминового транспортера (DAT) было показано что ингибирование тирозингироксилазы, ключевого фермента в биосинтезе дофамина с использованием селективного ингибитора альфа-метил-пара-тирозина приводит к акинезии и ригидности. Поскольку у данных мышей отсутствует механизм обратного захвата дофамина, весь дофамин является новосинтезированным. Ингибирование синтеза дофамина приводит к полному его отсутствию у DAT-нокаутных животных, тогда как у нормальных животных происходит только частичное снижение без ярких моторных нарушений. В данном проекте мы планируем разработать аналогичную модель на крысах (Дофамин-Дефицитные DAT нокаутные крысы, DDD крысы) которые имеют ряд преимуществ в экспериментальных протоколах по сравнению с мышами. Отсутствие дофамина может позволить оценить не-дофаминовые механизмы регуляции движения, а также оценить действие потенциальных антипаркинсонических препаратов. Воздействие на не дофаминергические системы может быть эффективно при болезни Паркинсона, особенно на поздних стадиях, однако до сих пор неясно, будут ли они только усиливать действие остаточного дофамина или действовать через другие системы. Кроме того, на этой модели мы проводим оценку электрофизиологические корреляты отсутствия дофамина. В другом проекте, используя поведенческие и электрофизиологические подходы мы проводим исследования роли повышенного уровня дофамина в когнитивных нарушениях DAT нокаутных животных.

3.Исследование функций серотонина на модели THP2-нокаутных животных.
Фермент триптофан гидроксилаза-2 (THP-2) является ключевым в синтезе нейронального серотонина, который играет роль во многих основных процессах высшей нервной деятельности организма, таких как обучение и познавательная деятельность, половое, агрессивное поведение, депрессия. Кроме того, дисрегуляция в серотонинергической системе, по данным литературы приводит к общей компенсаторной дисрегуляции в других системах (дофаминергическая, ГАМК и т.д.), однако данные процессы не достаточно исследованы. В исследованиях на мышах показана, высокая агрессивность и импульсивность TPH2 нокаутов. Таким образом, данная модель может так же использоваться для моделирования нейропсихических заболеваний при которых у пациентов наблюдается сниженный контроль эмоций, таких как: дефицит внимания и гиперактивность, обсессивно-компульсивный синдром, немотивируемая агрессия и асоциальное поведение. Крысы, обладая более разнообразным поведенческим репертуаром, чем мыши могут дать исследователю больше данных для изучения, поэтому мы используем модель TPH-2 нокаутных крыс, которые к настоящему времени мало изучены, для исследования функций серотониновой системы.

4. Создание нокаутных животных.
Для разработки новых пород мутантных животных сегодня предпочтительным методом является CRISPR-Cas технология (Yang et al., 2014). Открытие CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – Сas9 (CRISPR-associated nuclease 9) системы редакции генома можно отнести к революционному прорыву в биотехнологии 21 века. Этот способ получения нокаутных животных вытеснил все существующие, включая традиционный, введение модифицированных эмбриональных стволовых клеток в бластоцисту. Благодаря своему быстрому и точному исполнению CRISPR/CAS9 система позволяет получить нокаутное животное уже в первом поколении. В основе метода лежит внесение двухцепочечного разрыва в ДНК гена, которые необходимо выключить, с последующей репарацией в режиме SOS. Создание трансгенных животных включает в себя следующие этапы:А) Получение sgРНК конструкций для генов интереса. В) Подготовка мышей-доноров и реципиентов. В качестве доноров яйцеклеток была выбрана линия инбредная линия С57Bl6. Самки С57Bl6 дают меньше потомства, поэтому для гарантированного получения оплодотворенных клеток подвергаются дополнительной гормональной стимуляции. Для оплодотворения самок доноров используются самцов этой же линии. Вымывание яйцеклеток из самок доноров производятся на стадии пронуклеусов, через 11-12 часов после спаривания с самцами. Освобожденные яйцеклетки несколько раз промываются в свежих каплях среды М2. С) Микроинъекции в зиготу полученных CRISPR/CAS9 для гена интереса. Микроинъекции заготовленных конструкций проводятся на микроскопе Nicon с оптической системой Nikon Advanced Modulation Contrast (NAMC) с помощью микроманипулятора TransferMan 4R, Eppendorf и микроинъектора Femtojet Eppendorf. Отмытые яйцеклетки помещаются в каплю культуральной среды М2, порытую сверху слоем минерального масла, чтобы избежать испарения. Полученные РНК конструкции геновов интереса sgРНК +CAS9 мРНК вводятся в концентрации 40 нг/мкл и 20 нг/мкл соответственноD) Трансплантация яйцеклеток в яйцевод суррогатной матери. В качестве реципиентов, которые будут использованы в качестве суррогатных матерей, была выбрана аутбредная линия CD1. Для получения псевдобеременной самки, чтобы введенные эмбрионы прижились, их предварительно ссаживают со стерильными вазэктомированными самцами. В цитоплазму оплодотворенных яйцеклеткок вводятся полученные выше CRISPR/CAS9 РНК-конструкции для гена гена интереса. Выжившие яйцеклетки, трансплантируют в яйцевод суррогатной матери спустя 1 часа после микроинъекции. E) После рождения потомства у них отбираются образцы кожи, из которых извлекается ДНК и проводится секвенирование. Результаты секвенирования позволяют увидеть произошла ли мутация в гене интереса. Особи с мутациями, которые привели к сдвигу рамки считывания, отбираются для дальнейшего размножения. F) Поскольку при использовании CRISPR/CAS9 технологии есть шанс возникновения случайных мутаций в нецелевых сайтах, после получения трансгенного животного, нужно провести 5-6 раундов обратного скрещивания для получения чистой, лишенной случайных мутаций, линии.

5. Изучение генетических основ психических заболеваний в российской популяции для повышения эффективности их профилактики и лечения.
На базе Биобанка и нашей лаборатории в СПбГУ был организован Российский национальный консорциум по психиатрической генетике www: RNCPG.ORG (основан в ноябре 2017 г.). Сбор образцов больных шизофренией, алкоголизмом и депрессией проводится нашими партнёрами и генетический анализ проводится нами по международным стандартам для вхождения в Psychiatric Genomic Consortium (PGC) который организовывает совместный анализ десятков тысяч пациентов со всего мира. Также нами проводится независимый анализ российских образцов.
Короткий заголовокGZ-2021
АкронимITBM_2019 - 3
СтатусАктивный
Действительная дата начала/окончания1/01/2131/12/21

Ключевые слова

  • Фармакология
  • Нейробиология
  • Шизофрения
  • Трансляционная медицина
  • Болезнь Паркинсона
  • Депрессия
  • Наркомания
  • Диабет
  • Ожирение
  • Трансгенные модели животных
  • Следовые амины
  • Монамины
  • GPCR Рецепторы